食品中大豆异黄酮总量的测定方法

1.本发明属于分析检测技术领域，具体涉及含大豆蛋白类食品中大豆异黄酮总量的测定。


背景技术：

2.大豆异黄酮主要来源于豆科植物的荚豆类，其结构与雌激素相似，因而在体内吸收后可与雌激素受体结合并产生雌激素样活性。正是由于具有类雌激素作用，大豆异黄酮又被称为植物雌激素，并用于改善更年期综合症。此外，有研究表明，大豆异黄酮具有抗氧化、预防肥胖、预防糖尿病、降低癌症风险、降低血糖及防止骨质酥松的作用，因而在保健品行业被广泛推广。但是过量摄入大豆异黄酮也会带来负面影响，特别是对于使用豆基配方食品的婴儿。
3.作为gb 10765-2021(食品安全国家标准婴儿配方食品)豆基婴儿配方食品中允许的并且是唯一的主要蛋白质来源，大豆来源的大豆分离蛋白往往残留有一定量的大豆异黄酮。由于缺少相关数据，以往认为使用豆基婴儿配方食品是安全的，然而，近年来最新的研究表明，当婴儿在发育敏感窗口期暴露在一定浓度水平的大豆异黄酮下，其产生的雌激素样作用将对生殖系统发育产生不良影响，并具有成年后引发相关疾病的风险。考虑到大豆及其制品在中国及其它亚洲国家有着普遍的食用习惯，同时由于大豆分离蛋白作为可替代动物蛋白的少数植物蛋白而被广泛用于食品工业及膳食补充剂，因此过量摄入植物雌激素的风险与日俱增，而准确快速的测定食品中大豆异黄酮含量不但为消费者提供合理的饮食指导，而且能促进大豆深加工产业链的发展。低异黄酮残留的大豆分离蛋白也将进一步保障豆基婴儿配方食品的使用安全性。
4.大豆异黄酮可以分为两类：一类为游离型苷元，包括大豆苷元、黄豆黄素、染料木素；另一类为结合型，苷元分别结合葡萄糖基、葡萄糖乙酰基及葡萄糖丙二酰基。以上游离型和结合型共计12种，其中结合型在大豆中约占总异黄酮的97％-98％。由于乙酰类及丙二酰类异黄酮苷稳定性差，故难以获取相应的标准品，进而造成了该类异黄酮定量的困难。因此，多数方法仅检测其中的3种苷元(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)及3种苷(大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷)，从而无法真实反映样品中实际大豆异黄酮的含量水平。
5.美国分析化学家协会(aoac)和美国药典(usp)收载的大豆异黄酮测定方法均采用了标准图谱比对法，并通过引入“转换因子”的方式以大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷为标准品对乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷进行定量检测，但是采用上述方法需要确保色谱条件的充分一致性，包括色谱柱的规格、品牌的选择，以保证获得相对一致的保留时间，当样品基质复杂时往往引起较大的结果偏差。其它方法如aoac 2001.10通过皂化的方式将乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷进行水解，以此获得相应的大豆苷、黄豆黄苷及染料木苷，并用六个标准品进行定量。该方法能比较准确地测定异黄酮的总量，但对含量较低的样品其测定偏差较大。
6.目前国内标准方法有gb/t 23788-2009《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效
液相色谱法》及qb/t 5397-2019《大豆食品中异黄酮含量的测定》，两种方法均以高效液相色谱结合紫外检测的方式测定样品中3种苷元(大豆苷元、大豆黄素、染料木素)和3种苷(大豆苷、黄豆苷、染料木苷)。由于普遍采用甲醇水等极性混合溶剂通过振荡或超声的方式进行提取，同时也由于缺乏乙酰类及丙二酰类大豆异黄酮苷标准品，这就造成无法对另外6类主要异黄酮进行有效测定，从而使测定结果较真实结果偏低。
7.鉴于以上方法的局限性及不准确性，有必要开发并建立一种能真实反映样品中大豆异黄酮含量水平的测定方法，并具备准确、简便、快速的特点。
8.基于上述研究，本发明旨在实现大豆类相关食品中总异黄酮的准确测定，为食品发展及食品安全监管提供有力的技术支撑。


技术实现要素：

9.发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，通过碱性条件下提取，结合葡萄糖苷酶的水解作用，可以实现样品中的各类异黄酮苷定量转化为相应的苷元；超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法的运用可以实现样品中低浓度大豆异黄酮的测定并有效缩短检测周期。
