水凝胶生物材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种水凝胶生物材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.伤口愈合是一个复杂而高度调节的生理过程，通常经过如下几个重叠的阶段：止血、炎症、增殖和重塑。临床及实验研究发现，炎症阶段延长，导致难以进入增殖和重塑阶段，组织再生困难，创伤不能愈合，形成慢性伤口。在不断增长的老年人、肥胖和糖尿病患者等人群中，易发生慢性伤口难以愈合情况。这类慢性伤口临床表现为愈合时间远超正常伤口乃至无法愈合，治疗费用昂贵且通常预后不佳。
3.糖尿病伤口愈合困难导致的糖尿病足是最常见的慢性伤口之一。全球糖尿病患者中糖尿病足溃疡可能导致糖尿病足部病变而不得不截肢，甚至导致死亡，是花费最高的糖尿病并发症。由于糖尿病患者自身的修复机制无法及时发挥作用，伤口会持续释放渗出物和自由基，刺激微生物感染和炎症反应，严重影响伤口的愈合，这就需要用外科的手段进行有效的治疗。目前已经开发出一系列的治疗策略，包括皮肤替代品、细胞递送、医用绷带、医用敷料和粘合剂等。其中，医用敷料的使用较为普遍。
4.医用敷料用于覆盖伤口，作为物理屏障防止外部感染，并作为诱导模板指导皮肤的重组和随后宿主组织的浸润和整合，对伤口愈合有明显的治疗效果。理想的皮肤伤口敷料应该满足以下要求：(1)具有良好的组织相容性，不引起毒性或炎症；(2)保湿性好，能够保持伤口湿润，促进细胞的水合作用，对伤口渗出液具有一定的吸收作用；(3)足够的物理机械强度，保证其完整性，避免材料破损造成外界细菌侵入；(4)适宜的表面微观结构和生化特性，以促进细胞粘附、增殖和分化。
5.传统的医用敷料如绷带和纱布，虽然可以及时吸收渗出液保持伤口的干燥，但容易与伤口粘连，在更换敷料时会造成二次伤害，且不能有效地隔绝病菌。为了更好地促进伤口愈合，目前已经开发出一些新型的医用敷料，如水凝胶、藻酸盐、水胶体、泡沫敷料和透明敷料等。其中，水凝胶是由天然和/或合成的亲水性聚合物通过一定的化学交联或物理交联形成的三维网络结构凝胶，具有良好的吸收及保持水分的能力。由于聚合物链的交联网状化，水凝胶不会轻易溶解，其机械性能和粘接能力也有所提高。理论上，水凝胶与天然细胞外基质 (ecm)的结构功能相似，在愈合过程中可以作为细胞支架和信号传递载体发挥作用。水凝胶作为伤口的医用敷料，不仅可以形成物理屏障去除伤口多余的渗出液，而且为伤口提供水分以保持伤口湿润，有利于清创。此外，水凝胶的高含水量还能起到降温的效果，舒缓伤口疼痛。然而，这些新型水凝胶敷料对慢性伤口的安全性有效性尚待大规模临床验证，一些水凝胶不能生物降解且会引起皮下组织的炎症反应，甚至一些负载生长因子的水凝胶存在致癌风险。因此，目前用于皮肤和内脏的急性和慢性伤口的水凝胶医用敷料，远未满足临床实际应用需求。


技术实现要素：

6.基于此，有必要提供一种生物相容性好且可促进伤口愈合和可生物降解的水凝胶生物材料及其制备方法和应用。
7.本发明是通过如下技术方案实现的。
8.本发明的一个方面，提供了一种水凝胶生物材料，所述水凝胶生物材料具有糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶交联形成的三维网络结构，所述糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶之间的交联包括酰胺键共价交联，所述糖胺聚糖类物质为糖胺聚糖、糖胺聚糖的修饰物和糖胺聚糖的解聚产物中的至少一种。
9.在其中一些实施例中，所述糖胺聚糖的结构修饰物包括糖胺聚糖中糖环上羟基的烷基化产物、酰基化产物和硫酸酯化产物中的至少一种；和/或，所述糖胺聚糖的解聚产物包括自由基解聚法、beta-消除法和/或脱氨基解聚法制备的解聚产物。
10.在其中一些实施例中，所述羟基的烷基化为甲基化、乙基化、异丙基化、烯丙基化和苄基化中的至少一种，所述羟基的酰基化为乙酰化、丙酰化、苯甲酰化和苯乙酰化中的至少一种。
11.在其中一些实施例中，所述糖胺聚糖选自蜗牛糖胺聚糖、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、岩藻糖化糖胺聚糖中的至少一种。
12.在其中一些实施例中，所述甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化取代度为 10％～100％。
13.在其中一些实施例中，所述水凝胶生物材料的制备原料中，以质量份数计，所述糖胺聚糖类物质的质量份数为0.375～5份，甲基丙烯酰化明胶的质量份数为 0.5～10份。
14.在其中一些实施例中，所述水凝胶生物材料的制备原料中，以质量份数计，所述糖胺聚糖类物质的质量份数为0.375～1.5份，甲基丙烯酰化明胶的质量份数为2～8份。
15.本发明的另一个方面，提供了一种水凝胶生物材料的制备方法，包括如下步骤：
16.将糖胺聚糖类物质溶于生物相容性介质中并加入羧基活化剂，得到溶液a；所述糖胺聚糖类物质为糖胺聚糖、糖胺聚糖的修饰物和糖胺聚糖的解聚产物中的至少一种；
17.将甲基丙烯酰化明胶溶于生物相容性介质中并加入光引发剂混匀，得到溶液b；
18.将所述溶液a和所述溶液b混匀后得到水凝胶前体溶液，光照交联。
19.本发明的另一个方面，提供了上述任一项所述的水凝胶生物材料在制备创面组织修复药品或组织液渗透封堵用品的应用，或者作为药物、蛋白质和/或细胞的载体制备缓释制剂。
20.本发明的另一个方面，提供了一种创面组织修复药品，包含有上述任一项所述的水凝胶生物材料。
21.本发明的另一个方面，提供了一种组织液渗透封堵用品，包含有上述任一项所述的水凝胶生物材料。
22.本发明的另一个方面，提供了一种缓释制剂，采用上述任一项所述的水凝胶生物材料作为药物、蛋白质和/或细胞的载体。
23.上述水凝胶生物材料具有三维网络结构，其具有良好的吸水和保水能力，且该水凝胶生物材料具有良好的生物相容性和降解性，能够在伤口愈合周期内完全被降解吸收，不需要额外处理和清除而对伤口造成二次伤害。
24.进一步地，上述水凝胶生物材料中甲基丙烯酰化明胶作为基质，糖胺聚糖类物质作为骨架和生物活性物质，其能够通过结合趋化因子和/或细胞因子表现出良好的抗炎作用，而无需任何其他治疗药物作用的存在下，显著加快伤口愈合。同时，该水凝胶生物材料可通过与包括人体皮肤等组织在内的生物组织表面的氨基和/或者羧基反应形成酰胺键，从而能够紧密粘附在伤口表面且贴合不规则创面，提供全面的创面保护，并能吸收创面释放的组织液。如此上述水凝胶生物材料可缓慢释放具有药理功能的糖胺聚糖类物质，并且高亲和力绑定慢性伤口组织持续释放的促炎细胞因子，从而有效改善伤口的炎症环境，促进血管生成和再上皮化过程，加速伤口愈合。
附图说明
25.图1为糖胺聚糖基水凝胶(afg-gelma)组织粘附力检测示意图及粘附力数据，分别如a、b所示；
26.图2为糖胺聚糖基水凝胶(afg-gelma)在不涂血和涂血猪肠衣上的粘附力测试图及实时力学变化图，分别如a、b、c所示；
27.图3为糖胺聚糖基水凝胶(afg-gelma)剪切力测试的示意图、实物图及实时力学变化图，分别如a、b、c所示；其中，afg-gelma-b/fibrin glue-b 中的b代表bloody(涂血的)；afg-gelma-c/fibrin glue-c中的c代表clear (不涂血的)；
