一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒、细胞系及其应用的制作方法

一种欧洲海鲈npffr2重组质粒、细胞系及其应用
技术领域
1.本发明属于海洋生物领域，具体涉及一种欧洲海鲈npffr2重组质粒、细胞系及其应用。


背景技术：

2.欧洲海鲈（dicentrarchuslabrax），或称欧洲舌齿鲈，是舌齿鲈属下的一种鱼类，在淡水和咸水中都可以存活，其生长速度快，抗病能力强，肉质鲜美，是欧洲重要的经济鱼类之一，广泛分布于大西洋东部、地中海和黑海以及欧洲的湖泊河流中。
3.npff是rfa家族成员之一，与gnih起源于同一祖先基因，能够调节脊椎动物的摄食过程。欧洲海鲈npff基因编码npff和npaf两种成熟肽，gnih基因编码gnih1和gnih2两种成熟肽，但这些神经肽在鱼类摄食调控中的作用及其分子机制尚不清楚。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种欧洲海鲈npffr2重组质粒，该重组质粒的建立能够为阐明鱼类npff作用机制提供技术支撑。
5.本发明的另一目的是提供了上述欧洲海鲈npffr2重组质粒与其他神经内分泌因子之间信号互作的应用。
6.本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：本发明提供了一种欧洲海鲈npffr2重组质粒，含有欧洲海鲈npffr2-1基因和npffr2-2基因；所述npffr2-1基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述npffr2-2基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
7.进一步的，所述npffr2-1的蛋白基因序列如seq id no：3所示；所述npffr2-2蛋白基因序列如seq id no：4所示。
8.本发明构建的重组质粒的表达载体为pcdna3.1；并且上下游两端含有hind iii和ecori的酶切位点，构建成含有编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的表达载体pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2。
9.本发明构建重组质粒过程中，所述npffr2-1的引物序列为：5
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cccaagcttatgacacagaatacggtt-3’（seq id no：5）5
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cggaattcctaaatctgggatacctt-3’（seq id no：6）所述npffr2-2的引物序列为：5
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cccaagcttatgaacgaaggacttgaa-3
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（seq id no：7）5
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cggaattctcaaatagacactgctgt-3
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（seq id no：8）。
10.本发明还提供了一种表达上述重组质粒的细胞系，将表达载体pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2转入cos-7中所形成的表达npffr2-1和npffr2-2蛋白的细胞系，pcdna3.1-npffr2-1-cos-7和pcdna3.1-npffr2-2-cos-7。
11.本发明还提供了一种上述细胞系在检测npffr2下游信号通路中的应用，包括以下步骤：（1）将细胞系接种在dmem液体培养基中，37℃，5%co2条件下培养过夜，吸掉旧的培养基后用pbs清洗细胞一次，按照每孔200 ng pcdna3.1-npffr2-1/pcdna3.1-npffr2-2、200 ng cre-luc和20 ng prl-tk的量进行细胞转染，随后继续37℃ 5%co2条件下培养过夜；（2）吸掉旧的培养基后用含有gnih1、gnih2、npff和npaf的多肽处理cos-7细胞6 h，然后用裂解液破碎细胞，收集上清，分别检测萤火虫萤光素酶活性和海参萤光素酶活性，进而分析npffr2-1和npffr2-2下游信号通路。
12.本发明的另一目的为提供了一种构建的重组质粒在用于分析同其他神经内分泌因子之间的信号互作机制中的应用。
13.本发明合成了编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的基因。合成的方法是常规的基因合成方法，根据欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2基因序列，合成两端含有hind iii和ecori酶切位点的欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2基因。
14.本发明构建了含有编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白基因的重组质粒。这个质粒的构建方法是按常规方法，利用合成欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的基因，经酶切和分离纯化后，接入到载体pcdna3.1的相应酶切位点（即hind iii和ecori）之间，即构建成所需的含有编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的表达载体pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2。
15.本发明还用上述含有编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的相应表达载体构建了能高效表达欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的cos-7细胞系。