10.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
11.一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，包括以下步骤：
12.s1、待测样品使用碱性甲醇溶液进行提取处理，得提取液；
13.s2、所述提取液中加入β-葡萄糖苷酶进行酶解，实现转化后加入纯甲醇混合溶解，得测试液；
14.s3、所述测试溶液经超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱进行检测，获得待测样品中异黄酮类化合物的含量，所述异黄酮类化合物包括大豆苷元、黄豆黄素及染料木素。
15.本技术测定方法的原理为：待测样品(本技术中也称作试样)经碱性甲醇溶液提取，提取过程中试样中丙二酰及乙酰类大豆异黄酮苷分子上的酰基被水解，并转变为相应的异黄酮苷(大豆苷、黄豆黄苷及染料木苷)，提取液在酸性缓冲溶液中经β-葡萄糖苷酶酶解，各类异黄酮苷分子上的葡萄糖基被水解去除，溶液中所有的异黄酮苷均转变为相应的苷元(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)；酶解液用纯甲醇混合并稀释后经反相色谱柱分离，高效液相色谱串联质谱检测，以外标法定量。
16.可选的，在一种实施方式中，步骤s1中，所述碱性甲醇溶液为含有3g/l氢氧化钠的80％甲醇水溶液。
17.可选的，在一种实施方式中，所述提取处理包括，在含总大豆异黄酮50-500ug的待测样品中加入80ml碱性甲醇溶液，超声提取20min，加入4ml冰醋酸中和后用80％甲醇溶液定容至100ml。
18.可选的，在一种实施方式中，步骤s1中，所述待测样品中异黄酮总量的范围以苷元计为50ug-500μg。
19.可选的，在一种实施方式中，步骤s2具体包括，所述提取液1体积当量与4体积当量含5个活性单位葡萄糖苷酶的醋酸缓冲液混匀，在50℃水浴条件下振摇酶解120min，冷却，用甲醇定容至10体积当量。
20.进一步可选的，在一种实施方式中，步骤s2中，所述醋酸缓冲液的浓度为0.1mol/
l,ph＝5.0。
21.可选的，在一种实施方式中，步骤s2中，所述酶解样品溶液用0.2μm的聚丙烯(pp)滤头过滤后备用。
22.可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，所述超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱中的液相色谱的检测条件包括：
23.色谱柱：c18柱，50mm
×
2.1mm，1.8μm，或等效亚2微米超高效色谱柱。
24.可选的，在一种实施方式中，液相色谱的其他检测条件还包括：
25.流动相：a相，0.1％(v/v)甲酸溶液；b相，含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液；
26.梯度洗脱：0min～12.0min，92％～75％ a；12.0min～13.0min，75％ a；13.0min～13.1min，75％～92％ a；13.1min～15.0min，92％ a；
27.流速：0.4ml/min；
28.柱温：40℃；
29.进样体积：1μl。
30.可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，所述高效液相色谱-串联三重四级杆质谱中的质谱条件包括：电喷雾离子源、esi
+
正离子。
31.可选的，在一种实施方式中，质谱条件还包括：
32.干燥气温度：300℃；
33.干燥气流速：10l/min；
34.雾化器压力：20psi；
35.鞘气温度：250℃；
36.鞘气流速：11l/min；
37.毛细管电压：2000v。
38.可选的，在一种实施方式中，步骤s3中，所述高效液相色谱-串联三重四级杆质谱采用多重反应监测(mrm)模式，所述异黄酮类化合物的选择离子参数条件包括：
39.大豆苷元，保留时间为9
±
0.5min，母离子255.1m/z，子离子199.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量26v；
40.黄豆黄素，保留时间为10
±