28.图4为糖胺聚糖基水凝胶原料的细胞活力评估数据；
29.图5为糖胺聚糖基水凝胶的抗凝血活性和肝素基水凝胶(hep-g30)致创面出血图，分别如a、b所示；
30.图6为糖胺聚糖基水凝胶(afg-g30)在大鼠皮下降解的h&e染色图，医用504(ca)作为阳性对照；
31.图7为糖胺聚糖基水凝胶作为细胞基质培养细胞的效果直观图；
32.图8为糖胺聚糖基水凝胶促小鼠巨噬细胞m1向m2表型极化的荧光共聚焦照片；
33.图9为糖胺聚糖基水凝胶(afg-g30)促进正常大鼠伤口愈合效果图及愈合率统计图，分别如a、b所示；其中，以生理盐水处理组作为对照(control)， *表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001；
34.图10为糖胺聚糖基水凝胶(afg-g30和ha-g30，1％/4％)促进糖尿病大鼠皮肤伤口愈合效果图及愈合率统计图，分别如a、b所示；其中，以生理盐水处理组作为对照(control)；afg-g30和ha-g30为实验组；g30为凝胶空白组。 *表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001；
35.图11为术后第10天的伤口组织切片h&e染色图，箭头长度表示伤口组织的再上皮化长度；
36.图12为糖尿病大鼠术后第10天伤口组织免疫荧光染色α-sma和cd31的免疫荧光图、α-sma和cd31的统计结果图，分别如a、b、c所示；b、c中， *表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001；
37.图13为rt-qpcr检测糖尿病大鼠伤模第3天和第10天伤口组织的促炎细胞因子mrna表达水平变化；其中，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示 p《0.001；
38.图14为bio-plex悬液芯片技术检测糖尿病大鼠术后第3天和第10天伤口组织炎症
因子水平；其中，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001；
39.图15为bio-plex悬液芯片技术检测糖尿病大鼠术后第14天伤口组织炎症因子水平和未创伤皮肤组织的促炎细胞因子蛋白表达水平；其中，*表示 p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
具体实施方式
40.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。应当理解，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
41.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
42.本发明一实施方式提供了一种水凝胶生物材料，水凝胶生物材料具有糖胺聚糖类物质(glycosaminoglycan，gag)和甲基丙烯酰化明胶(methacrylatedgelatin，gelma)交联形成的三维网络结构，糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶之间通过酰胺键共价交联。具体地，在糖胺聚糖的羧基活化后，一方面可与甲基丙烯酰化明胶中的游离氨基反应成酰胺键而发生共价交联，也可进一步通过氢键、离子键等形成非共价交联；另一方面其可与生物组织中的氨基和/或羧基反应成酰胺键以及通过氢键、离子键等相互作用而强黏附于组织表面。换言之，糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶之间的交联包括酰胺键共价交联，还可进一步包括氢键、离子键等中的至少一种的非共价交联。
43.其中，糖胺聚糖类物质为糖胺聚糖、糖胺聚糖的修饰物和糖胺聚糖解聚产物中的至少一种。上述糖胺聚糖的结构修饰物包括但不限于糖胺聚糖中糖环上羟基的烷基化产物、糖环上羟基的酰基化产物及糖环上羟基的硫酸酯化产物中的至少一种。进一步地，羟基的烷基化包括但不限于甲基化、乙基化、异丙基化、烯丙基化、苄基化等的至少一种；进一步地，羟基的酰基化包括但不限于乙酰化、丙酰化、苯甲酰化、苯乙酰化等的至少一种。
44.上述糖胺聚糖的解聚产物包括但不限于自由基解聚法、beta-消除法和/或脱氨基解聚法制备的解聚产物。
45.容易理解的是，上述水凝胶生物材料为糖胺聚糖基水凝胶。
46.上述水凝胶生物材料具有三维网络结构，其具有良好的吸水和保水能力，且该水凝胶生物材料具有良好的生物相容性和降解性，能够在伤口愈合周期内完全被降解吸收，不需要额外处理和清除而对伤口造成二次伤害。
47.进一步地，上述水凝胶生物材料中甲基丙烯酰化明胶作为基质，糖胺聚糖类物质作为骨架和生物活性物质，其能够通过结合趋化因子和/或细胞因子表现出良好的抗炎作用，而无需任何其他治疗药物作用的存在下，显著加快伤口愈合。同时，该水凝胶生物材料可通过与包括人体皮肤等组织在内的生物组织表面的氨基和/或者羧基反应形成酰胺键，从而能够紧密粘附在伤口表面且贴合不规则创面，提供全面的创面保护，并能吸收创面释放的组织液。如此上述水凝胶生物材料可缓慢释放具有药理功能的糖胺聚糖类物质，并且
高亲和力绑定慢性伤口组织持续释放的促炎细胞因子，从而有效改善伤口的炎症环境，促进血管生成和再上皮化过程，加速伤口愈合。
48.将具有药理功能的糖胺聚糖类物质与甲基丙烯酰化明胶交联制成水凝胶生物材料，且该水凝胶生物材料具有良好的生物相容性和降解性，能够在伤口愈合周期内完全被降解吸收，不需要额外处理和清除而对伤口造成二次伤害，大大提高了使用便利性，克服了单独的糖胺聚糖应用于急性和慢性伤口时存在用药不便、给药量大而需要持续给药等缺点。
49.相比于采用普通明胶作为辅料将糖胺聚糖制成的水凝胶制剂，上述具有交联的三维网状结构的水凝胶生物材料为一种高分子交联材料，其能够紧密粘附在伤口表面且贴合不规则创面，提供全面的创面保护。
50.在其中一些实施例中，糖胺聚糖包括但不限于蜗牛糖胺聚糖(gag fromsnail，sgag)、透明质酸(hyaluronic acid，ha)、肝素(heparin，hep)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，hs)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate，cs)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate，ds)、硫酸角质素(keratan sulfate，ks)、岩藻糖化糖胺聚糖(fucosylate glycosaminoglycan，fg)中的至少一种。
