一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法与流程

1.本发明涉及dna重组技术领域，具体涉及一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法。


背景技术：

2.转化就是把外源的dna分子引入受体细菌，让它获得新的遗传性状的一种现代分子生物学的操作技术。转化效率(阳性率)的高低可以直接影响后续试验的进展跟工作效率，而感受态细胞状态的好坏则是影响转化效率最直接、最关键的因素之一。
3.目前常用的感受态细胞制备方法有cacl2和rbcl/kcl法。rbcl/kcl法的感受态细胞转化效率较高，但是需要特殊试剂rbcl，而rbcl不仅制备复杂，且铷是一种轻金属元素，其活泼的化学性质遇水就能产生剧烈反应，使用成本高；再者，rbcl具有一定的毒性，使得rbcl/kcl法具有安全隐患。而cacl2法虽然简单方便，但其所得感受态细胞的转化效率比较低，约《5
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106cfu/μl，其只能应对一般的克隆实验(约为5kb的连接产物)，但是其易受实验误差影响，无法满足更长片段外源dna(如基因库)的需求，甚至无法获得任何菌落，从而显著降低后续实验(如克隆)的成功率。除了上面的两种方法以外，还有制备超级感受态细胞的inoue法跟电穿孔法，inoue法不同阶段培养细菌的温度条件差异较大(从10～37℃来回切换)，实验要求高、流程复杂，增加实验成本。电穿孔法则需要实验室拥有电穿孔仪，其进一步增加实验的设备成本。
4.综上，研究一种操作方便、重复性好、转化效率高而且适用于普通实验室的感受态细胞的制备方法，不仅有效弥补现有感受态细胞制备方法的不足，还对于分子生物学的研究有着很重要的作用，对分子克隆实验也有着重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明意在提供一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，以解决现有常规cacl2法制备感受态细胞时，转化效率较低从而影响后续实验成功率的技术问题。
6.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括如下步骤：
7.s1、活化菌株：取菌株分区划线接种在lb平板上，倒置培养12～16小时，获得菌落；挑取单一菌落接种在lb液体培养基中，摇床生长获得菌液，取菌液转种于新鲜lb液体培养液中继续生长至菌液od600值为0.4～0.6；
8.s2、制备感受态细胞：将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴后离心；倒掉上清液，把下层细菌沉淀以冷藏的创新溶液重新悬浮，冰浴后离心；倒掉上清液，将细菌沉淀重新悬浮于冷藏的创新溶液中，冰浴后离心；倒掉上清液，加入冷藏的创新溶液重悬沉淀，获得感受态细胞液；
9.所述创新溶液中包括钙离子、锌离子与山梨醇。
10.本方案的原理及优点是：本方案组合使用二价离子(钙离子和锌离子)制备感受态细胞，有效提升细胞膜的通透率，从而提升制备所得大肠杆菌感受态细胞的转化效率。具体
的，钙离子能与细胞膜相结合，使得细胞膜通透性增加，从而使得大肠杆菌细胞膨胀成球形，便于接受外源dna；而锌离子具有较强的催化作用，可加速钙离子与细胞膜表面的结合，促进大肠杆菌细胞快速膨胀，提升感受态细胞制备效率。然而，在钙离子和锌离子的协同增效作用下，大肠杆菌活化效率过快，易导致大肠杆菌大量死亡而影响制备所得感受态细胞的转化效率。因此，本方案通过向创新溶液中添加山梨醇，有效缓冲锌离子过快的催化效率带来的转化效率降低，从而有效提升制备所得感受态细胞的转化效率。
11.另，本方案制备感受态细胞前，先活化大肠杆菌受试菌种并摇菌至菌液od600值为0.4～0.6，而当菌液od600值为0.4～0.6时大肠杆菌刚进入对数期，此时的大肠杆菌菌体状态稳定、生长活性强，便于在创新溶液处理后形成活性高、状态稳定感受态细胞，从而提升其转化效率。
12.本方案中方法操作简单，转化效率高，不但能满足一般的分子实验要求，还能够满足文库的构建等复杂实验对转化效率的要求，是一项极为实用的新技术，具有非常高的应用价值。
13.优选的，在s2中，所述创新溶液的制备步骤如下：0.1mol/l氯化钙、0.1mol/l氯化锌、1mol/l山梨醇以3:1:1的体积比混合，121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min。
14.有益效果：本方案通过上述方案配置所得创新溶液，能有效提升大肠杆菌感受态细胞的转化效率。发明人通过长期实验发现，采用本方案制备所得创新溶液处理大肠杆菌细胞，能快速获得高转化效率(转化效率为1.03～1.25