0.5min，母离子285.1m/z，子离子270.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量30v；
41.染料木素，保留时间为12
±
0.5min，母离子271.1m/z，子离子215.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量30v。
42.可选的，在一种实施方式中，步骤s3中检测处理具体包括以下步骤：
43.s31、制作标准曲线
44.取异黄酮组分大豆苷元、黄豆黄素、染料木素的标准品分别溶于纯甲醇中，作为标准溶液，并用80％甲醇溶液配制成不同的梯度浓度，将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液中各异黄酮浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；
45.s32、异黄酮组分测定
46.取步骤s2所得测试液注入超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱中进行检测，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中各异黄酮浓度。
47.可选的，在一种实施方式中，步骤s31中，所述标准溶液的配制方法包括：
48.s311、大豆异黄酮标准品溶于纯甲醇中，得100μg/ml的大豆异黄酮标准储备液；
49.s312、大豆异黄酮标准储备液溶于80％甲醇溶液中，得5-10μg/ml的大豆异黄酮标准中间液；
50.s313、大豆异黄酮标准中间液溶于80％甲醇溶液中，得0.05-0.5μg/ml的大豆异黄酮混合标准溶液。
51.可选的，在一种实施方式中，步骤s312中，所述大豆苷元标准中间液为5μg/ml，黄豆黄素标准中间液为5μg/ml，所述染料木素标准中间液为10μg/ml。
52.可选的，在一种实施方式中，步骤s313中，所述大豆异黄酮混合标准溶液中大豆苷元浓度为0.2μg/ml，黄豆黄素浓度为0.05μg/ml，染料木素浓度为0.5μg/ml。
53.可选的，在一种实施方式中，试样中大豆异黄酮各组分(大豆苷元(x1)、黄豆黄素(x2)、染料木素(x3))的含量按公式(1)计算：
[0054][0055]
式中：
[0056]
xi——试样中大豆异黄酮单一组分的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0057]ci
——根据标准工作曲线获得各异黄酮的浓度，单位为微克每毫升(μg/ml)；
[0058]
v——试样稀释总体积，单位为毫升(ml)；
[0059]
m——试样质量，单位为克(g)。
[0060]
可选的，在一种实施方式中，试样中大豆异黄酮总含量，按公式(2)计算：
[0061]
x＝x1+x2+x3ꢀꢀꢀ
(2)
[0062]
式中：
[0063]
x——试样中大豆异黄酮总含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0064]
x1——试样大豆苷元的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0065]
x2——试样黄豆黄素的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0066]
x3——试样染料木素的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)。
[0067]
本技术提供了食品中大豆异黄酮总量的测定方法，适用于含大豆异黄酮成分的食品，包括以大豆异黄酮为主要功能性成分添加或添加有大豆分离蛋白的保健食品、豆基婴幼儿配方食品中大豆异黄酮的测定。
[0068]
有益效果：本发明采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法测定食品中大豆异黄酮总量的方法，具有以下优势：
[0069]
(1)由于异黄酮中的糖苷型具有亲水性及分子量相对较大的特点，其进入人体后很难被直接吸收，当大豆异黄酮苷进入人体后则在肠道葡萄糖苷酶的作用下水解为苷元并在小肠迅速吸收进而表现出其生物活性，因而检测样品中苷元的总量则显得更具科学性。
[0070]