51.例如，本发明人研究发现，一类结构新颖的蜗牛糖胺聚糖sgag(gag fromsnail，sgag)及其解聚衍生物可以高亲和力结合趋化因子，促进糖尿病皮肤组织伤口的愈合，并公开了所述新颖的蜗牛糖胺聚糖及其解聚衍生物具有用于治疗和/或预防糖尿病并发症糖尿病足或其他皮肤组织伤口溃疡或难愈合的新用途。而且，不像具有强抗凝活性的肝素和岩藻糖化硫酸软骨素等糖胺聚糖，蜗牛糖胺聚糖因无抗凝活性而不具有引起创面的出血风险。
52.进一步地，优选不具有抗凝和出血风险的糖胺聚糖；例如优选为蜗牛糖胺聚糖、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素中的一种或多种。
53.在其中一些实施例中，交联为光触发交联，甲基丙烯酰化明胶与糖胺聚糖类物质可在光触发下快速成胶。
54.进一步地，上述水凝胶生物材料可为湿凝胶或干凝胶。湿凝胶和干凝胶是相对的，湿凝胶是指上述水凝胶生物材料吸附有生物相容性介质等溶剂的状态，而干凝胶是指吸附有生物相容性介质等溶剂的水凝胶生物材料经干燥除去溶剂的状态。具体地，其中的干燥优选为冷冻干燥，得到的干凝胶为冻干凝胶，其为冻干海绵材料，呈多孔海绵状。
55.在其中一些实施例中，上述水凝胶生物材料的制备方法包括如下步骤 s10～s50。
56.步骤s10、将糖胺聚糖类物质溶解于生物相容性介质中，得到糖胺聚糖类物质溶液。
57.步骤s20、在糖胺聚糖类物质溶液中加入羧基活化试剂，混匀，得到溶液a。
58.进一步地，羧基活化试剂包括但不限于：如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)等碳二亚胺类活化试剂、如 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)等三嗪类活化试剂、如2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)等鎓盐类活化试剂、如n,n'-羰基二咪唑(cdi)等羰基二咪唑类活化试剂中的一种和/或多种。更进一步地，羧基活化试剂优选为edc和nhs。
59.步骤s30、将甲基丙烯酰化明胶溶解于生物相容性介质中，得到甲基丙烯酰化明胶
溶液。
60.进一步地，步骤s10和步骤s30的生物相容性介质可选自水、细胞培养基及生理缓冲液中的一种和多种；其中生理缓冲液任选生理盐水、磷酸盐缓冲液、 tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、血液、血浆以及富血小板血浆中的一种和多种。其中水可为蒸馏水、去离子水。
61.步骤s40、在甲基丙烯酰化明胶溶液中加入光引发剂混匀，得到溶液b。
62.进一步地，光引发剂通常为irgacure系列，例如2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(irgacure 2959)、2-羟基-2-甲基苯丙酮(irgacure 1173)；苯基-(2,4,6-三甲基苯甲酰基-磷酸锂盐(lap)、2',4',5'，7'-四溴荧光素二钠盐 (曙红y)和核黄素(维生素b2)中的一种和/或多种，优选为lap。
[0063]
步骤s50、将溶液a和溶液b混匀后得到水凝胶前体溶液，光照交联，即可制得上述水凝胶材料。
[0064]
进一步地，使用的光照波长为320～600nm。
[0065]
进一步地，在一些实施例中还包括步骤s60将水凝胶生物材料经冷冻干燥等方式干燥后，可以制成干凝胶。
[0066]
上述水凝胶生物材料的制备方法的制备成本低，操作简单，实用性强，应用范围广。水凝胶前体溶液可在湿润环境下原位快速成胶，凝胶流变性和生物力学性能优良，安全无毒、生物相容性好，且可完全生物降解。
[0067]
上述水凝胶生物材料的三维结构类似于细胞外基质，根据水凝胶的流变力学测试结果显示，其储能和损耗模量数据接近于人体软组织。此外调变糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶的组成比例，可以制备出不同流变性能的水凝胶。
[0068]
在其中一些实施例中，上述水凝胶生物材料的制备原料中，以质量份数计，糖胺聚糖类物质的质量份数为0.375～5份，甲基丙烯酰化明胶的质量份数为 0.5～10份。进一步地，上述水凝胶生物材料的制备原料中，糖胺聚糖类物质的质量份数为0.35～1.5份或0.75～1.5份；进一步地，甲基丙烯酰化明胶的质量份数为2～8份，更优为4～8份。
[0069]
在其中一些实施例中，甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化取代度为 10％～100％。
[0070]
在其中一些实施例中，水凝胶前体溶液中糖胺聚糖类物质的质量体积比为 0.37％～5％(g/ml)；和/或，水凝胶前体溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量体积比为 0.5％～10％(g/ml)，进一步为2％～8％(g/ml)。
[0071]
进一步地，水凝胶前体溶液中糖胺聚糖类物质的质量体积比可为 0.375％(g/ml)、0.5％(g/ml)、0.7％(g/ml)、1％(g/ml)、1.2％(g/ml)、1.5％(g/ml)、 2％(g/ml)、3％(g/ml)、5％(g/ml)，优选为0.75％～1.5％％(g/ml)。
[0072]
进一步地，水凝胶前体溶液中甲基丙烯酰化明胶的质量体积比可为0.5％(g/ml)、1％(g/ml)、2％(g/ml)、3％(g/ml)、4％(g/ml)、5％(g/ml)、6％(g/ml)、 7％(g/ml)、8％(g/ml)、9％(g/ml)、10％(g/ml)，优选为4％～8％(g/ml)。
[0073]
以上述水凝胶生物材料对猪肠衣或猪皮的黏附为例，分别测试拉力、压力及剥离等力学参数，在有无水或血浆或血液存在下，证明该上述水凝胶生物材料与包括肠衣、皮肤等在内的生物组织形成强效的黏附，且在水和血液等存在下不影响此黏附力。
[0074]
以上述水凝胶生物材料的原料糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶为细胞培养
基进行细胞培养实验观察，所有水凝胶的原料组分在不同浓度和不同时间点下的细胞存活率均不低于80％，显示出无细胞毒性。动物皮下包埋糖胺聚糖基水凝胶，观察所述水凝胶降解过程，拍照观察和组织苏木素-伊红染色(h&e 染色)结果显示，上述水凝胶生物材料不会引起皮下组织炎症反应，且在14～21 天能完全降解，这个降解过程与伤口愈合时间过程基本吻合。因此，细胞和动物实验结果证实，上述水凝胶生物材料具有良好的生物相容性和降解性，与临床使用的纤维蛋白胶及氰基丙烯酸酯类(如医用504和508)比较具有显著的优势。
[0075]
在细胞、组织、动物等多层次药理药效学研究下，本发明的技术人员惊奇地发现，上述水凝胶生物材料，其不但能有效的闭合创面伤口，而且具有显著的抗炎活性以及加快包括糖尿病慢性伤口在内的伤口创面组织的血管重建、胶原蛋白沉积与表皮再生功能，能够持续有效愈合伤口。例如，细胞和动物实验证实：上述水凝胶生物材料通过调节巨噬细胞极化而无需任何其他治疗药物作用存在下，就可以加速伤口愈合；该水凝胶生物材料能够紧密粘附在伤口表面且贴合不规则创面，提供全面的创面保护，并能吸收创面释放的组织液；缓慢释放具有药理功能的糖胺聚糖物质，并且高亲和力绑定慢性伤口组织持续释放的促炎细胞因子，从而有效改善伤口的炎症环境，促进血管生成和再上皮化过程，加速伤口愈合。同时，其具有良好的生物相容性和降解性，能够在伤口愈合周期内完全被降解吸收，不需要额外处理和清除而对伤口造成二次伤害。
