高纯度β烟酰胺单核苷酸（NMN）及其制造方法与流程

高纯度
β
烟酰胺单核苷酸(nmn)及其制造方法
技术领域
1.本发明涉及高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)及其制造方法。


背景技术：

2.近年来，将老化看作一种疾病并进行治疗，由此正在积极地进行意图延缓老化的到来本身的抗衰老医学的领域(antiaging)的研究。抗衰老医学覆盖内分泌、代谢、动脉硬化、营养、运动器官、感觉器官等大范围的领域，另外不是仅以老年人为对象，而是以所有年代的人为对象，目标是以比自己的目前年龄更年轻的身体功能来延长健康地度过的时间。
3.烟酰胺单核苷酸(nmn)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)的合成中间体。近年来，查明nmn通过向nad+的变换来控制长寿基因“乙酰化酶(sirtuin)”的活性，当向小鼠施用nmn时即显示出抗老化作用，作为抑制老化的物质受到关注(参照非专利文献1～3)。已知nmn本来是体内自然地生成的物质，然而随着衰老在体内的生成能力降低。因此，正在开发包含此种nmn的用于抗衰老的功能性食品、医药品等。
4.包含nmn的用于抗衰老的功能性食品、医药品等由于是长时间摄取的物质，因此重要的是不仅抗老化效果优异，而且安全性高。特别是在摄取配合有杂质多的nmn的产品的情况下，对于会给身体带来何种不良影响仍有很多不清楚的部分，因此认为nmn最好为尽可能纯度高、杂质的含量少的物质。
5.作为nmn的制造方法，已知有分离出烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)过表达的细胞(酵母、细菌等)、将该细胞在烟酰胺(nam)的存在下进行培养而制造nmn的方法(参照专利文献1)；以烟酰胺(nam)、atp及核糖为原料、在烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)、核糖磷酸焦磷酸激酶及核糖激酶的催化作用下使之反应而制造nmn的方法(参照专利文献2)等。
6.现有技术文献
7.专利文献
8.专利文献1：国际公开2015/069860号
9.专利文献2：国际公开2017/185549号
10.非专利文献
11.非专利文献1：yoshino，j.，mills，k.f.，yoon，m.j.，&imai，s.(2011)cell metab.，14，528-536
12.非专利文献2：gomes，a.p.et.al，(2013)cell，155，1624-1638
13.非专利文献3：stein，l.r.&imai，s.(2014)embo j.，33，1321-1340


技术实现要素：

14.发明所要解决的课题
15.本发明是鉴于该状况而完成的，本发明的课题在于，提供一种纯度高、并且杂质的含量少的nmn。
16.用于解决课题的手段
17.本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，其结果是，在nmn的制造方法中，加入使用了动态轴向压缩柱(dac柱)等的工序等，由此成功地制造出纯度为99.0质量％以上、并且作为杂质的c
11h15
no9p、c
10h16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10h15
n5o7p以及c
21h27
n6o
15
p2的含量为检测限以下的高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)。即，本发明的主旨如下所示。
18.[1]一种高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)，其纯度为99.0质量％以上，并且作为杂质的c
11h15
no9p、c
10h16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10h15
n5o7p以及c
21h27
n6o
15
p2的含量为检测限以下。
[0019]
[2]一种医药组合物，其含有[1]中记载的高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)作为有效成分。
[0020]
[3]一种防老化用组合物，其含有[1]中记载的高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)作为有效成分。
[0021]
[4]一种高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)的制造方法，其包括：
[0022]
(i)使amp核苷酶、核糖磷酸二磷酸激酶、一磷酸腺苷(amp)、三磷酸腺苷(atp)以及核糖-5-磷酸(r5p)反应的工序、