(2)检测目标物的减少将有助于缩短仪器运行时间并降低检测成本。通过碱性条件下提取结合葡萄糖苷酶的水解作用，可以实现样品中的各类异黄酮苷定量转化为相应的苷元。超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法的运用可以实现样品中低浓度大豆异黄酮的测定并有效消除样品基质干扰。
[0071]
(3)由于仅使用3类大豆异黄酮苷元就实现了对12种大豆异黄酮总量的测定，对于标准品的使用费用在原先最少需要使用6种异黄酮标准品的基础上减少为仅为原来的1/3。
[0072]
(4)总大豆异黄酮以苷元计，一方面能更准确地体现实际生物活性水平；另一方面也可以避免因使用苷或苷元的不统一而造成结果表述的差异。
[0073]
(5)方法学研究表明，该方法具有较低的检出限及较高的准确度。
附图说明
[0074]
图1为各类大豆异黄酮苷元及苷的结构式。
[0075]
图2为大豆异黄酮(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)总离子流色谱图。
[0076]
图3为大豆苷元标准曲线图。
[0077]
图4为黄豆黄素标准曲线图。
[0078]
图5为染料木素标准曲线图。
[0079]
图6为异黄酮苷在β-葡萄糖苷酶的作用下水解生成异黄酮苷元及葡萄糖的反应示意图。
[0080]
图7为样品中乙酰及丙二酰大豆异黄酮苷在80％甲醇溶液中对含不同浓度氢氧化钠提取的响应值比较：(a)乙酰类大豆异黄酮苷，(b)丙二酰类大豆异黄酮苷。
[0081]
图8为样品中大豆异黄酮苷及对应苷元在80％甲醇溶液中对含不同浓度氢氧化钠提取的响应值比较：(a)大豆异黄酮苷，(b)大豆异黄酮苷元。
具体实施方式
[0082]
大豆异黄酮(soybean isoflavones)主要来源于豆科植物的荚豆类，是豆科类植物生长到一定阶段后通过次级代谢合成的一类活性物质，其结构特点3-苯并吡喃酮为母核的一类黄酮类化合物，按类型可以分为两类：一类为苷元类包括大豆苷元、黄豆黄素、染料木素；另一类为结合有葡萄糖基的苷，包括大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷以及相应的乙酰及丙二酰大豆异黄酮苷。因而目前已知的大豆异黄酮包含了12种不同的物质，如图1所示。当各类大豆异黄酮苷进入人体后在肠道葡萄糖苷酶的作用下水解为相应苷元并在小肠迅速吸收进而表现出其生物活性。因此，检测样品中苷元的总量显得更具科学性。同时，检测目标物的减少将有助于缩短仪器运行时间、消除干扰并降低检测成本。
[0083]
目前，aoac 2008.03分析方法及美国药典(usp)对于大豆制品及异黄酮类膳食补充剂均采用高效液相色谱法，通过利用标准图谱及3类苷及苷元标准品的相对保留时间对乙酰和丙二酰类异黄酮苷进行定性，并通过分子量转化的关系来定量。上述方法存在以下问题：(1)总量依靠“转换因子”计算而得，并非真实测定结果，当基质复杂或色谱保留发生偏移时无法准确定性，导致偏差；(2)操作条件苛刻，需要保证色谱条件的充分一致性，对操作人员要求比较高，且不利于方法的推广；(3)aoac 2008.03单针色谱运行时间60min，usp梯度洗脱时间为74min。aoac 2001.10为高效液相色谱法，通过皂化的方式将丙二酰及乙酰类异黄酮苷转变为异黄酮苷，通过使用6种标准品可以实现准确定量，但是当样品中异黄酮含量较低时往往偏差较大，且色谱洗脱时间也较长为44.5min。
[0084]
国内方法gb/t 23788-2009及qb/t5397-2019通过3种苷及3种苷元标准品对样品中6种异黄酮进行定量，并以这6种物质的总量定义为总异黄酮，结果没有反映丙二酰及乙
酰类异黄酮的量，从而造成测定结果偏低。同时国内有报道液质联用法测定大豆异黄酮，但普遍局限在大豆苷元、黄豆黄素、染料木素、大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷这6种物质的检测，并未系统化的检测实际异黄酮总量。
[0085]