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109cfu/ug)的感受态细胞，有效满足更高的转化效率要求。发明人通过长期实验发现，氯化钙浓度的增高到一定阈值转化效率便不会继续提高，此配比氯化钙的浓度(氯化钙、氯化锌与山梨醇的体积比为3:1:1)能使细胞膜充分膨胀，细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，使细胞的通透性变大，便于外源基因或载体进入感受态细胞，但是当氯化钙浓度超过此阈值时(钙离子过多)不仅不会提高转化效率反而会起到抑制的作用，降低制备所得感受态细胞的转化效率。当氯化锌溶液浓度降低或用量减少(锌离子浓度过低)，则会降低其对氯化钙的催化辅助作用，导致转化效率降低，但是当锌离子浓度过高时会导致胞体裂解从而影响后续转化的效率。而山梨醇主要是起到缓冲的作用以及在后续保存时有明显的稳定和延长保存期限的作用，能够有效降低细胞冰点，减少冰晶的形成，降低低温对细胞的损害；过高的山梨醇用量或山梨醇浓度过高不会对转化过程起到帮助，但是山梨醇浓度过低则会导致缓冲作用下降继而影响后续的转化，以及明显缩短感受态细胞的保存时间。
15.优选的，还包括s3、感受态细胞的保存，向感受态细胞液中加8～15％的甘油，先置于-20℃冰箱冷冻保存，再置于-80℃冰箱冷冻保存。
16.有益效果：本方案中甘油和山梨醇共同作用，有效提升感受态细胞的保存时间及保存效果，发明人实验发现，本方案制备所得感受态细胞，在添加15％甘油保存1年甚至2年后，其转化效率仍然保持较高水平(具体为保存1年后转化效率8.9～9.8
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108cfu/ug；而保存2年后的转化效率为2.1～2.9
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107cfu/ug，仍然高于对比例1中仅采用钙离子制备所得感受态细胞的转化效率)，有效满足各种转化实验的要求。
17.优选的，所述感受态细胞的转化效率为1.03～1.25
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109cfu/ug。
18.有益效果：对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。本方案制备所得感受态细胞的转化效率较高，不
仅能适应较长片段的外源dna的转化需求，还能够满足文库的构建(如基因库)等复杂实验对转化效率的要求，是一项极为实用的新技术，具有非常高的应用价值。
附图说明
19.图1为本发明实施例1制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
20.图2为本发明实施例2制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
21.图3为本发明实施例3制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
22.图4为本发明对比例1制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
23.图5为本发明对比例2制备所得感受态细胞转化所得平板菌落图。
具体实施方式
24.下面通过具体实施方式进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
25.实施例1
26.本方案提供一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
27.s1、活化菌株：取大肠杆菌受试菌株分区划线接种在lb平板上，在37℃条件下倒置培养12～16小时，获得分散菌落的平板；挑取单一菌落接种在5ml的lb液体培养基中，在37℃、250rpm的摇床中培养获得菌液，取2ml菌液转种于新鲜lb液体培养液中继续摇床培养至菌液od600值为0.4～0.6。
28.s2、制备感受态细胞：将s1所得菌液分装于冰冻的离心管中冰浴5min后，在4℃、4500rpm的条件下离心10min；倒掉上清液，把下层细菌沉淀以冷藏的创新溶液重新悬浮，冰浴10min后在4℃、4500rpm条件下离心10min；倒掉上清液，将细菌沉淀重新悬浮于冷藏的创新溶液中，冰浴10min后在4℃、4500rpm条件下离心10min；倒掉上清液，加入100μl冷藏的创新溶液重悬沉淀，获得感受态细胞液；
29.s3、感受态细胞的保存，向感受态细胞液中加8～15％的甘油(本实施例具体添加15％甘油)，先置于-20℃冰箱冷冻保存4～5h，再置于-80℃冰箱冷冻保存。