[0023]
(ii)使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)、上述工序(i)的反应产物、烟酰胺(nam)反应的工序、
[0024]
(iii)将上述工序(ii)的反应产物利用离子交换柱纯化的工序、以及
[0025]
(iv)使上述工序(iii)的纯化产物通过动态轴向压缩柱(dac柱)的工序。
[0026]
发明效果
[0027]
根据本发明，可以提供一种高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)，其纯度为99.0质量％以上，并且作为杂质的c
11h15
no9p、c
10h16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10h15
n5o7p以及c
21h27
n6o
15
p2的含量为检测限以下。像本发明的高纯度βnmn那样高度纯化到无法检测出杂质的水平的nmn以往并不存在。本发明的高纯度βnmn不仅发挥优异的抗老化效果，而且杂质为检测限以下，因此安全性也高。由此，即使长时间摄取，也不用担心对身体带来不良影响。另外，本发明的高纯度βnmn还起到与以往的nmn相比稳定性也优异的预想之外的效果。基于以上的结果，本发明的高纯度βnmn可以合适地用于以抗衰老为目的的功能性食品、医药品、准医药品等。
附图说明
[0028]
图1是本发明的高纯度βnmn及2种市售的nmn的lc色谱图。
[0029]
图2是本发明的高纯度βnmn及2种市售的nmn的lc色谱图(放大)。
[0030]
图3是成分7的质谱及产物离子光谱(本发明的高纯度βnmn)。
[0031]
图4是成分2的质谱及产物离子光谱(市售品a)。
[0032]
图5是成分5的质谱及产物离子光谱(市售品a)。
[0033]
图6是成分7的质谱及产物离子光谱(市售品a)。
[0034]
图7是成分1的质谱及产物离子光谱(市售品b)。
[0035]
图8是成分2的质谱及产物离子光谱(市售品b)。
[0036]
图9是成分3的质谱及产物离子光谱(市售品b)。
[0037]
图10是成分4的质谱及产物离子光谱(市售品b)。
[0038]
图11是成分6的质谱及产物离子光谱(市售品b)。
[0039]
图12是成分7的质谱及产物离子光谱(市售品b)。
[0040]
图13是成分8的质谱及产物离子光谱(市售品b)。
[0041]
图14是成分8的质谱及产物离子光谱(市售品b)。
具体实施方式
[0042]
以下，对本发明进行详细说明。需要说明的是，本说明书中使用的术语只要没有特别提及，就是以该技术领域中通常使用的含义来解释。
[0043]
[高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)]
[0044]
本发明中，烟酰胺单核苷酸(化学式：c
11h15
n2o8p)是以下述结构式表示的化合物，一般称作nmn(nicotinamide mononucleotide)，作为参与辅酶nad+的生物合成的中间代谢物为人所知。在机体内，在基于肝脏组织的nad代谢途径、即经过犬尿氨酸途径从喹啉酸朝向烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的合成的途径中产生。在机体内，在以色氨酸作为起始物质的情况下，色氨酸经过作为色氨酸代谢途径的犬尿氨酸途被变换为喹啉酸(qa)，进而变为烟酸单核苷酸(namn)。另一方面，在以烟酸(na)作为起始物质的情况下，烟酸被直接变换为namn。其后，namn经过烟酸腺嘌呤二核苷酸(naad)通过nad循环被与nad、烟酰胺(nam)、烟酰胺单核苷酸相互地变换。烟酰胺(nam)由烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)变换为烟酰胺单核苷酸，然后烟酰胺单核苷酸由烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nmnat)变换生成nad。需要说明的是，由烟酰胺核苷(nr)也产生烟酰胺单核苷酸。在烟酰胺单核苷酸中作为光学异构体存在α体、β体这2种，本发明中使用具有抗老化作用的β体。
[0045]
[化1]
[0046][0047]
本发明的高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)的纯度为99.0质量％以上，并且作为杂质的c
11h15
no9p、c
10h16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10h15
n5o7p以及c
21h27
n6o
15