[0076]
包括糖尿病足在内的糖尿病皮肤组织溃疡，是糖尿病患者中一种常见的高危并发症，糖尿病患者受到不同程度的足部溃疡影响，严重时可导致患者截肢，给糖尿病患者带来严重的健康威胁，造成了沉重的社会经济负担。然而，由于其病理机制的复杂性，临床上尚迫切需要安全有效的治疗药物。本发明上述水凝胶生物材料可显著促进糖尿病足等皮肤伤口和/或创面和/或溃疡的愈合，故该水凝胶具有重要的预防和/或治疗糖尿病皮肤组织溃疡的应用潜力。
[0077]
换言之，本发明一实施方式提供了上述水凝胶生物材料在制备创面组织修复药品中的应用。其中的各种促进伤口愈合、创面封闭可用于促进各种伤口愈合、创面封闭。
[0078]
在其中一些实施例中，创面组织修复可为皮肤创伤修复；进一步地，创面组织修复可为糖尿病足和/或其他皮肤组织难愈合性伤口的修复。
[0079]
上述水凝胶生物材料可吸收组织液渗透，而进一步用于制备组织液渗透封堵用品。
[0080]
进一步地，创面组织修复药品或组织液渗透封堵用品可为医用敷料。可将上述水凝胶生物材料制成医用敷料，采用上述水凝胶生物材料作为医用敷料的活性成分。换言之，本发明还提供了一种医用敷料，其活性成分包括上述水凝胶生物材料。将上述水凝胶生物材料制成医用敷料给药方便，且该水凝胶生物材料具有良好的生物相容性和降解性，能够在伤口愈合周期内完全被降解吸收，不需要额外处理和清除而对伤口造成二次伤害，大大提高了使用便利性，克服了单独的糖胺聚糖应用于急性和慢性伤口时存在用药不便、给药量大而需要持续给药等缺点。
[0081]
上述医用敷料中的水凝胶生物材料可为湿凝胶或干凝胶。上述医用敷料中的水凝胶生物材料为冻干凝胶。进一步地，上述医用敷料为水凝胶贴片；更进一步为冻干贴片。
[0082]
上述水凝胶生物材料的应用不限于此。还可用于作为药物、蛋白质和/或细胞的载
体制备缓释制剂，进而起到促进伤口愈合的作用，其可广泛应用于组织工程和再生医学中，例如美容中的应用。
[0083]
进一步地，上述药物包括但不限于血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,vegf)或者血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, pdgf)药物分子。
[0084]
本发明一实施方式还提供了一种伤口或创面的治疗或美容方法，其采用上述水凝胶生物材料。
[0085]
以上述糖胺聚糖基的水凝胶生物材料为基质，培养鼠成纤维细胞的观察结果显示，细胞生长存活良好，表明光交联糖胺聚糖基水凝胶可作为细胞培养的基质。进一步地，上述糖胺聚糖基的水凝胶生物材料中含有糖胺聚糖，而且糖胺聚糖因富含羟基、羧基和硫酸酯基等官能团而可与小分子药物、蛋白质、核酸和细胞形成氢键、离子键等相互作用，因此糖胺聚糖基的水凝胶生物材料可作为载体负载药物、蛋白质、核酸和细胞等功能性成分，这些化学键因为可逆而起到缓慢释放的作用。
[0086]
因此，上述糖胺聚糖基的水凝胶生物材料在制备创面组织修复药品、组织液渗透封堵用品以及作为药物、蛋白质和/或细胞的载体在组织工程和再生医学中的应用。
[0087]
综上所述，本发明上述糖胺聚糖基的水凝胶生物材料与现有技术相比有下列创新点：
[0088]
(1)上述糖胺聚糖基的水凝胶生物材料采用糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶经光化学交联制备而成，其三维结构类似于细胞外基质，其生物力学性质接近于人体软组织，且具有适宜的刚性、弹性、变形性和强粘附性，以及良好的生物相容性和生物降解性。
[0089]
(2)上述糖胺聚糖基的水凝胶生物材料的化学结构、组成和降解时间以及粘附强度、胶的厚薄、形状均可调，可以根据不同的应用而灵活的调节凝胶材料的组成和性质。而且，因其可在创面快速原位成胶，适用于创面形状不规则的伤口的封闭和愈合。
[0090]
(3)上述糖胺聚糖基的水凝胶生物材料具有显著的抗炎活性以及促慢性伤口组织的血管重建与表皮再生功能，能够持续有效愈合慢性伤口，并且伴随伤口愈合期逐步降解而避免更换药物时带来二次伤害。
[0091]
(4)上述糖胺聚糖基的水凝胶生物材料因其有效地将巨噬细胞的极化导向 m2型可显著促进慢性伤口的愈合，在没有任何药物、外源性生长因子或种子细胞的情况下可加速伤口部位的伤口愈合和血管生成，具有极高的实际应用价值。同时，上述水凝胶生物材料也可作为药物、蛋白质和细胞的载体，应用于包括但不限于软组织工程和再生在内的生物医学中。
[0092]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加简洁明了，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非仅限于这些实施例。以下所描述的实施例仅为本发明较好的实施例，可用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0093]
为了更好地说明本发明，下面结合实施例对本发明内容作进一步说明。以下为具体实施例。
[0094]
【实施例1】糖胺聚糖基水凝胶的制备
[0095]
1.1实验材料
[0096]
30％甲基丙烯酰基取代度的明胶(gelma30)和100％甲基丙烯酰基取代度的明胶(gelma100)，苏州永沁泉智能设备有限公司。gelma在保留了普通明胶生物相容性好，性质稳定等优点的同时，能够在紫外和/或可见光下由光触发剂引发自由基产生交联反应，快速形成水凝胶材料，且随着其取代度和固含量的变化，形成的水凝胶的机械性能和降解速度均可调，已经被广泛用于制备生物工程材料；蜗牛糖胺聚糖，重均分子量为366kda，本技术人从白玉蜗牛中分离纯化制得，可称之为白玉蜗牛糖胺聚糖(the snail achatina fulica gag,afg)，其单糖组成包括摩尔比在1:(1
±
0.3)范围内的d-乙酰氨基-葡萄糖和l-艾杜糖醛酸；其单糖连接方式是，d-乙酰氨基-葡萄糖和l-艾杜糖醛酸以α(1
→
4)糖苷键交替链接形成多糖链；肝素hep，美国sigma公司，重均分子量为16.2kda；透明质酸ha，华熙福瑞达生物医药有限公司，重均分子量为200-400kda。
[0097]
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺 (nhs)，分析纯，上海源叶生物科技有限公司；苯基-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)
‑ꢀ
磷酸锂盐(lap)，化学纯，苏州永沁泉智能设备有限公司。
[0098]
1.2糖胺聚糖基水凝胶的制备过程
[0099]
糖胺聚糖以蜗牛糖胺聚糖afg、透明质酸ha和肝素hep为例(分别记为 a1、a2、a3)，以30％和100％甲基丙烯酰基取代度的明胶(gelma30，b1和gelma100，b2)为代表的凝胶基质为实例，采用光化学交联的方法制备糖胺聚糖基水凝胶。