16.本发明的上述能表达欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2的cos-7细胞系由含有编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的表达载体pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2转染cos-7而得到的细胞系，命名为pcdna3.1-npffr2-1-cos-7和pcdna3.1-npffr2-2-cos-7。
17.本发明还提供了利用cos-7表达欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的方法：将cos-7按照10万细胞/孔/毫升dmem培养基（dmem培养基含有10%fbs和1%青霉素/链霉素）的密度种在24孔板中，37℃ 5%co2条件下培养过夜。吸掉旧的培养基后用pbs清洗细胞一次，按照每孔200 ng pcdna3.1-npffr2-1/pcdna3.1-npffr2-2、200 ng cre-luc和20 ng prl-tk的要求进行细胞转染，随后继续37℃ 5%co2条件下培养过夜。
18.本发明还提供了利用上述表达欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2的细胞系检测npffr2下游信号通路的方法。将cos-7细胞系接种在dmem液体培养基中，37℃，5%co2条件下培养过夜，吸掉旧的培养基后用pbs清洗细胞一次，按照每孔200 ng pcdna3.1-npffr2-1/pcdna3.1-npffr2-2、200 ng cre-luc和20 ng prl-tk的量进行细胞转染，随后继续37℃ 5%co2条件下培养过夜。吸掉旧的培养基后用1 μm gnih1、gnih2、npff和npaf的多肽处理cos-7细胞6 h，然后用裂解液破碎细胞，收集上清，使用双萤光素酶检测试剂盒 dual-glo
®
luciferase assay system分别检测萤火虫萤光素酶活性和海参萤光素酶活性，进而分析npffr2-1和npffr2-2下游信号通路。
19.欧洲海鲈具有重要的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的欧洲海鲈pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2重组质粒，研究npff的信号转导机制以及与
其他神经内分泌因子之间的信号互作机制。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首次扩增编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的基因，并将该基因构建重组质粒，利用细胞转染和双萤光素酶报告系统可以用于研究npff的信号转导机制以及与其他神经内分泌因子之间的信号互作机制。
附图说明
21.图1是pcdna3.1表达载体。
22.图2是npffr2-1和npffr2-2的pcr产物双酶切（hind iii和ecori）鉴定凝胶电泳分析图，其中，m：marker。
23.图3是pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2菌液pcr产物电泳分析图，其中：m：marker。
24.图4是gnih1、gnih2、npff和npaf多肽降低了fsk诱导的表达欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2的cos-7细胞中cre-luc的活性；a是pcdna3.1-npffr2-1；b是pcdna3.1-npffr2-2。其中不同字母有显著性差异（p＜0.05）。
具体实施方式
25.下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步解释和说明，但不以任何形式限制本发明。
26.实施例1：含编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白基因的pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2重组质粒的构建用含有双酶切位点的特异性引物（seq id no：5-8）扩增欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2基因，将上述pcr产物纯化后和pcdna3.1载体分别用限制性内切酶hind iii和ecori双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后用isolate ii pcr and gel kit回收，分离纯化编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2基因片段和pcdna3.1载体；用quick ligation kit 25℃连接5分钟构建pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2重组质粒。将该重组质粒转化大肠杆菌细胞，涂板，37℃培养过夜，挑取单个菌落扩培后进行菌液pcr验证。用endo-free plasmid dna mini kit i提取重组质粒后送测序。图1是pcdna3.1表达载体；欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2基因双酶切分析图和菌液pcr产物琼脂糖凝胶电泳图分别见图2和图3。
27.实施例2：能高效表达欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的cos-7细胞系的构建将cos-7按照10万细胞/孔/毫升dmem培养基（dmem培养基含有10%fbs和1%青霉素/链霉素）的密度种在24孔板中，37℃ 5%co2条件下培养过夜。吸掉旧的培养基后用pbs清洗细胞一次，按照每孔200 ng pcdna3.1-npffr2-1/pcdna3.1-npffr2-2、200 ng cre-luc和20 ng prl-tk的量用lipofectamine 3000进行细胞共转染，随后继续37℃ 5%co2条件下培养过夜。
28.实施例3：利用能高效表达欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的cos-7细胞系研究npff信号通路吸掉旧的培养基后用含有gnih1、gnih2、npff和npaf的多肽处理cos-7细胞6 h，
fsk作为阳性对照。然后用裂解液破碎细胞，收集上清，使用双萤光素酶检测试剂盒分别检测萤火虫萤光素酶活性和海参萤光素酶活性，进而分析npffr2-1和npffr2-2下游pka信号通路。结果见图4。