p2的含量为检测限以下。此前在市场上销售很多包含冠以高纯度的nmn的营养辅助食品等，但作为原料使用的nmn均在作为主成分的nmn以外还含有以上述化学式表示的杂质的任意者。在本发明的高纯度βnmn中，以上述化学式表示的杂质为检测限以下。
[0048]
nmn的纯度(％)通过利用基于lc-uv的面积百分率法(高效液相色谱-紫外线吸收分光法)或定量nmr法(核磁共振分光法)进行主成分的绝对含量的算出来算出。
[0049]
在基于lc-uv的面积百分率法中，将适量的nmn试样溶解于水中，例如使用lc-30ad(岛津制作所公司制)等装置在检测波长266nm进行lc-uv测定。可以将所得的试样的色谱图的峰的合计面积当中主成分所占的比例(％)设为βnmn的纯度(％)。
[0050]
在定量nmr法中，将nmn试样和内标物用适量的重水溶解，使用例如ft-nmr装置jnm-eca400型(jecl resonance公司制)等，在共振频率：1h；400mhz、测定模式：1h nmr、溶
剂：重水、内标物(is)：二甲砜、基准物质：is来源信号；3.16ppm的条件下进行nmr测定。可以将根据1h nmr谱图使用下式算出的值设为纯度(％)。
[0051]
pa＝sa/ss×ns
/na×
ma/ms×ms
/ma×
ps[0052]ss
：内标物的积分值
[0053]
sa：试验物质的积分值
[0054]ns
：内标物的质子数(6)
[0055]
na：试验物质的质子数(1)
[0056]ms
：内标物的分子量(94.13)
[0057]
ma：试验物质的分子量(334.22)
[0058]ms
：内标物的称量值(mg)
[0059]
ma：试验物质的称量值(mg)
[0060]
ps：内标物的纯度(％)
[0061]
pa：试验物质的纯度
[0062]
本发明的高纯度βnmn的纯度为99.0质量％以上，虽然只要利用基于lc-uv的面积百分率法(高效液相色谱-紫外线吸收分光法)或定量nmr法(核磁共振分光法)的任一测定方法算出为99.0质量％以上即可，然而优选利用两者的测定方法算出为99.0质量％以上。
[0063]
nmn所含有的杂质的测定、分析利用lc-ms及lc-ms/ms进行。使用的装置等没有限定，例如可以使用lc-30ad(岛津制作所公司制)、qexactive plus(thermo fisher scientific)等，在检测波长266nm、测定质量范围m/z 100～1500的条件下进行。
[0064]
上述测定、分析的结果是，在本发明的高纯度βnmn中，以c
11h15
no9p、c
10h16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10h15
n5o7p以及c
21h27
n6o
15
p2的化学式表示的物质为检测限以下。通过将这些物质充分地除去，可以形成作为主成分的nmn的含量足够高、杂质的含量得到无限抑制的本发明的高纯度βnmn。这些物质被认为是nmn的制造工序中的原料物质、中间体、分解物等，能够利用上述测定、分析方法确定的化学式如上所示，然而各自的推定结构如下所示。各成分的编号对应于实施例的表3中所示的物质。
[0065]c11h15
no9p：成分no.2
[0066]
[化2]
[0067]
[0068]c10h16
n5o
10
p2：成分no.5
[0069]
[化3]
[0070][0071]
c9h
15
n3o8p：成分no.1
[0072]
[化4]
[0073][0074]
c9h
15
n3o7p：成分no.3
[0075]
[化5]
[0076][0077]
c9h
16
n4o8p：成分no.4
[0078]
[化6]
[0079][0080]c10h15
n5o7p：成分no.6
[0081]
[化7]
[0082][0083]c21h27
n6o
15
p2：成分no.8
[0084]
[化8]
[0085][0086]
本发明的高纯度βnmn不仅抗老化作用优异，而且有望对于阿尔茨海默病、心力衰竭等疾病的预防、症状的改善有效果。对于此种本发明的高纯度βnmn，期待作为功能性食品、医药品、化妆品等的成分的用途。本发明还包括含有上述的高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)作为有效成分的医药组合物。另外，本发明还包括含有上述的高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)作为有效成分的防老化用组合物。
[0087]
本发明的医药组合物、防老化用组合物可以用于医药品、准医药品、食品、功能性食品等中。此种本发明的组合物可以在包含上述的本发明的高纯度βnmn的基础上，还在不损害本发明的效果的范围中，根据用途及形态包含其他成分。
[0088]