[0100]
按照表1中的糖胺聚糖和甲基丙烯酰化明胶的参数分别配成溶液a和溶液 b。以表1中的a1b1为例，即是蜗牛糖胺聚糖0.75％和30％取代度gelma8％，描述具体实验步骤如下。称取15mg糖胺聚糖类物质，溶解于1ml pbs中；再加入17.18mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和9.73mg n
‑ꢀ
羟基琥珀酰亚胺(nhs)的羧基活化试剂，混匀，得到溶液a。称取160mg甲基丙烯酰化明胶gelma，溶解于1ml pbs中；所得的溶液中加入3.2mg光引发剂lap，40℃水浴混匀，得到溶液b。使用时将溶液a和溶液b按1:1比例混匀后得到水凝胶前体溶液，405nm下光照，即可制备得到光触发交联的糖胺聚糖基水凝胶材料。
[0101]
按照上述方法制备的光触发交联的糖胺聚糖基水凝胶材料，经冷冻干燥后，可以制成冻干贴片或者冻干海绵材料。
[0102]
表1.光交联糖胺聚糖基水凝胶的制备
[0103][0104]
备注：表中以a1和b1对应为0.75％/2％为例，其表示的是在水凝胶前体溶液中a1的质量体积比w/v为0.75％(g/ml)，即7.5mg/ml；b1的质量体积比w/v为2％(g/ml)，即2mg/
ml。
[0105]
将上述18组水凝胶前体溶液分别在405nm(20mw/cm2)条件下照射一定时间，即可得到不同化学组成的水凝胶。
[0106]
结果显示，成胶时间与gelma的固含量相关，gelma的固含量越高，成胶时间越短。然而仅有gelma存在时，在4％和2％的gelma固含量下，成胶时间相对较长，约50分钟或更长。当糖胺聚糖添加到gelma中时，大幅缩短成胶时间，在8％的固含量下，10秒内即可成为固态水凝胶，并强效粘附在软组织表面；在4％的固含量下，35秒内即可成为固态水凝胶；在2％的固含量下，260 秒内即可成为固态水凝胶。同时，不同的凝胶材料具有不同的生物效应，可以根据不同的应用针对性地选择凝胶材料的组成。
[0107]
【实施例2】糖胺聚糖基水凝胶的流变性考察
[0108]
制备如表2所示组成的afg-gelma30、ha-gelma30、hep-gelma30、 afg-gelma100、ha-gelma100和hep-gelma100等糖胺聚糖基水凝胶。在 mcr302流变仪(anton paar,austria)上进行振荡剪切实验，测得不同浓度的水凝胶的储能模量(g
′
)和损耗模量(g
″
)。采用平行板进行实验，并用自动间隙控制方法进行间隙控制，温度为25℃。首先进行振幅扫描，以定义线性粘弹性区域，根据线性粘弹性区域选择合适应变幅度。频率扫描时频率范围为 10
+2-10-1
rad
·
s-1
，每个浓度最少进行3个独立测量。计算10
+1-10-1
rad
·
s-1
频率范围的存储模数和损耗模数的平均值。
[0109]
表2的数据显示，以甲基丙烯酰化明胶gelma30(甲基丙烯酰基取代度为 30％)和gelma100(甲基丙烯酰基取代度为100％)为例，取代度对储能模量和损耗模量影响相对较小；而gelma固含量增加使得g
′
和g
″
逐渐增加，说明甲基丙烯酰化明胶含量是影响储能模量和损耗模量的关键因素。在特定gelma 固含量下，gag的加入同样可以改变g
′
和g
″
，但变化幅度小于gelma固含量的改变。gelma的固含量为2％和4％时，gag-gelma100的储能模量和损耗模量相对于gag-gelma30较小。
[0110]
表2.光交联糖胺聚糖基水凝胶的储能模量和损耗模量
[0111]
[0112][0113]
就gelma固含量而言，gelma固含量进一步优选为4％～8％。糖胺聚糖gag 和甲基丙烯酰化明胶gelma所形成的透明状水凝胶具有良好的弹性和韧性，其储能模量的范围在10pa(2％固含量gelma)到2550pa(8％固含量gelma)，所对应的杨氏模量在0.03～7.5kpa之间，与皮肤的杨氏模量(4.5～8kpa)接近，特别适合应用于包括皮肤在内的软组织表面的粘附。
[0114]
【实施例3】糖胺聚糖基水凝胶的力学性能测试
[0115]
3.1糖胺聚糖基水凝胶的粘附强度测试
[0116]
(1)猪肠衣处理
[0117]
将盐渍猪肠衣用清水冲洗除去附着在表面的盐颗粒，之后用水浸泡30分钟。将浸泡后的猪肠衣剪成合适大小，肠衣外部向上平铺在保鲜膜上，烘箱40℃烘干。将猪肠衣从纸上剥下，将透明胶带固定在与保鲜膜相粘连部分，裁剪成3 cm
×
1cm长条形备用。
[0118]
(2)不涂血的实验过程
[0119]
在其中一段猪肠衣(hog casing)末端1cm
×
1cm的位置加上按实施例1 中制备的a1(质量浓度0.75％,g/ml)和b1(gelma30，2％、4％、8％,g/ml)， b2组分(gelma100，2％、4％、8％,g/ml)的预制水凝胶(pregel)，另一段猪肠衣(hog casing)的相同位置在添加水
凝胶部位反方向进行重叠，用uv固化灯(405nm hv)照射凝胶凝固并粘合两块猪肠衣。采用拉力压力测验机对粘合猪肠衣进行拉伸，施加力f，如图1中a所示的组织粘附力测试，记录猪肠衣分开的最大拉力。
[0120]
每种凝胶进行3次测试，对数据进行统计分析。如图1所示，b示出了组织粘附力测试的结果。如b中可知，afg-gelma水凝胶的粘附力随着gelma的固含量增加而变大。
[0121]
以猪源纤维蛋白粘合剂(fibrin glue，广州倍绣生物技术有限公司)为阳性对照，4％以上的固含量的水凝胶粘附力均显著大于阳性对照纤维蛋白胶。 ha-gelma和hep-gelma的粘附力变化与afg-gelma类似且高于gelma水凝胶。
[0122]
(3)涂血的实验过程
[0123]
在一段用透明胶带(scotch tape)固定的猪肠衣(总长3cm)末端1cm
×
1cm 的位置均匀涂抹大鼠新鲜血液后，加上afg-gelma(a1/b1,0.75％/8％,g/ml) 的预制水凝胶，另一段猪肠衣如图1中a所示的组织粘附力测试的相同位置在添加水凝胶部位反方向进行重叠，用uv固化灯照射凝胶凝固并粘合两块猪肠衣，如图2中b所示。
[0124]
采用拉力压力测验机对粘合猪肠衣进行拉伸，记录猪肠衣分开的最大拉力。进行3次测试。
[0125]
不涂血的预制水凝胶与涂血的预制水凝胶的组成相同，两者作为对比，组织粘附力检测如图2中a所示，其与图1中a相似。对比结果如图2中c所示，涂血和不涂血的水凝胶的最大粘附力无显著差异，说明血液成分不影响水凝胶与肠衣之间的黏附。
[0126]
3.2糖胺聚糖基水凝胶的剥离强度测试
[0127]
(1)猪肠衣处理
[0128]
将猪肠衣从纸上剥下，将透明胶带固定在与保鲜膜相粘连部分，裁剪成5cm
ꢀ×
1cm长条形备用。
[0129]
(2)涂血的实验过程
[0130]
在其中一段猪肠衣末端3cm
×
1cm的位置均匀涂抹大鼠新鲜血液后，加上 afg-gelma(a1/b1，0.75％/8％,g/ml)的预制水凝胶，另一段猪肠衣的相同位置在添加水凝胶部位进行相同方向重叠，用uv固化灯照射凝胶凝固并粘合两块猪肠衣，如图3中的最左边附图，得到水凝胶粘合并涂血的两块肠衣；然后进行剥离(deform)。
