一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒

1.本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒。


背景技术：

2.血流感染是败血症和感染性休克的主要病因，选择适当的抗菌剂能够应对血流感染带来的危害，随着微生物对抗菌剂的耐药性日益增加，目前采用在实验室条件下对采集到的样本进行血培养(bc)的方式，通过鉴定阳性的致病性微生物来选择适当的抗菌剂，但该种方式耗时较高，且鉴定出的阳性准确率不高。
3.血培养是血流感染病原检测的金标准，但具有细菌生长缓慢、周期长、营养要求高、细胞内生长、血培养阳性率低等明显的缺陷。以荧光qpcr技术为代表的分子诊断技术的出现，在一定程度上解决了血培养的问题，但也存在诸如不能提供病原的基因序列，以及通量低的问题。宏基因组测序(mngs)解决了病原检测通量的短板，但宿主核酸比例高、检测敏感度低、周期长和成本高等问题仍待解决。针对以上技术限制，亟需开发一种新的针对血流感染的检测方法。
4.多重pcr靶向高通量测序是一种潜在可以替代或解决以上血液病原感染的检测问题的方法，此方法具有成本低、时效短、准确率高等优点，但因为多重pcr扩增的单个反应中，引物的数量往往达到几百甚至几千条，技术难度高；同时病原微生物序列相似度高，进一步加大了多重pcr建库的难度。近年也有报导利用多重pcr建库试剂盒进行病原微生物的检测，但大多只针对某一种类型样本的部分病原进行检测。除此之外，现有的病原微生物多重pcr法文库构建试剂盒因为在同一反应管中存在几百甚至几千条引物，而整个试剂盒的引物组及反应体系为整体分析优化的结果，因此，现有的病原微生物多重pcr建库试剂盒还存在以下的常见问题：(1)引物间相互干扰，形成大量二聚体，降低试剂盒性能；(2)非特异扩增，产生大量非目标扩增子，影响后续测序；(3)无法进行准确的定量；(4)扩增均一性无法保障；(5)扩展性、灵活性差。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种基于多重扩增的多靶标高通量测序检测血流感染的引物组、试剂盒及方法，本发明基于多重pcr引物组，配合特定组分的缓冲液，以及血液样本预处理酶制剂，拟解决解决血培养技术周期长、分辨率低和耗费人力的缺点和新型分子生物学检测技术存在的通量不高、灵敏度不足、特异性差的问题。
6.基于上述目的，本发明提供了一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒用于解决本领域内的该技术问题。
7.一方面，本发明涉及一种用于血流感染多靶标检测的试剂盒，检测样本为血液，其包括引物组，所述引物组包括分别针对高发微生物大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、布鲁菌、沙门菌属、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠
菌、b群链球菌的引物对；
8.分别针对耐药基因meca、mecc、tetk、crkp、oxa-51的引物对；
9.分别针对毒力基因pvl、asal的引物对；
10.用于内参的引物对；
11.针对大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；
12.针对肺炎克雷伯菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，针对肺炎克雷伯菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；
13.针对铜绿假单胞菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，针对铜绿假单胞菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；
14.针对奇异变形杆菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；
15.针对阴沟肠杆菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；
16.针对布鲁菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，针对布鲁菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.12所示；
17.针对沙门菌属的正向引物的核苷酸序列如seq id no.13所示，针对沙门菌属的反向引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；
18.针对肺炎链球菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.15所示，针对肺炎链球菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.16所示；
19.针对金黄色葡萄球菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.17所示，针对金黄色葡萄球菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.18所示；