技术特征：
1.一种欧洲海鲈npffr2重组质粒，其特征在于，含有欧洲海鲈npffr2-1基因和npffr2-2基因；所述npffr2-1基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述npffr2-2基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。2.根据权利要求1所述的欧洲海鲈npffr2重组质粒，其特征在于，所述npffr2-1的蛋白基因序列如seq id no：3所示；所述npffr2-2蛋白基因序列如seq id no：4所示。3.根据权利要求1或2所述的欧洲海鲈npffr2重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体为pcdna3.1；并且上下游两端含有hind iii和ecori的酶切位点，构建成含有编码欧洲海鲈npffr2-1和npffr2-2蛋白的表达载体pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2。4.根据权利要求3所述的欧洲海鲈npffr2重组质粒，其特征在于，所述npffr2-1的引物序列为：5
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cccaagcttatgacacagaatacggtt-3’，如seq id no：5所示5
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cggaattcctaaatctgggatacctt-3’， 如seq id no：6所示所述npffr2-2的引物序列为：5
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cccaagcttatgaacgaaggacttgaa-3
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，如seq id no：7所示5
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cggaattctcaaatagacactgctgt-3
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，如seq id no：8所示。5.一种表达权利要求4所述的重组质粒的细胞系，其特征在于，将表达载体pcdna3.1-npffr2-1和pcdna3.1-npffr2-2转入cos-7中所形成的表达npffr2-1和npffr2-2蛋白的细胞系，pcdna3.1-npffr2-1-cos-7和pcdna3.1-npffr2-2-cos-7。6.一种权利要求5所述的细胞系在检测npffr2下游信号通路中的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）将细胞系接种在dmem液体培养基中，37℃，5%co2条件下培养过夜，吸掉旧的培养基后用pbs清洗细胞一次，按照每孔200 ng pcdna3.1-npffr2-1/pcdna3.1-npffr2-2、200 ng cre-luc和20 ng prl-tk的量进行细胞转染，随后继续37℃ 5%co2条件下培养过夜；（2）吸掉旧的培养基后用含有gnih1、gnih2、npff和npaf的多肽处理cos-7细胞6 h，然后用裂解液破碎细胞，收集上清，分别检测萤火虫萤光素酶活性和海参萤光素酶活性，进而分析npffr2-1和npffr2-2下游信号通路。7.一种如权利要求1-4任一项所述的重组质粒在用于分析同其他神经内分泌因子之间的信号互作机制中的应用。

技术总结
本发明属于海洋生物领域，具体涉及一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒、细胞系及其应用。所述欧洲海鲈NPFFR2重组质粒含有欧洲海鲈NPFFR2-1基因和NPFFR2-2基因；本发明首次扩增编码欧洲海鲈NPFFR2-1和NPFFR2-2蛋白的基因，并将该基因构建重组质粒，利用细胞转染和双萤光素酶报告系统可以用于研究NPFF的信号转导机制以及与其他神经内分泌因子之间的信号互作机制。及与其他神经内分泌因子之间的信号互作机制。及与其他神经内分泌因子之间的信号互作机制。


技术研发人员：王滨
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黄海水产研究所
技术研发日：2023.03.15
技术公布日：2023/8/4