[0131]
采用拉力压力测验机对粘合猪肠衣进行拉伸，如图3中b所示，进行剥离使用电脑进行数据记录和分析，得到的结果如图3中c所示，水凝胶在涂血和不涂血的环境中剪切力无显著差异，且均大于阳性对照猪源纤维蛋白粘合剂 (fibrin glue)。其中，afg-gelma-b、fibrin glue-b为涂血的，afg-gelma-c、 fibrin glue-c为未涂血的。
[0132]
【实施例4】糖胺聚糖结合细胞因子活性比较
[0133]
4.1材料
[0134]
(1)糖胺聚糖样品：蜗牛糖胺聚糖，重均分子量为366kda，本发明人从白玉蜗牛中分离纯化制得，可称之为白玉蜗牛糖胺聚糖(the snail achatina fulicagag,afg)；肝素hep，美国sigma公司，重均分子量为16.2kda；低分子量透明质酸ha，华熙福瑞达生物医药有限公司，重均分子量为10kda。
[0135]
(2)试剂及仪器：白介素6(human interleukin-6，il-6)，血小板因子4(plateletfactor 4，pf4)，干扰素γ诱导蛋白10(interferon gamma-induced protein 10，ip-10)，
白介素8(human interleukin-8，il-8)，美国abcam公司。
[0136]
大分子相互作用仪，biacore s200，美国ge healthcare公司；cm5芯片，美国ge healthcare公司。
[0137]
4.2方法
[0138]
将上述蛋白(il-6、il-8、pf4和ip-10)按标准操作流程偶联到cm5芯片上，使用hbs-ep缓冲液(ph 7.4的0.01m hepes、0.15m nacl、3mm edta、和0.5％surfactant p20)作为运行缓冲液，对不同的糖胺聚糖样品进行检测，并对结果进行分析，获得kd值。
[0139]
4.3结果
[0140]
表3不同糖胺聚糖结合细胞因子的亲和力
[0141][0142]
表3结果显示，三种代表性糖胺聚糖均能高亲和力结合于四种细胞因子，亲和力常数kd数据显示，蜗牛糖胺聚糖afg与细胞因子结合能力均高于肝素 hep和透明质酸ha。
[0143]
【实施例5】糖胺聚糖基水凝胶的生物相容性测试
[0144]
5.1材料
[0145]
(1)鼠成纤维细胞：nih/3t3，购自中国科学院昆明动物所细胞库。
[0146]
(2)实验动物：动物实验的全部过程遵守《实验动物管理条例(2017修订)》的规定。雄性sd大鼠，180-220g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：scxk(湘)2019-0004。在实验前，大鼠置于恒温恒湿条件下，光-暗循环12h，适应环境至少一周。
[0147]
(3)试剂及仪器：cck8试剂盒；酶标仪：thermo scientific multiskan fc，美国thermo scientific公司；mc-4000血液凝固分析仪，德国tico gmbh公司。
[0148]
5.2方法
[0149]
(1)细胞毒性测试实验
[0150]
将nih/3t3细胞悬浮后，按1
×
104密度铺于96孔板中，在5％co2的培养箱中37℃培养24h后，分别加入含不同浓度(2.0、1.0和0.10mg/ml)的水凝胶的单一原料组分(蜗牛糖胺聚糖afg、透明质酸ha或甲基丙烯酰化明胶 gelma)的新鲜培养基，以不做任何处理正常培养的细胞为对照组。
[0151]
在培养1、2、3、5和7天后，使用cck8试剂盒染色，经酶标仪检测细胞活性。细胞存活率计算如下：
[0152]
细胞存活率(％)＝(实验组吸光度的平均值/对照组吸光度的平均值)
×
100％。
[0153]
(2)抗凝活性及出血风险评价
[0154]
将afg-gelma，ha-gelma，hep-gelma和gelma四种水凝胶(以下gelma 如无特殊说明均为甲基丙烯基取代度为30％，简写为g30；1％/4％，g/ml)通过研钵研碎，溶于1ml生理盐水中，12000g离心5分钟后取上清，按标准操作流程检测活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,aptt)活性。
[0155]
(3)皮下包埋降解实验
[0156]
sd大鼠随机分成6组，每组8只，分别为假手术组(对照组)、afg-g30组、 ha-g30组、hep-g30组、g30组以及医用504胶(α-氰基丙烯酸正丁酯缩写为ca，北京康派特医疗器械有限公司)对照组。将各组水凝胶(直径为1.5cm)包埋于大鼠皮下，分别与第3、7、14和18天打开伤口观察残留水凝胶情况并拍照。取伤口组织进行石蜡包埋，切片以及苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，h&e) 染色分析。
[0157]
5.3结果
[0158]
结果如图4所示，其中横坐标为时间天数，纵坐标为细胞活力(cell viability)，相邻的9个柱图形从左至右依次是2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.10mg/ml的afg (标记为afg-2、afg-1、afg-0.1)，2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.10mg/ml的ha(标记为ha-2、ha-1、ha-0.1)，2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.10mg/ml的 g30(标记为g30-2、g30-1、g30-0.1)。
[0159]
所有水凝胶组分在不同浓度和不同时间点下的细胞存活率均大于80％，说明其无细胞毒性，证实本发明所述的水凝胶具有良好的细胞相容性。
[0160]
图5示出了糖胺聚糖基水凝胶的抗凝血活性和肝素基水凝胶(hep-g30) 致创面出血图，分别如a、b所示。a中纵坐标为体外凝血时间(coagulation timeex vivo，min)。
[0161]
从a中可知，hep-g30水凝胶具有强效抗凝活性，极其显著的延长了aptt 时间(p《0.001)，而ha-g30和afg-g30水凝胶的aptt时间与阴性对照(以生理盐水处理组作为对照，control)、g30无显著差异，说明ha-g30和afg-g30 这两个水凝胶无抗凝血活性，无出血风险。
[0162]
上述体外凝血结果与动物伤口的应用也一致，如图5中b所示，hep-g30 水凝胶(hep-gelma)应用于伤口表面(wound)以及皮下(subcutaneous)包埋，均在较短的时间内(小于24h)即引起较严重的伤口出血，而afg-g30 (afg-gelma)、ha-g30、g30等其他糖胺聚糖基水凝胶不会引起伤口部位出血。
[0163]