作为上述其他成分，可以举出药学上容许的载体、添加物等。作为此种载体、添加物，例如可以举出水、张度剂、增稠剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、ph调节剂、稳定化剂、螯合剂、油性基剂、凝胶基剂、表面活性剂、悬浮化剂、结合剂、赋形剂、润
滑剂、崩解剂、发泡剂、流化剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清凉剂等，然而并不限定于它们。
[0089]
本发明的组合物所包含的高纯度βnmn的量可以根据用途及形态恰当地调整，然而通常为0.1重量％～100重量％，可以为1重量％～95重量％、1重量％～90重量％、1重量％～85重量％、1重量％～80重量％、2重量％～75重量％。若考虑与制剂的稳定性、易操作性的有效的兼顾，则优选为1重量％～85重量％，更优选为1重量％～80重量％，进一步优选为2重量％～75重量％。
[0090]
本发明的组合物可以经口或非经口地、全身或局部地施用。作为施用途径，可以举出基于经口、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、髓腔内、脑室内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、局部、舌下、直肠等的施用等。它们当中，经口、静脉内、肌肉内以及皮下可以作为优选的施用途径举出。
[0091]
本发明的组合物可以通过将本发明的高纯度βnmn与药学上容许的载体和/或赋形剂等利用常法进行混合等而制备后制成制剂。
[0092]
作为将本发明的组合物作为医药品、准医药品提供时的剂型，可以举出片剂(包括糖衣片)、胶囊剂、颗粒剂、散剂、含片剂、咀嚼剂、丸剂、内用水剂、乳剂、糖浆剂、悬浮剂、酏剂等经口剂；软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、贴剂等外用剂、注射剂(例如皮下注射剂、静脉内注射剂、肌肉内注射剂、腹腔内注射剂)、点滴剂、栓剂等非经口剂等。另外，在将本发明的组合物作为食品、功能性食品提供的情况下，可以是通常的食品的形态，也可以以胶囊剂、颗粒剂、散剂、含片剂、咀嚼剂、丸剂、内用水剂、乳剂、糖浆剂、悬浮剂、酏剂等形态制成营养辅助食品等。
[0093]
本发明的组合物可以合适地用于身体活动的降低、睡眠质量的降低、认知功能的降低、葡萄糖代谢的降低、视觉的降低、ii型糖尿病、肥胖、伴随着年龄增长的肥胖、伴随着年龄增长的血脂水平的增加、伴随着年龄增长的胰岛素敏感性的降低、伴随着年龄增长的记忆功能的丧失或降低、伴随着年龄增长的眼功能的丧失或降低、伴随着年龄增长的生理的功能降低、葡萄糖刺激性胰岛素分泌的障碍、i型糖尿病、线粒体功能的改善、神经坏死、阿尔茨海默病、心肌缺血、再灌注障碍、神经干细胞/神经前驱细胞集团的维持、损伤后的骨格肌的线粒体功能及动脉功能的恢复、肌肉疾患(伴随着肌肉脆弱性、肌肉萎缩、肌力降低的疾病，具体而言是肌肉减少症、肌力减少症、恶病质、肌营养不良、肌肉强直性障碍、脊髓性肌肉萎缩症、肌病)等。
[0094]
本发明的组合物的施用量需要与需要治疗的患者、需要改善的受试体的状况匹配地确定，施用量及施用次数可以以充分地发挥高纯度βnmn的效果的方式来调节。在本发明的实施方式中，本发明的组合物每1天作为用量如下施用，即，以高纯度βnmn的量计为1mg～10g，优选为10mg～5g，更优选为50mg～1g，进一步优选为100mg～1g，特别优选为200mg～600mg。
[0095]
本发明的组合物施用的对象为哺乳类，优选为人、马、牛、狗、猫等，更优选为人。
[0096]
[高纯度βnmn的制造方法]
[0097]
本发明也包括高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)的制造方法，其包括：(i)使amp核苷酶、核糖磷酸二磷酸激酶、一磷酸腺苷(amp)、三磷酸腺苷(atp)以及核糖-5-磷酸(r5p)反应的工序、(ii)使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)、上述工序(i)的反应产物、烟酰胺(nam)反
应的工序、(iii)将上述工序(ii)的反应产物利用离子交换柱纯化的工序、以及(iv)使上述工序(iii)的纯化产物通过动态轴向压缩柱(dac柱)的工序。本发明的制造方法优选在包括上述工序的基础上还包括(v)将上述工序(iv)的纯化产物结晶化的工序。根据本发明的方法，可以制造如上所述的纯度为99.0质量％以上、并且作为杂质的c
11h15
no9p、c
10h16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10h15
n5o7p以及c
21h27
n6o
15
p2的含量为检测限以下的高纯度βnmn。
[0098]
以下，对于本发明的高纯度βnmn的制造方法，按照进行各工序的实施方式进行详细说明。但是，本发明的制造方法也可以利用在不脱离本发明的主旨的范围中恰当地改变具体记载如下的各工序后的实施方式来进行。