本发明提出一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，通过碱性条件下提取，结合葡萄糖苷酶的水解作用，实现了样品中各类大豆异黄酮苷到相应苷元的定量转化；通过应用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法，实现了样品中低浓度大豆异黄酮的测定并有效缩短检测周期，方法学研究表明，本方法具有较低的检出限及较高的准确度。由于本发明仅通过3种大豆异黄酮苷元就实现了样品中12种大豆异黄酮总量的测定，标准品的使用费用在原先需要最少使用6种异黄酮标准品的基础上减少为仅为原来的1/3。此外，总大豆异黄酮以苷元计，一方面能更准确地体现实际生物活性水平，另一方面也可以避免因使用苷或苷元的不统一而造成总异黄酮结果表述的不一致。大豆异黄酮作为植物雌激素被用于改善更年期综合症，但是过量的大豆异黄酮也会带来负面影响，考虑到大豆及其制品在中国及其它亚洲国家有着普遍的食用习惯，同时由于大豆分离蛋白作为可替代动物蛋白的少数植物蛋白而被广泛用于食品工业及膳食补充剂，因此过量摄入植物雌激素的风险与日俱增。本发明旨在实现豆基类配方食品中总异黄酮的准确测定，为食品发展及食品安全监管提供有力的技术支撑，同时为消费者提供合理的饮食指导，并希望能促进大豆深加工产业链的发展，如低异黄酮残留的大豆分离蛋白生产等。
[0086]
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0087]
实施例
[0088]
1.试剂和材料
[0089]
注：除非另有说明，本实施例方法所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
[0090]
1.1试剂
[0091]
乙腈(ch3cn)：色谱纯。
[0092]
甲醇(ch3oh)：色谱纯。
[0093]
甲酸(hcooh)：色谱纯。
[0094]
冰乙酸(ch3cooh)。
[0095]
氢氧化钠(naoh)。
[0096]
无水乙酸钠(ch3coona)。
[0097]
β-葡萄糖苷酶：来源于杏仁，活力单位》4u/mg。
[0098]
1.2试剂配制
[0099]
碱性甲醇溶液：称取3g氢氧化钠，加入200ml水使溶解，用甲醇定容至1000ml，混匀。
[0100]
甲醇溶液(80％，体积比)：量取800ml甲醇，加入200ml水，混匀。
[0101]
乙酸钠缓冲溶液(0.1mol/l，ph 5.0)：称取8.20g无水乙酸钠，加900ml水溶解，用冰醋酸调节ph至5.0
±
0.1，用水稀释至1000ml。
[0102]
乙腈溶液：量取1ml甲酸，用乙腈定容至1000ml，混匀，超声脱气。
[0103]
甲酸溶液(0.1％，体积比)：量取1ml甲酸，用水定容至1000ml，混匀，超声脱气。
[0104]
葡萄糖苷酶溶液：称取适量β-葡萄糖苷酶，用乙酸钠缓冲液溶解，使含酶量为1.25u/ml。临用前配制。
[0105]
1.3标准品
[0106]
大豆苷元标准品(c
15h10
o4,cas:486-66-8)标准品：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
[0107]
黄豆黄素标准品(c
16h12
o5,cas:40957-83-3)标准品：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
[0108]
染料木素标准品(c
15h10
o5,cas:446-72-0)标准品：纯度≥98％，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
[0109]
1.4标准溶液配制
[0110]
(1)大豆异黄酮标准储备液(100μg/ml)：精密称取大豆异黄酮标准品(大豆苷元、黄豆黄素、染料木素)各20mg分别置200ml棕色容量瓶中，加入适量甲醇，超声使溶解，放冷，用甲醇定容至刻度，混匀，使浓度为100μg/ml，在4℃冰箱中贮存，保存期6个月。
[0111]
(2)大豆异黄酮标准中间液
[0112]
大豆苷元标准中间液(5μg/ml)：精密移取5ml大豆苷元标准储备液，用80％甲醇溶液稀释并定容至100ml。在4℃冰箱中避光贮存，保存期一周。
[0113]
黄豆黄素标准中间液(5μg/ml)：精密移取5ml黄豆黄素标准储备液，用80％甲醇溶液稀释并定容至100ml。在4℃冰箱中避光贮存，保存期一周。
[0114]
染料木素标准中间液(10μg/ml)：精密移取5ml染料木素标准储备液，用80％甲醇溶液稀释并定容至50ml。在4℃冰箱中避光贮存，保存期一周。
[0115]
(3)大豆异黄酮混合标准溶液：分别精密移取大豆苷元、黄豆黄素、染料木素标准中间液4ml、1ml、5ml置100ml棕色容量瓶中，用甲80％醇溶液稀释并定容至刻度，该大豆异黄酮混合标准溶液中大豆苷元浓度为0.2μg/ml，黄豆黄素浓度为0.05μg/ml，染料木素浓度为0.5μg/ml。临用前配制。
[0116]