以实施例1制备的afg-g30(0.75％/4％，g/ml)为例，以医用504(ca) 为阳性对照，植入大鼠皮下，组织切片h&e染色法分析，不同时间下观察两种生物材料对皮下组织的炎症反应情况。结果如图6所示，光交联糖胺聚糖基生物功能性水凝胶在14天内可以完全降解，降解后机体无任何残留，仅在早期偶见极轻微炎症反应，未见组织纤维化和非生理性增生情况。而ca在14天时，几乎仍未降解，而与ca接触的组织始终伴随着严重的炎症反应。
[0164]
【实施例6】糖胺聚糖基水凝胶作为基质应用于细胞培养
[0165]
6.1材料
[0166]
(1)光交联生物功能性水凝胶的各种组分：afg、ha以及g30。
[0167]
(2)鼠成纤维细胞：nih/3t3，购自中国科学院昆明动物所细胞库。
[0168]
(3)试剂及仪器：活/死细胞染色(live/dead cytotoxicity)试剂盒，美国 invitrogen公司；leica tcs sp8 x共聚焦荧光显微镜，德国leica公司。
[0169]
6.2方法
[0170]
按照本发明所述方法配制水凝胶前体溶液，其中gag分别用0.75％的afg和 ha，以及不含gag的g30(8％质量浓度，g/ml)，以含10％的胎牛血清的dmem (dulbecco's modified eagle medium)双抗培养基为生物相容性介质。nih/3t3 细胞悬浮后按4
×
106的密度加入到水凝胶前体溶液中，铺到96孔板上，405nm 光照形成水凝胶。在5％co2的培养箱
中37℃培养24h后，弃掉培养基，杜氏磷酸盐缓冲液清洗后，活/死细胞试剂盒染色，在共聚焦显微镜下观察并拍照。
[0171]
6.3结果
[0172]
结果如图7所示，显微镜视野内绝大多数细胞均为活细胞状态(绿色)，只有极少数死细胞(红色)，细胞生长状态良好，表明光交联生物活性水凝胶可以作为细胞培养的基质载体。
[0173]
【实施例7】糖胺聚糖基水凝胶促进巨噬细胞向m2表型极化
[0174]
7.1材料
[0175]
(1)光交联糖胺聚糖基水凝胶的组分：afg、ha、g30、edc和nhs等。
[0176]
(2)小鼠巨噬细胞系raw264.7，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0177]
(3)试剂及仪器：脂多糖lps，美国sigma公司；小鼠mannose recepter (mr，cd206)一抗,英国abcam公司；alera fluor 488二抗，美国jackson 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染料，武汉塞维尔公司；leica tcs sp8x共聚焦荧光显微镜，德国leica公司。
[0178]
7.2方法
[0179]
按照本发明所述方法配制水凝胶前体溶液，其中gag为1％(g/ml)终浓度的afg和ha为例，以及不含gag的g30(8％质量浓度)为对照，405nm光照形成水凝胶预制胶。raw264.7细胞悬浮后按1
×
105的密度铺到24孔板上，在5％ co2的培养箱中37℃过夜培养后，弃掉培养基，dpbs清洗后，分别加入正常培养基(空白对照，control)，含40ng/ml il-4的培养基(阳性对照，il4)，含 100ng/ml的lps的培养基(阴性对照，lps)以及含100ng/ml lps培养基的同时加入1/10体积的预制水凝胶(实验组)。以cd206荧光抗体为m2型巨噬细胞标志物进行细胞荧光免疫染色后，通过共聚焦荧光显微镜观察和拍照记录。
[0180]
7.3结果
[0181]
结果见图8。与空白对照相比，il4显著诱导巨噬细胞向m2表型(cd206 标志，绿色；核为dapi染色，蓝色)转变，而lps则显著抑制m2表型。不含gag的g30水凝胶对lps的抑制无显著作用，而含gag的水凝胶则能显著提高巨噬细胞表面cd206的表达以及m2表型的比例，其中以afg-g30水凝胶最为显著，说明未加任何抗炎药物的糖胺聚糖基水凝胶可显著促进巨噬细胞向m2表型极化。
[0182]
在伤口愈合过程中，巨噬细胞从m1表型向m2表型的转变是伤口愈合从炎症阶段转化为增殖阶段的重要过程，这个过程受阻会引起慢性炎症导致伤口难以愈合。本发明制备的光交联糖胺聚糖基水凝胶能够有效的绑定或清除慢性伤口部位的炎性细胞因子，诱导伤口微环境中的巨噬细胞向m2表型极化，从而可显著促进伤口愈合。
[0183]
【实施例8】糖胺聚糖基水凝胶应用于蛋白质类药物的负载与释放
[0184]
水凝胶是一种能够在水中溶胀但不溶解的交联高分子网络，由于水凝胶大部分由水组成，同时具有非常好的生物相容性，特别适用于药物和生物活性大分子的载体。包裹于水凝胶材料中的药物或生物活性大分子通过分子的扩散作用和材料的降解作用实现药物持续释放的效果。以药物包裹与释放为例具体介绍如下：以实施例一制备的afg-g30(1％/8％)，将其溶于生理盐水中，配成一定质量浓度的水凝胶前体溶液，加入适量重组的血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,vegf)或者血小板衍生生长因子
(platelet derivedgrowth factor,pdgf)药物分子，取200μl上述溶液置于圆形模具中光照成水凝胶，放入24孔细胞培养板中，加入一定量的生理盐水进行药物释放实验，紫外测试分析溶液中药物的释放量，以此来评价该材料对药物的释放效果。
[0185]
结果显示，afg-g30水凝胶能显著负载vegf或pdgf，且随着时间延长，其可以缓慢释放生成因子。afg-g30水凝胶能够负载这些生成因子的机制为蜗牛糖胺聚糖afg富含羧基和硫酸酯基，这些阴离子可以与vegf或pdgf中的氨基形成离子键，以及甲基丙烯酰化明胶中的羧基或氨基亦可与vegf或pdgf 中的氨基或羧基形成离子键，上述两类离子键均为可逆非共价键，因此既可以负载vegf或pdgf也可缓慢释放这些生成因子。
[0186]
其他不同材料组成的水凝胶体系同样属于光交联生物功能性水凝胶，同样可以应用于药物的包裹与释放。
[0187]
【实施例9】糖胺聚糖基水凝胶应用于急性皮肤创面愈合与修复
[0188]
9.1仪器
[0189]
zs-mv-iv型便携式小动物麻醉机，北京众实迪创科技发展有限责任公司。
[0190]
9.2试剂与材料
[0191]
主要试剂：异氟烷、碘伏和医用酒精等试剂为市售生物级或医用级试剂。
[0192]
实验动物：动物实验的全部过程遵守国务院颁布的《实验动物管理条例(2017 修订)》的规定。雄性sd大鼠，180-220g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：scxk(湘)2019-0004。在实验前，大鼠置于恒温恒湿条件下，光
‑ꢀ
暗循环12h，适应环境至少一周。
[0193]
水凝胶材料：按本发明实施例1中方法合成的afg-g30(1％/4％)水凝胶前体溶液。
[0194]
9.3方法
[0195]
(1)实验分组及方法
[0196]
sd大鼠，雄性，180-220g，按照体重大小均衡随机分为3组，每组8只。另设5只正常动物进行行为学和常规生理观察。
[0197]
空白对照：生理盐水组，90μl/伤口；
[0198]
受试组：
[0199]
g30(4％固含量)组：90μl/伤口，加到伤口上后，立即405nm光照2min，使前体溶液固化为水凝胶并牢固粘附在伤口上；