[0099]
《工序(i)》
[0100]
本工序是使amp核苷酶、核糖磷酸二磷酸激酶、一磷酸腺苷(amp)、三磷酸腺苷(atp)以及核糖-5-磷酸(r5p)反应的工序。作为本工序的反应产物的磷酸核糖二磷酸(prpp)被用于工序(ii)的反应中。
[0101]
(amp核苷酶)
[0102]
amp核苷酶(ec3.2.2.4)是催化以下的化学反应的酶。该酶被分类为水解酶、特别是分解n-葡糖基化合物的糖苷酶。系统名为amp磷酸核糖水解酶(amp phosphoribohydrolase)。有时也被称作腺苷酸核苷酶等。
[0103]
[化9]
[0104][0105]
(核糖磷酸二磷酸激酶)
[0106]
核糖磷酸二磷酸激酶(ec2.7.6.1)也被称作核糖磷酸焦磷酸激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶。除此以外还被称作ppribp合成酶(ppribpsynthetase)；焦磷酸核糖-p-合成酶(pp-ribose p synthetase)；5-磷酰核糖-1-焦磷酸盐合成酶(5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate synthetase)；5-磷酰核糖焦磷酸化酶(5-phosphoribose pyrophosphorylase)；5-磷酸核糖-1α-焦磷酸合成酶(5-phosphoribosyl-alpha-1-pyrophosphate synthetase)；磷酸核糖二磷酸合成酶(phosphoribosyl-diphosphate synthetase)；磷酸核糖焦磷酸合成酶(phosphoribosylpyrophosphate synthase)；焦磷酸核糖磷酸合成酶(pyrophosphoribosylphosphate synthetase)；核糖磷酸焦磷酸激酶(ribophosphate pyrophosphokinase)；5-磷酸核糖焦磷酸激酶(ribose-5-phosphate pyrophosphokinase)等。是催化以下的化学反应的酶。涉及具有嘌呤、嘧啶的核苷酸、作为辅助因子的nad及nadp、组氨酸、色氨酸之类的氨基酸的合成。是将来自于磷酸戊糖途径的核糖-5-磷酸转向这些合成体系的酶。
[0107]
[化10]
[0108][0109]
本工序中使用的上述酶只要是能够催化各自的目标反应的酶，则可以是天然型的酶，也可以是通过改变天然型的酶的氨基酸序列而制作的、优选提高了表达量、酶活性的突变型的酶。另外，出于纯化的简化、可溶性表达的促进、基于抗体的检测等目的，可以对各酶附加各种标签(蛋白质或肽)。作为标签的种类，可以举出his标签(组氨酸标签)、strep(ii)
标签、gst标签(谷胱甘肽-s-转移酶标签)、mbp标签(麦芽糖结合蛋白标签)、gfp标签(绿色荧光蛋白标签)、sumo标签(smallubiquitin-related(like)modifier标签)、flag标签、ha标签、myc标签等。此外，上述酶也可以使用彼此作为融合蛋白表达的酶。
[0110]
本工序中使用的上述酶优选为为了提高反应效率而固定化于载体等的酶。固定化的方法没有特别限定，例如可以利用以下的方法进行。
[0111]
将核糖磷酸二磷酸激酶(核糖磷酸焦磷酸激酶)以及amp核苷酶分别用酶清洗缓冲液(0.02m tris-hc1/0.001m edta溶液、ph7.0)稀释为5～10mg/ml的蛋白质含量，将等量的酶稀释液与pb溶液(2.0mol/l磷酸二氢钾、ph7.5)混合，添加环氧lx-3000型(酶50mg/载体1g)等酶固定化载体并在25℃用搅拌器(150rpm的转速)使之反应20小时。反应结束后，将反应液用过滤袋过滤，用酶清洗缓冲液清洗5～6次，可以得到固定化核糖磷酸二磷酸激酶(核糖磷酸焦磷酸激酶)、固定化amp核苷酶。
[0112]
本工序的具体方式的一例如下所示。准备包含0.1mm～200mm的atp、0.1mm～300mm的amp、0.1mm～100mm的mgcl2、0.1mm～100mm的kcl、10～200mm的tris-hcl缓冲液的基质溶液，添加到反应釜中并调整为ph6.5～8.5，优选调整为ph7.0～7.5。向其中添加amp核苷酶及核糖磷酸二磷酸激酶，使它们均达到0.1g/l～200g/l，以50rpm的速度在30～50℃、优选在35℃～40℃、更优选在37℃的条件下搅拌而使之反应。1～8小时后，使反应液结束反应，前进到第ii工序。
[0113]
《工序(ii)》
[0114]
本工序是使烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)、上述工序(i)的反应产物、烟酰胺(nam)反应的工序。利用本工序，可以得到nmn的粗产物溶液。