30.其中，本方案所用受试菌株为大肠杆菌bl21(de3)菌株，由申请人自保存。
31.制备lb液体培养基包括如下步骤：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl 10g/l，蒸馏水定容1000ml，调节ph至7.2，121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min，常温备用。
32.创新溶液的制备步骤如下：将0.1mol/l的氯化钙溶液、0.1mol氯化锌溶液1mol、山梨醇按照3:1:1的体积比配制为混合溶液，将混合溶液置于121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min，随后将创新溶液置于-20℃冰箱在内冷冻2-4h，获得冷藏的创新溶液，备用。
33.实施例2
34.本实施例基本与实施例1相同，区别在于：受试菌株为大肠杆菌jm109菌株，由申请人自保存；保存感受态添加8％甘油。
35.实施例3
36.本实施例基本与实施例1相同，区别在于：受试菌株为大肠杆菌top10菌株，由申请人自保存；保存感受态添加11％甘油。
37.对比例1
38.本实施例基本与实施例1相同，区别在于：创新溶液仅包含0.2mol/l的氯化钙溶液。
39.对比例2
40.本实施例基本与实施例1相同，区别在于：创新溶液缺少山梨醇，创新溶液包含0.1mol/l的氯化钙溶液和0.1mol/l氯化锌溶液。
41.实验例1：感受态细胞转化效率的测定
42.【材料】载体pet28a购自赛默飞世尔科技公司。
43.【实验方法】吸取1μl pet28a质粒dna加入100μl实施例1～3、对比例1～2制备所得感受态细胞中；轻轻的混合过后，冰浴10min；42℃水浴锅，热休克90sec，然后迅速地将其放置在冰上冷却5min；再加入900μl lb液体培养基，37℃振荡培养45min(转速180rpm)，让宿主菌复苏并且表达抗性蛋白。取100μl培养所得菌液，稀释1000倍后取100μl涂布在相应的lb固体培养基(为lb液体培养基加琼脂制备而成)。于37℃倒置培养12～16h，等长出菌落后，进行菌落记数，计算转化效率，重复3次，计算平均值。实施例1～实施例3、对比例1～2所得感受态细胞的转化效率结果详见表1。
44.表1实施例1～3、对比例1～2所得感受态细胞的转化效率
45.实施例转化效率/cfu/ug实施例11.25
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109实施例21.08
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109实施例31.03
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109对比例18.2
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106对比例22.2
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10846.实验数据表明，本方案以不同受试菌种制备感受态细胞，其所得感受态细胞的转化效率均达到109级，有效适应长片段甚至是基因库的转化需求。具体的，实施例1～3中感受态细胞的转化效率稳定提升至1.03～1.25
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109。
47.另外，本方案组合使用二价离子(钙离子和锌离子)制备感受态细胞，有效提升细胞膜的通透率，从而提升制备所得大肠杆菌感受态细胞的转化效率。具体的，对比例1中至采用氯化钙溶液作为创新溶液时，制备所得感受态细胞的转化效率仅为8.2
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106而言，实施例1-3、对比例2中组合应用钙离子和锌离子，锌离子促进钙离子和细胞膜的结合，能有效提升制备所得感受态细胞的转化效率。然而相比于对比例2中因缺少山梨醇的缓冲作用，制备所得感受态细胞易死亡而失效，导致其转化效率明显降低(对比例2中感受态细胞的转化效率仅为2.2
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108，实施例1～3中感受态细胞的转化效率稳定提升至1.03～1.25
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109)，从而有效提升以感受态细胞完成也难怪的后续克隆实验的成功率。本方案制备所得感受太细胞的转化效率较高，尤其适用于片段长度较大(如大于30kb)的外源dna的转化，发明人研究发现，本方案制备所得感受态细胞还能够满足文库的构建等复杂实验对转化效率的要求，是一项极为实用的新技术，具有非常高的应用价值。