20.针对白色念珠菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.19所示，针对白色念珠菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.20所示；
21.针对b群链球菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.21所示，针对b群链球菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.22所示；
22.针对meca的正向引物的核苷酸序列如seq id no.23所示，针对meca的反向引物的核苷酸序列如seq id no.24所示；
23.针对mecc的正向引物的核苷酸序列如seq id no.25所示，针对mecc的反向引物的核苷酸序列如seq id no.26所示；
24.针对tetk的正向引物的核苷酸序列如seq id no.27所示，针对tetk的反向引物的核苷酸序列如seq id no.28所示；
25.针对crkp的正向引物的核苷酸序列如seq id no.29所示，针对crkp的反向引物的核苷酸序列如seq id no.30所示；
26.针对oxa-51的正向引物的核苷酸序列如seq id no.31所示，针对oxa-51的反向引物的核苷酸序列如seq id no.32所示；
27.针对pvl的正向引物的核苷酸序列如seq id no.33所示，针对pvl的反向引物的核苷酸序列如seq id no.34所示；
28.针对asal的正向引物的核苷酸序列如seq id no.35所示，针对asal的反向引物的
核苷酸序列如seq id no.36所示；
29.用于内参的引物对的核苷酸序列如seq id no.37所示，用于内参的引物对的核苷酸序列如seq id no.38所示。
30.进一步地，本发明提供的用于血流感染多靶标检测的试剂盒中，还包括缓冲液，所述缓冲液包括：β-巯基乙醇、四氢甲基嘧啶羧酸、pcr预混液、pcr酶液；
31.所述pcr预混液包括10
×
pcr缓冲液、mgcl2和dntps；
32.所述pcr酶液包括热启动dna聚合酶和ung酶。
33.进一步地，本发明提供的用于血流感染多靶标检测的试剂盒中，提取血液样本dna时，在血液样本中预添加几丁质酶和硫酸软骨素ac裂解酶，然后进行dna提取。
34.与现有技术相比，本发明提供的技术方案具备以下有益效果或优点：
35.本发明的血流感染病原体多靶标基因检测产品可以通过检测增菌培养后的血液，同时鉴别11种血流感染病原体，将所有目的基因的质粒等拷贝数混合在一起，通过调整各病原体的引物浓度，使各靶点出现的峰高相当，达到等效扩增所有靶基因的目的。该方法能对常见血流感染患者或疑似患者的血液样本进行检测，提供关于常见血流感染病原体的病原学诊断信息，帮助临床医师在及时明确病原体种类并采取有效治疗方案，同时减少经验性抗生素使用，降低医疗成本。本发明提取血液样本dna时，在血液样本中预添加几丁质酶和硫酸软骨素ac裂解酶，然后进行dna提取，实现血液样本dna得率的提高。本发明在缓冲液成分中，添加了β-巯基乙醇、四氢甲基嘧啶羧酸，保护血液样本dna，减少了后续测序检测微生物时样本dna的损失，显示高特异性，并可检测低至10拷贝/μl的病原体，灵敏度较高。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
37.图1为样本编号6#的检测结果；
38.图2为样本编号15#的检测结果；
39.图3为样本编号22#的检测结果；
40.图4为样本编号26#的检测结果。
具体实施方式
41.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
42.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
43.下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
44.实施例1
45.本实施例提供了对血液样本进行dna提取的试验。
46.获取健康的人血样本，掺入10cfu/ml的金黄色葡萄球菌(标准菌株atcc 25923)，
采用磁珠法血流感染病原体dna提取试剂盒(购自北京源微生物科技有限公司)提取病原体dna。试验设置6组，分别为1#：dna提取前在样本中加入15mg/μl几丁质酶和10mg/μl硫酸软骨素ac裂解酶，50℃水浴15min，期间摇晃震荡2次；2#：dna提取前在样本中加入12.5mg/μl几丁质酶和12.5mg/μl硫酸软骨素ac裂解酶，50℃水浴15min，期间摇晃震荡2次；3#：dna提取前在样本中加入10mg/μl几丁质酶和15mg/μl硫酸软骨素ac裂解酶，50℃水浴15min，期间摇晃震荡2次；4#：dna提取前在样本中加入25mg/μl几丁质酶，50℃水浴15min，期间摇晃震荡2次；5#：dna提取前在样本中加入25mg/μl硫酸软骨素ac裂解酶，50℃水浴15min，期间摇晃震荡2次；6#：dna提取前在样本中不添加，50℃水浴15min，期间摇晃震荡2次。采用微液滴数字pcr进行检测，检测仪器购自北京世联博研科技有限公司，每组进行9次试验，试验结果如表1所示。
47.表1：样本阳性点数的检出结果