[0115]
(烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt))
[0116]
已知nampt(ec2.4.2.12)一般参与nad(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)补救途径，本发明中，是为了由prpp及nam生成nmn的反应而利用的酶。在基于nampt的源于prpp和nam的nmn合成反应中，本来无需atp。但是，nampt具有atp水解活性，nampt因atp的水解而被自磷酸化，由此酶学参数、化学平衡转变为有利于nmn生成的方向，因此在本工序中可以添加atp。
[0117]
作为nampt，例如可以举出人(homo sapiens)来源的酶(np_005737)、小鼠(mus musculus)来源的酶(np_067499)、大鼠(rattusnorvegicus)来源的酶(np_808789)、斑马鱼(danio rerio)来源的酶(np_997833)、杜克雷嗜血杆菌(aar87771)、抗辐射奇异球菌(ae001890)、酒类酒球菌(kzd13878)、希瓦氏菌(np_717588)等细菌来源的酶。本工序中，优选使用细菌来源的酶。此处，所谓细菌，是不具有核膜的原核生物的一组，是包含大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等的生物组。
[0118]
本工序中使用的上述nampt只要是能够催化目标反应的酶，则可以是天然型的酶，也可以是通过改变天然型的酶的氨基酸序列而制作的、优选提高了表达量、酶活性的突变型的酶。另外，出于纯化的简化、可溶性表达的促进、基于抗体的检测等目的，可以对各酶附加各种标签。标签的种类如工序(i)中的说明所示。
[0119]
本工序中使用的上述nampt优选为为了提高反应效率而固定化于载体等的酶。固定化的方法如工序(i)中的说明所示。
[0120]
本工序的具体方式的一例如下所示。将上述工序(i)中得到的反应液转移到另外的反应釜中。添加各个成分，使得最终浓度为1～100mm的烟酰胺(nam)、1mm～100mm的
mgcl2、20～100mm的tris-hcl缓冲液。继而，添加nampt，使之为1～100g/l，以50rpm的速度在30℃～50℃、优选在35℃～40℃、更优选在37℃、维持为ph6左右，在ph6.5～8.5、优选在ph7.5～8.0的条件下一边搅拌一边反应1～8小时。过滤所得的反应液，前进到工序(iii)。利用本工序可以得到nmn的粗产物。
[0121]
《工序(iii)》
[0122]
本工序是将上述工序(ii)的反应产物利用离子交换柱纯化的工序。利用本工序可以从工序(ii)中得到的nmn的粗产物中得到纯度高的nmn。
[0123]
本工序的具体方式的一例如下所示。使上述工序(ii)中得到的滤液通过离子交换柱(deae-toypearl、monoq柱等)，回收经过纯化的溶液，进行纳米过滤，使所得的样品前进到工序(iv)。
[0124]
《工序(iv)》
[0125]
本工序是使上述工序(iii)的纯化产物通过动态轴向压缩柱(dac柱)而进行高压分离收集的工序。利用本工序，充分地除去杂质，得到纯度为99.0％以上的高纯度βnmn。
[0126]
作为本发明中使用的动态轴向压缩柱(dac柱)，没有特别限定，可以使用一般作为动态轴向压缩柱(dac柱)在市场上销售的色谱柱。作为此种装置的一例，可以举出dac300(beijing tong heng innovation technology co.，ltd.)等。向色谱柱中填充阴离子交换树脂或阳离子交换树脂后使用。
[0127]
使利用上述高压分离收集得到的高纯度βnmn通过脱色用色谱柱等，由此进行脱色，进而进行纳米过滤、浓缩，使所得的纯化产物前进到下一工序(v)。
[0128]
《工序(v)》
[0129]
本工序是将上述工序(iv)的纯化产物结晶化的工序。作为结晶化中使用的溶剂，优选乙醇。为了进一步提高纯度、除去杂质，优选利用同样的方法使之重结晶。利用本工序得到的纯化产物是纯度为99.0％以上、并且作为杂质的c
11h15
no9p、c
10h16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10h15
n5o7p以及c
21h27
n6o
15
p2的含量为检测限以下的高纯度βnmn。
[0130]
实施例
[0131]
以下，利用实施例对本发明进行更详细的说明，然而本发明不受它们的任何限定。
[0132]
1.高纯度βnmn的制造
[0133]
(1)酶的固定化
[0134]