48.实验例2：不同保存时间后的感受态细胞的转化效率
49.将实施例1～3、对比例1～2所得感受态细胞分别保存3个月、6个月、1年、2年后，再取出用于感受态细胞转化效率的测定，每组感受态细胞的转化效率均为3次平均值，结果详
见表2。
50.表2实施例1～3、对比例1～2所得感受态细胞不同保存时间后的转化效率
[0051][0052]
实验数据表明，本方案采用8～15％甘油均能有效对感受态细胞进行保存，且甘油和创新溶液中的山梨醇组合后，能进一步提升感受态细胞的保存效果、延长保护时间。具体的，本方案实施例1～3中均采用甘油和山梨醇组合缓冲阳离子对感受态细胞的持续活化效果，使得其在保存1年后的转化效率变化不大，而在保存2年后依然具有较高的转化效率(保存2年后转化效率具体为2.1～2.9
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107cfu/ug)，依然适用于片段较短(如≤5kb)的外源dna的转化需求。
[0053]
而对比例1中单独采用钙离子处理所得感受态细胞，在采用甘油保存1年后，其转化效率降低明显(低至8.4
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104cfu/ug)，基本无法满足转化需求。而对比例2中，其只添加甘油作为缓冲保存溶剂，其无法缓冲两种阳离子在保存期间对感受态细胞的持续活化作用，使得保存1年后，对比例2感受态细胞的转化效率由2.2
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108cfu/ug降至2.5
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106cfu/ug，使用其进行转化实验时，转化阳性率非常低，无法满足转化需求。
[0054]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：s1、活化菌株：取菌株分区划线接种在lb平板上，倒置培养12～16小时，获得菌落；挑取单一菌落接种在lb液体培养基中，摇床生长获得菌液，取菌液转种于新鲜lb液体培养液中继续生长至菌液od600值为0.4～0.6；s2、制备感受态细胞：将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴后离心；倒掉上清液，把下层细菌沉淀以冷藏的创新溶液重新悬浮，冰浴后离心；倒掉上清液，将细菌沉淀重新悬浮于冷藏的创新溶液中，冰浴后离心；倒掉上清液，加入冷藏的创新溶液重悬沉淀，获得感受态细胞液；所述创新溶液中包括钙离子、锌离子与山梨醇。2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于：在s2中，所述创新溶液的制备步骤如下：0.1mol/l氯化钙、0.1mol/l氯化锌、1mol/l山梨醇以3:1:1的体积比混合，121℃高温高压蒸汽灭菌法灭菌20min。3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于：还包括s3、感受态细胞的保存，向感受态细胞液中加8～15％的甘油，先置于-20℃冰箱冷冻保存，再置于-80℃冰箱冷冻保存。4.根据权利要求3所述的一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于：所述感受态细胞的转化效率为1.03～1.25
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109cfu/ug。

技术总结
本发明涉及DNA重组技术领域，公开了一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，1.包括如下步骤：S1、活化菌株；S2、使用创新溶液反复重悬大肠杆菌细胞，制备获得感受态细胞；创新溶液中包括钙离子、锌离子与山梨醇。本方案组合使用钙离子和锌离子制备感受态细胞，锌离子具有较强的催化作用，可加速钙离子与细胞膜表面的结合，促进大肠杆菌细胞快速膨胀，提升感受态细胞制备效率；而山梨醇有效缓冲锌离子过快的催化效率带来的转化效率降低，从而有效提升制备所得感受态细胞的转化效率。本方案制备所得感受态细胞的转化效率达109CFU/ug数量级，有效满足文库构建等复杂实验对转化效率的要求，是一项极为实用的新技术，具有非常高的应用价值。值。


技术研发人员：秦民泽 潘小双 丁峰 唐宗兴
受保护的技术使用者：重庆极泽生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/4