48.组号1234567891#4752475057475147452#5247554954584753473#4958595848514856474#3037373635323037305#3330353131343735336#242725293028282823
49.由表1结果显示可知，在相同微量菌体浓度条件下，经过本发明样本处理方法获得的样本经过检测能够获得更多的阳性点数，表明本发明所述方法能够保证微量致病菌的阳性检出率，即提高了样本dna的得率。
50.实施例2
51.本实施例提供了采用本发明提供的试剂盒对血液样本对疑似血流感染的人外周血血浆中提取的dna样本进行基因检测的试验。
52.试剂盒包括引物组、阳性对照物、阴性对照物、缓冲液。
53.引物组包括：分别针对高发微生物大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、布鲁菌、沙门菌属、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、b群链球菌的引物对；分别针对耐药基因meca、mecc、tetk、crkp、oxa-51的引物对；分别针对毒力基因pvl、asal的引物对；用于内参(ic)的引物对。引物序列表如表2所示。
54.阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物(由碧云天生物技术有限公司合成提供)。
55.阴性对照物是无核酸酶超纯水。
56.pcr预混液和pcr酶液(购自碧云天生物技术有限公司)。
57.上述引物均由北京明琛志远生物技术有限公司合成。
58.反应时体系中的组分用量为10
×
的pcr缓冲液1体积，10μm的dntps共0.2体积，β-巯基乙醇0.3体积，四氢甲基嘧啶羧酸0.2体积，25mmol/l的mgcl2溶液0.8体积，引物混合物1体积(每个引物的浓度为300nm)，5u/μl的热启动dna聚合酶0.4体积，1u/μl的ung酶0.5体积，dna模板5体积，无核酸酶纯水1.1体积。dna模板的使用量为50ng/体积。
59.表2：引物序列表
60.[0061][0062]
(1)采集疑似血流感染的人外周血血浆，分别进行核酸提取，阳性对照和阴性对照各取80μl进行提取，每个参与提取的样本需加入5μl的ic共同提取。核酸提取方法参照实施例1的实验组1#。
[0063]
(2)参照上述的反应体系，配制50μl的反应体系，涡旋混匀后，用离心机进行离心，然后分装于pcr反应管中。
[0064]
(3)将提取好的核酸加入到装有配制好的反应体系的pcr反应管中。扩增程序如下：首先，95℃预变性5min，然后94℃变性30s，65℃退火1.5min，5个循环；再94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共20个循环；最后72℃终延伸5min。
[0065]
(4)用0.9
×
spri磁珠纯化上述pcr产物，20μl洗脱，使用qubit法定量浓度。用hyper prep kit试剂盒建立dna文库，建库起始模板定量5ng，用library quantification kit对dna文库进行绝对定量。
[0066]
(5)采用s5 2
×
75bp碱基配对读序的双末端测序，测序后的原始reads序列分为正向读长和反向的读长，通过s5软件将正反向的reads序列进行合并，合并的参数是100％的相似性，两端至少重叠10bp。
[0067]
(6)利用ion reporter软件对上述序列进行统计，首先修改软件的配置文件，配置文件中包含对上述序列进行分型统计。
[0068]
(7)通过blast将reads比对模板序列，长度覆盖和比对的相似度都设定为95％，将细菌reads读数超过10reads的认定为阳性，阳性结果采用血培养进行确认。
[0069]
采用实施例提供的金黄色葡萄球菌血流感染的血浆进行试验，平行测试50次，以考察本技术提供的试剂盒混合扩增体系的稳定性以及效果。测试表明：在50次测试中，混合扩增体系引物均对其目的靶基因位点进行了有效扩增，靶基因无缺失，说明本技术试剂盒涉及引物稳定有效。
[0070]
取50例疑似血流感染患者外周血，采用上述方法进行检测，检测结果如表3所示，部分样本的检测结果与阳性对照检测结果示意图如图1～4所示。
[0071]
表3：检测结果
[0072][0073][0074]
统计血培养得到的阳性与阴性数量，其结果如表4所示。
[0075]
表4：检测统计结果
[0076][0077]
由表4可知，本技术本技术提供的试剂盒及该试剂盒采用敏感性及特异性均较高的多靶标基因高通量测序法，其检测结果的特异性和敏感性均显著提高，检测时间约为12h，耗时短，而常规培养与鉴定法检测一般要24h以上。
[0078]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方