将nampt、核糖磷酸二磷酸激酶(核糖磷酸焦磷酸激酶)以及amp核苷酶分别用酶清洗缓冲液(0.02m tris-hci/0.001m edta溶液、ph7.0)稀释为5～10mg/ml的蛋白质含量，将等量的酶稀释液与pb溶液(2.0mol/l磷酸二氢钾、ph7.5)混合，添加酶固定化载体环氧lx-3000型(酶50mg/载体1g)并在25℃、利用搅拌器(150rpm的转速)反应20小时。反应结束后，将反应液用过滤袋过滤，用酶清洗缓冲液清洗5～6次，得到固定化nampt、固定化核糖磷酸二磷酸激酶(核糖磷酸焦磷酸激酶)、固定化amp核苷酶。
[0135]
(2)第i工序
[0136]
准备包含15mm的atp、100mm的amp、10mm的mgcl2、10mm的kcl、70mm的tris-hcl缓冲液的基质溶液，添加到反应釜中并调整为ph7.0～7.5。向其中添加amp核苷酶及核糖磷酸二磷酸激酶，使二者均为20g/l，以50rpm的速度在35℃的条件下进行搅拌而使之反应。3小时后，使反应液结束反应，前进到第ii工序。
[0137]
(3)第ii工序
[0138]
将第i工序中得到的反应液转移到另外的反应釜中。添加各个成分，使得最终浓度为60mm烟酰胺(nam)、20mm mgcl2、100mm tris-hcl缓冲液。继而，添加nampt，使之为20g/l，以50rpm的速度、在35℃、ph7.5～8.0的条件下进行搅拌而使之反应。3小时后，结束反应并过滤反应液，前进到第iii工序。
[0139]
(4)第iii工序
[0140]
使第ii工序中得到的滤液通过离子交换柱(deae-toypearl、monoq柱等)，回收经过纯化的溶液。
[0141]
(5)第iv工序
[0142]
为了将第iii工序中得到的纯化溶液浓缩而进行纳米过滤，回收浓缩溶液。使回收的浓缩溶液通过作为动态轴向压缩柱的dac-300(beijing tong heng innovation technology co.，ltd.)，除去杂质。继而利用树脂进行脱色而得到脱色溶液。其后，对脱色溶液进行纳米过滤而浓缩。
[0143]
(6)第v工序
[0144]
将第iv工序中得到的纯化产物利用乙醇进行结晶化，得到粗产物。将粗产物再溶解，利用乙醇使之重结晶，冷冻干燥后，得到本发明的高纯度βnmn的粉末。
[0145]
2.高纯度βnmn的特性
[0146]
(1)高纯度βnmn的纯度
[0147]
利用基于lc-uv的面积百分率法(高效液相色谱-紫外线吸收分光法)及定量nmr法(核磁共振分光法)进行主成分的绝对含量的算出。
[0148]
基于lc-uv的面积百分率法中，将适量的上述(5)中得到的高纯度βnmn溶解于水中，在以下的条件下进行lc-uv测定。
[0149]
装置名：lc-30ad(岛津制作所公司制)
[0150]
检测波长：266nm
[0151]
将所得的试样的色谱图的峰的合计面积当中主成分所占的比例(％)设为βnmn的纯度(％)。其结果是，上述(5)中得到的高纯度βnmn的纯度为99.2％。
[0152]
定量nmr法中，将上述(5)中得到的高纯度βnmn和内标物用适量的重水溶解，在以下的条件下进行nmr测定。
[0153]
装置名：ft-nmr装置jnm-eca400型(jecl resonance公司制)
[0154]
共振频率：1h；400mhz
[0155]
测定模式：1h nmr
[0156]
溶剂：重水
[0157]
内标物(is)：二甲砜
[0158]
基准物质：is来源信号；3.16ppm
[0159]
将根据1h nmr谱图使用下式算出的值设为纯度(％)，其结果是，上述(5)中得到的高纯度βnmn的纯度为99.4％。
[0160]
pa＝sa/ss×ns
/na×
ma/ms×ms
/ma×
ps[0161]ss
：内标物的积分值
[0162]
sa：试验物质的积分值
[0163]ns
：内标物的质子数(6)
[0164]
na：试验物质的质子数(1)
[0165]ms
：内标物的分子量(94.13)
[0166]
ma：试验物质的分子量(334.22)
[0167]ms
：内标物的称量值(mg)
[0168]
ma：试验物质的称量值(mg)
[0169]
ps：内标物的纯度(％)
[0170]
pa：试验物质的纯度
[0171]
(2)稳定性
[0172]
调查将上述(5)中得到的高纯度βnmn在4℃、25℃、40℃保存时的稳定性。在每个条件下各准备3件各试样。利用基于lc-uv的面积百分率法测定出保存时、1个月后、2个月后、3个月后的各试样中的βnmn的纯度。将结果表示于下述表1中。
[0173]
[表1]
[0174][0175]
如表1所示，上述(5)中得到的高纯度βnmn在4℃、25℃、40℃的任一温度保存时，都可以维持3个月的99％以上的纯度。该结果表明，上述(5)中得到的高纯度βnmn的稳定性极为优异。
[0176]
作为比较例，将利用以往的方法(不进行本发明的第iv工序、第v工序的方法)制造的nmn的稳定性试验的结果表示于表2中。