(4)大豆异黄酮标准系列溶液：分别精密移取大豆异黄酮标准溶液0.5ml、1ml、2ml、5ml、*10ml，用80％甲醇溶液容至10ml，在该标准系列浓度下，大豆苷元浓度分别为0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.10μg/ml、0.20μg/ml；黄豆黄素浓度分别为0.0025μg/ml、0.0050μg/ml、0.010μg/ml、0.025μg/ml、0.050μg/ml；染料木素浓度分别为0.025μg/ml、0.05μg/ml、0.10μg/ml、0.25μg/ml、0.50μg/ml。(*使用大豆异黄酮混合标准溶液，不用稀释)。
[0117]
2.仪器和设备
[0118]
超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱仪：配有电喷雾电离源(esi)。
[0119]
分析天平：感量为0.01g、0.001g、0.00001g。
[0120]
超声波清洗器。
[0121]
ph计：精度0.01。
[0122]
离心机。
[0123]
组织捣碎机。
[0124]
恒温振摇水浴锅。
[0125]
3.分析步骤
[0126]
3.1试样制备
[0127]
固体样品需粉碎、研磨，均质混匀。液体样品测定前振摇混匀。
[0128]
精确称取混匀后的样品适量(试样中含异黄酮总量以苷元计为50-500μg)于100ml棕色容量瓶中，加入碱性甲醇溶液80ml，超声提取20min，加入4ml冰醋酸，混匀，用80％甲醇溶液定容至刻度，混匀。
[0129]
取提取液适量，离心使清澈，精密移取上清液1ml置15ml离心管内，加入4ml葡萄糖苷酶溶液(含酶量5u)，混匀。在50℃的水浴条件下振摇酶解120min，取出冷却至室温，加入5ml纯甲醇，混匀并超声5min。取适量，用0.2μm的聚丙烯(pp)滤头过滤后备用。
[0130]
注：操作过程应避免强光照射。
[0131]
3.2仪器参考条件
[0132]
3.2.1液相色谱参考条件
[0133]
色谱柱：c
18
柱，50mm
×
2.1mm，1.8μm，或等效色谱柱。
[0134]
流动相：a相，甲酸溶液(0.1％)；b相，乙腈溶液(含0.1％甲酸)。
[0135]
梯度洗脱：0min～12.0min，92％～75％ a；12.0min～13.0min，75％ a；13.0min～13.1min，75％～92％ a；13.1min～15.0min，92％ a。
[0136]
流速：0.4ml/min。
[0137]
柱温：40℃。
[0138]
进样体积：1μl。
[0139]
3.2.2质谱参考条件
[0140]
电离方式：esi
+
。
[0141]
干燥气温度：300℃
[0142]
干燥气流速：10l/min
[0143]
雾化器压力：20psi
[0144]
鞘气温度：250℃
[0145]
鞘气流速：11l/min
[0146]
毛细管电压：2000v。
[0147]
多重反应监测(mrm)模式,加速电压及碰撞能量见表1。
[0148]
表1离子对参数条件
[0149][0150]
在一些示例中，大豆苷元的保留时间为8.89min，黄豆黄素的保留时间为9.81min，染料木素的保留时间为11.97min。
[0151]
3.3标准曲线的制作
[0152]
将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的峰面积，以标准工作液中各异黄酮浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图2-4所示，各标准曲线的统计如表2所示。
[0153]
表2标准曲线验证
[0154][0155][0156]
3.4试样溶液的测定
[0157]
将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中各异黄酮浓度。
[0158]
测试结果如图5所示，可知，大豆苷元、黄豆黄素、染料木素三种异黄酮峰面积分别为：109919、40885、31693。将峰面积数值代入各自的标准曲线中，得大豆苷元、黄豆黄素、染料木素三种异黄酮的浓度分别为c1＝0.1372μg/ml、c2＝0.02095μg/ml、c2＝0.2696μg/ml。
[0159]
4分析结果的表述
[0160]
4.1试样中大豆异黄酮各组分(大豆苷元(x1)、黄豆黄素(x2)、染料木素(x3))的含量按公式(1)计算：