式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种用于血流感染多靶标检测的试剂盒，检测样本为血液，其特征在于，包括引物组，所述引物组包括分别针对高发微生物大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌、阴沟肠杆菌、布鲁菌、沙门菌属、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、b群链球菌的引物对；分别针对耐药基因meca、mecc、tetk、crkp、oxa-51的引物对；分别针对毒力基因pvl、asal的引物对；用于内参的引物对；针对大肠埃希菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；针对肺炎克雷伯菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，针对肺炎克雷伯菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；针对铜绿假单胞菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，针对铜绿假单胞菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；针对奇异变形杆菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；针对阴沟肠杆菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，针对大肠埃希菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；针对布鲁菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，针对布鲁菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.12所示；针对沙门菌属的正向引物的核苷酸序列如seq id no.13所示，针对沙门菌属的反向引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；针对肺炎链球菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.15所示，针对肺炎链球菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.16所示；针对金黄色葡萄球菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.17所示，针对金黄色葡萄球菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.18所示；针对白色念珠菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.19所示，针对白色念珠菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.20所示；针对b群链球菌的正向引物的核苷酸序列如seq id no.21所示，针对b群链球菌的反向引物的核苷酸序列如seq id no.22所示；针对meca的正向引物的核苷酸序列如seq id no.23所示，针对meca的反向引物的核苷酸序列如seq id no.24所示；针对mecc的正向引物的核苷酸序列如seq id no.25所示，针对mecc的反向引物的核苷酸序列如seq id no.26所示；针对tetk的正向引物的核苷酸序列如seq id no.27所示，针对tetk的反向引物的核苷酸序列如seq id no.28所示；针对crkp的正向引物的核苷酸序列如seq id no.29所示，针对crkp的反向引物的核苷酸序列如seq id no.30所示；针对oxa-51的正向引物的核苷酸序列如seq id no.31所示，针对oxa-51的反向引物的核苷酸序列如seq id no.32所示；
针对pvl的正向引物的核苷酸序列如seq id no.33所示，针对pvl的反向引物的核苷酸序列如seq id no.34所示；针对asal的正向引物的核苷酸序列如seq id no.35所示，针对asal的反向引物的核苷酸序列如seq id no.36所示；用于内参的引物对的核苷酸序列如seq id no.37所示，用于内参的引物对的核苷酸序列如seq id no.38所示。2.根据权利要求1所述的用于血流感染多靶标检测的试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液，所述缓冲液包括：β-巯基乙醇、四氢甲基嘧啶羧酸、pcr预混液、pcr酶液；所述pcr预混液包括10
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pcr缓冲液、mgcl2和dntps；所述pcr酶液包括热启动dna聚合酶和ung酶。3.根据权利要求1所述的用于血流感染多靶标检测的试剂盒，其特征在于，提取血液样本dna时，在血液样本中预添加几丁质酶和硫酸软骨素ac裂解酶，然后进行dna提取。

技术总结
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于血流感染多靶标检测的引物组及试剂盒，本发明提供的引物组提供了多个靶标，可高灵敏度地检测临床常见和高发微生物造成的侵袭性感染。本发明还提供了一种试剂盒，包含引物组和PCR缓冲液，两者组合能进一步提高检出限，并减少了后续测序检测微生物时样本DNA的损失，提高了样本DNA的得率。了样本DNA的得率。了样本DNA的得率。


技术研发人员：夏涵 杨启文 官远林 张烨 李长诚 佟斯垚 张栋 喻玮 朱盈 贾沛瑶
受保护的技术使用者：中国医学科学院北京协和医院
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/4