[0177]
[表2]
[0178][0179]
如表2所示，利用以往的方法制造的nmn在4℃保存时，可以将保存开始时的纯度维持30天，然而在25℃(室温)保存时，纯度随时间推移而降低，在保存开始时为97.94％的样品在15天后为81.74％，30天后为65.66％。由该结果可知，利用本发明的制造方法得到的nmn与利用以往的方法制造的nmn相比，能够长时间维持高纯度，稳定性极为优异。
[0180]
(3)杂质含量
[0181]
对上述(5)中得到的本发明的高纯度βnmn、nmn的市售品a、nmn的市售品b测定出杂质的含量。具体而言，利用lc-ms及lc-ms/ms测定出这些nmn中含有的主成分(nmn)及杂质。分析条件如下所示。
[0182]
装置名：lc-30ad(岛津制作所公司制)
[0183]
检测波长：266nm
[0184]
ms装置：q exactive plus(thermo fisher scientific)
[0185]
测定质量范围：m/z 100-1500
[0186]
将所得的色谱图表示于图1中。对于作为分析对象的杂质从保持时间短的样品起依次附加编号(图2)。对于试样间共同的成分附加相同的编号(成分no.1～8)。将各试样的各峰的质谱及产物离子光谱表示于图3～图14中。将各成分(成分no.1～8)的精密质量及组成运算的结果表示于表3中。表中的n.d.表示该成分为检测限以下。
[0187]
[表3]
[0188][0189]
本发明的高纯度βnmn中，虽然作为主成分(nmn)以外的成分检测到no.7的烟酰胺(nam)，然而除此以外的杂质为检测限以下。另一方面，市售品a中，检测到no.2、no.5、no.7，市售品b中，检测到no.1、no.2、no.3、no.4、no.6、no.7、no.8。
[0190]
对本发明的高纯度βnmn、nmn的市售品a、nmn的市售品b，与上述同样地利用基于lc-uv的面积百分率法及定量nmr法进行主成分的绝对含量的算出。将结果表示于下述表4中。
[0191]
[表4]
[0192][0193]
本发明的高纯度βnmn无论在基于lc-uv的面积百分率法及定量nmr法的任一方法中进行测定，纯度都为99.0％以上，并且上述表3中记载的no.1～6、8的杂质都为检测限以下。如此所述，本发明的高纯度βnmn的纯度高，特定的杂质为检测限以下，由此可以认为，主成分的稳定性高，不仅在低温条件下，在室温条件、高于室温的温度条件下也长时间地保持高纯度，稳定性优异。
[0194]
产业上的可利用性
[0195]
根据本发明，可以提供一种高纯度β烟酰胺单核苷酸(nmn)，其纯度为99.0质量％以上，并且作为杂质的c
11h15
no9p、c
10h16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10h15
n5o7p以及c
21h27
n6o
15
p2的含量为检测限以下。像本发明的高纯度βnmn那样高度纯化到无法检测出杂质的水平的nmn在以往并不存在。本发明的高纯度βnmn不仅起到优异的抗老化效果，而且由于杂质为检测限以下，因此安全性也高。由此，即使长时间摄取，也不用担心对身体造成不良影响。另外，本发明的高纯度βnmn还起到与以往的nmn相比稳定性也优异的预想之外的效果。基于以上的情况，本发明的高纯度βnmn可以合适地用于以抗衰老为目的的功能性食品、医药品、准医药品等中。

技术特征：
1.一种高纯度β烟酰胺单核苷酸nmn，其纯度为99.0质量％以上，并且作为杂质的c
11
h
15
no9p、c
10
h
16
n5o
10
p2、c9h
15
n3o8p、c9h
15
n3o7p、c9h
16
n4o8p、c
10
h
15
n5o7p以及c
21
h
27
n6o
15
p2的含量为检测限以下。2.一种医药组合物，其含有权利要求1所述的高纯度β烟酰胺单核苷酸nmn作为有效成分。3.一种防老化用组合物，其含有权利要求1所述的高纯度β烟酰胺单核苷酸nmn作为有效成分。4.一种高纯度β烟酰胺单核苷酸nmn的制造方法，其包括：(i)使amp核苷酶、核糖磷酸二磷酸激酶、一磷酸腺苷amp、三磷酸腺苷atp以及核糖-5-磷酸r5p反应的工序、(ii)使烟酰胺磷酸核糖转移酶nampt、所述工序(i)的反应产物、烟酰胺nam反应的工序、(iii)将所述工序(ii)的反应产物利用离子交换柱纯化的工序、以及(iv)使所述工序(iii)的纯化产物通过动态轴向压缩柱即dac柱的工序。

技术总结
本发明的课题在于，提供一种纯度高、并且杂质的含量少的NMN。本发明是一种高纯度β烟酰胺单核苷酸(NMN)，其纯度为99.0质量％以上，并且作为杂质的C


技术研发人员：田中经丸 田中惠 平松隆司 岛村大藏
受保护的技术使用者：未来实验室生物科学有限公司
技术研发日：2021.11.26
技术公布日：2023/8/4