[0161][0162]
式中：
[0163]
xi——试样中大豆异黄酮单一组分的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0164]ci
——根据标准工作曲线获得各异黄酮的浓度，单位为微克每毫升(μg/ml)；
[0165]
v——试样稀释总体积，单位为毫升(ml)；
[0166]
m——试样质量，单位为克(g)。
[0167]
根据3.4的检测结果，得到试样中大豆异黄酮单一组分的含量结果如下：大豆苷元0.1212mg/g、黄豆黄素0.01851mg/g、染料木素0.2382mg/g。
[0168]
4.2试样中大豆异黄酮总含量，按公式(2)计算：
[0169]
x＝x1+x2+x3ꢀꢀꢀ
(2)
[0170]
式中：
[0171]
x——试样中大豆异黄酮总含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0172]
x1——试样大豆苷元的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0173]
x2——试样黄豆黄素的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0174]
x3——试样染料木素的含量，单位为毫克每克(mg/g)或毫克每毫升(mg/ml)；
[0175]
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字(或小数点后两位)。
[0176]
将步骤4.1中的结果代入公式(2)，得到试样中大豆异黄酮总含量为0.3779mg/g。
[0177]
5精密度
[0178]
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。
[0179]
以三款样品测定为例：
[0180]
表3试样中大豆异黄酮测定结果
[0181][0182]a基于平行测定六份样品的相对标准偏差
[0183]
实施例2水解条件的选择
[0184]
葡萄糖苷酶对大豆异黄酮的水解效果：β-葡萄糖苷酶(ec 3.2.1.21)又称葡萄糖水解酶，通过糖苷化和去糖苷化的双取代机制能高效地水解苷类化合物分子中非还原性末端的葡萄糖基，使苷转变为苷元，如图6所示。因而β-葡萄糖苷酶被广泛用于食品工业的水解工艺中。
[0185]
水解实验的方法如下：通过实验条件优化，确认杏仁来源的葡萄糖苷酶在ph＝5，温度为50℃的条件下酶活力最佳。在此条件下，使用经80％甲醇提取的样品溶液1ml与含5个活性单位β-葡萄糖苷酶的醋酸盐缓冲液4ml混匀后进行水解，加入甲醇稀释后，以质谱法检测，通过对比不同时间酶解后的各类大豆异黄酮苷质谱响应值变化来计算水解率。水解率(％)＝100％-(酶解后各类异黄酮苷的质谱绝对响应值/未经酶解处理的样品中各类异黄酮苷的质谱绝对响应值)。
[0186]
通过水解实验的对比，如表4所示，杏仁来源的葡萄糖苷酶对于丙二酰类及乙酰类的大豆异黄酮苷水解活性相对较弱，其原因可能为该类异黄酮苷糖基上的乙酰基及丙二酰基侧链对酶的亲核取代形成了空间位阻作用，阻碍了糖基-酶共价中间体的生成进而无法迅速释放苷元。如果先以化学水解反应使葡萄糖基上的丙二酰基及乙酰基脱去，则可以通过使用较少的酶量并在相对较短的时间内将普通大豆异黄酮苷水解成相应的苷元，从而实现样品中总异黄酮的检测。
[0187]
表4杏仁来源葡萄糖苷酶对12种大豆异黄酮的水解率(％)
[0188][0189]
由于丙二酰类及乙酰类大豆异黄酮苷分子中的酯键在碱性条件下易发生水解，当在80％甲醇溶液中含有0.3％氢氧化钠时，超声提取20min后乙酰类大豆异黄酮苷分子上的乙酰基基本被完全水解，达到99.8％以上(图7-a)；同时，在此条件下，丙二酰类大豆异黄酮
苷的丙二酰基也发生了水解，达到了99.6％以上(图7-b)。同时，当丙二酰及乙酰类大豆异黄酮苷发生水解时，样品中的异黄酮苷相较于直接用80％提取的样品，其响应值明显上升(图8-a)，说明在碱性条件下丙二酰及乙酰类大豆异黄酮苷均被水解转化成了相应的异黄酮苷；同时，样品中原来存在的各类大豆异黄酮苷元在不同的碱性浓度条件下，其响应值与80％甲醇提取条件下获得的响应值对比发现基本无差异(图8-b)，6个不同提取溶剂下获得的响应值rsd均小于2％，说明样品中的大豆异黄酮苷元在不同浓度碱的提取条件下均未发生降解且保持稳定。
[0190]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、待测样品使用碱性甲醇溶液进行提取处理，得提取液；s2、所述提取液中加入β-葡萄糖苷酶进行酶解，实现转化后加入纯甲醇混合溶解，得测试液；s3、所述测试液经超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱进行检测，获得待测样品中异黄酮类化合物的含量，所述异黄酮类化合物包括大豆苷元、黄豆黄素及染料木素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述碱性甲醇溶液为含有3g/l氢氧化钠的80％甲醇水溶液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述提取处理包括：含总大豆异黄酮50-500ug的待测样品，加入80ml碱性甲醇溶液，超声提取20分钟后，加入4ml冰醋酸并用80％甲醇溶液定容至100ml。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述待测样品中异黄酮总量以苷元计为50-500μg。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2具体包括，所述提取液1体积当量与4体积当量含5个活性单位葡萄糖苷酶的醋酸缓冲液混匀，在50℃水浴条件下振摇酶解120min，冷却，用纯甲醇定容至10体积当量。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述醋酸缓冲液的浓度为0.1mol/l,ph＝5.0。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述酶解后样品溶液用0.2μm的聚丙烯(pp)滤头过滤后备用。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，所述超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱中的液相色谱的检测条件包括：色谱柱：c18柱，50mm
×
2.1mm，1.8μm，或等效亚2微米超高效色谱柱。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，所述高效液相色谱-串联三重四级杆质谱中的质谱条件包括：电喷雾离子源、esi
+
正离子。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，所述超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱采用多重反应监测(mrm)模式，所述异黄酮类化合物的选择离子参数条件包括：大豆苷元，保留时间为9
±
0.5min，母离子255.1m/z，子离子199.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量26v；黄豆黄素，保留时间为10
±
0.5min，母离子285.1m/z，子离子270.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量30v；染料木素，保留时间为12
±
0.5min，母离子271.1m/z，子离子215.1m/z，毛细管加速电压4v，碰撞能量30v。

技术总结
本发明公开了一种食品中大豆异黄酮总量的测定方法，通过碱性条件下提取，结合葡萄糖苷酶的水解作用，实现了样品中各类大豆异黄酮苷到相应苷元的定量转化；通过应用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法，实现了样品中低浓度大豆异黄酮的测定并有效缩短检测周期，方法学研究表明，本方法具有较低的检出限及较高的准确度。由于本发明仅通过3种大豆异黄酮苷元就实现了样品中12种大豆异黄酮总量的测定，标准品的使用费用在原先需要最少使用6种异黄酮标准品的基础上减少为仅为原来的1/3。此外，总大豆异黄酮以苷元计，一方面能更准确地体现实际生物活性水平，另一方面也可以避免因使用苷或苷元的不统一而造成总异黄酮结果表述的不一致。一致。一致。


技术研发人员：沈晓芳 顾文 庞月红
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2023.04.24
技术公布日：2023/8/4