[0200]
afg-g30(1％/4％)组：90μl/伤口，加到伤口上后，立即405nm光照2min，使前体溶液固化为水凝胶并牢固粘附在伤口上。
[0201]
(2)背部全皮层缺损模型
[0202]
sd大鼠异氟醚吸入麻醉，背部毛发剔除，距大鼠耳朵后缘5cm处，打两个对称的直径为10mm的圆形创口，碘伏消毒，用手术缝合线将硅胶垫圈缝合在伤口处固定伤口。在创口上加上90μl水凝胶前体溶液，光照固化，拍照记录。大鼠术后单笼饲养，自由饮水、取食。
[0203]
(3)数据记录
[0204]
①
自背部伤口模型建立之日起，每天观察动物的行为和常规生理指标；
[0205]
②
术后，第3、6、10和14天观察并记录大鼠伤口愈合及周围炎症情况，利用image j软件计算测定创面面积并计算愈合率：
[0206]
愈合率(％)＝(初始伤口面积
–
当前伤口面积)/初始伤口面积
×
100％
[0207]
(4)统计分析
[0208]
创面愈合率：数据以平均值
±
标准差(x
±
s)表示，用spss17.0软件对统计数据进行单因素方差分析，以*p《0.05,**p《0.01和***p《0.001为差异有统计学意义。
[0209]
9.4结果
[0210]
动物行为和生理情况：自背部伤口模型建立之日起，每日观察，与正常动物相比较，未发现术后大鼠有明显行为学(活动频次和行为状态等)和生理学 (体重以及饮水饮食、排泄物等指标)指标异常。
[0211]
创面愈合率：于第0、3、6、10和14天对伤口拍照，计算创面愈合率，结果见图9的a和b。
[0212]
与对照组相比，从术后第3天开始，afg-g30实验组的伤口愈合率显著高于对照组(g30组和空白control组)，14天后伤口修复完整毛发丰富，未见显著疤痕，说明含afg水凝胶具有显著的促进急性创面愈合和修复的功效。
[0213]
【实施例10】糖胺聚糖基水凝胶应用于慢性创面愈合和修复
[0214]
10.1仪器
[0215]
zs-mv-iv型便携式小动物麻醉机，北京众实迪创科技发展有限责任公司；快速组织病理形态切片染色系统，包括石蜡包埋机、切片机和烤片机等，美国 thermo scientific公司。
[0216]
10.2试剂与材料
[0217]
主要试剂：链脲佐菌素(stz)，美国sigma公司；苏木素-伊红染色液、中性树胶和防脱载玻片等，长沙艾佳生物技术有限公司；异氟烷、碘伏、水合氯醛、二甲苯和无水乙醇等试剂为市售生物级或医用级试剂。
[0218]
实验动物：动物实验的全部过程遵守国务院颁布的《实验动物管理条例 (2017修订)》的规定。sd大鼠，雄性，300-350g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：scxk(湘)2019-0004。在实验前，大鼠置于恒温恒湿条件下，光-暗循环12h，适应环境至少一周。
[0219]
水凝胶材料：按照本发明所述糖胺聚糖基水凝胶的制备方法，分别制备 afg-g30、ha-g30和hep-g30三种糖胺聚糖基水凝胶(1％/4％)，以及无糖胺聚糖存在时仅有甲基丙烯酸化明胶制备水凝胶g30。
[0220]
10.3方法
[0221]
(1)糖尿病大鼠造模
[0222]
按照55mg/kg剂量大鼠腹腔注射stz，一周后，尾静脉采血检测大鼠血糖。若随机血糖≥16.7mmo/l，则糖尿病模型造模成功。
[0223]
(2)实验分组及方法
[0224]
按照糖尿病大鼠的体重大小均衡随机分为5组，每组8只。另设5只正常动物进行行为学及常规生理观察。
[0225]
空白对照(control)：生理盐水组，90μl/伤口(每个伤口90μl)。
[0226]
受试组：
[0227]
afg-g30(1％/4％，g/ml)组：90μl/伤口，加到伤口上后，立即405nm 光照2min，使前体溶液固化为水凝胶并牢固粘附在伤口上；
[0228]
ha-g30(1％/4％，g/ml)组：90μl/伤口，加到伤口上后，立即405nm光照2min，使前体溶液固化为水凝胶并牢固粘附在伤口上；
[0229]
hep-g30(1％/4％，g/ml)组：90μl/伤口，加到伤口上后，立即405nm 光照2min，使前体溶液固化为水凝胶并牢固粘附在伤口上；
[0230]
g30(4％固含量，g/ml)组：90μl/伤口，加到伤口上后，立即405nm光照2min，使前体溶液固化为水凝胶并牢固粘附在伤口上。
[0231]
(3)糖尿病溃疡造模
[0232]
糖尿病大鼠异氟醚吸入麻醉，背部毛发剔除，距大鼠耳朵后缘5cm处，打两个对称的直径为10mm的圆形创口，碘伏消毒，用手术缝合线将硅胶垫圈缝合在伤口处固定伤口。在创口上加上90μl水凝胶前体溶液，光照固化，拍照记录。大鼠术后单笼饲养，自由饮水、取食。
[0233]
(4)数据记录
[0234]
①
自糖尿病溃疡模型建立之日起，每天观察动物的行为和常规生理指标；
[0235]
②
术后，第3、6、10和14天观察并记录大鼠伤口愈合及周围炎症情况，利用image j软件计算测定创面面积并计算创面愈合率：
[0236]
③
治疗后第3、6、10及14天，异氟烷麻醉处死，留取伤口组织标本，一部分经4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，h&e染色；cd31、α-sma 作为新生血管的标志物进行免疫荧光染色，评估伤口组织的水肿及炎症、再上皮化和新生血管生成情况。
[0237]
(5)统计分析
[0238]
创面愈合率：数据以平均值
±
标准差表示，用spss17.0软件对统计数据进行单因素方差分析，以*p《0.05,**p《0.01和***p《0.001为差异显著性。
[0239]
组织病理评分：数据用平均值
±
标准差表示，采用k-w秩和非参数检验，以*p《0.05为差异有统计学意义。
[0240]
10.4结果
[0241]
动物行为变化：自糖尿病模型建立之日起，每日观察，未见糖尿病大鼠有明显行为学(活动频次和行为状态等)和生理学(体重以及饮水饮食、排泄物等指标)指标异常。
[0242]
创面周围炎症及创面愈合率：各组大鼠创面周围炎症均于第3天明显减轻。图9和图10分别显示各组的创面愈合照片和创面愈合率。afg-g30和ha-g30 组于第10天开始具有显著的促进愈合效果，与空白对照组(control)和g30组比有均有显著性差异，且afg-g30组极为显著(p《0.001)。g30组与空白对照组比有促进作用，但其愈合率显著低于afg-g30和ha-g30组。hep-g30在处理后短时间内即导致伤口严重出血，不适宜使用在创伤性伤口上。
[0243]
病理切片分析：对术后第6、10和14天大鼠皮肤创面及周围组织进行h&e 和cd31、α-sma的免疫荧光染色观察，并经表皮再生和新生血管形成等方面进行组织病理盲态评分，结果见图11和图12。与g30组比，afg-g30水凝胶可显著性促进伤口组织的再上皮化(图11)，在第6天后可显著促进新生血管形成 (图12)(p《0.05)，ha-g30水凝胶也能显著促进血管新生。
[0244]
图12的a中，a中的红色荧光表示α-sma阳性，绿色荧光表示cd31阳性，蓝色荧光表示dapi阳性，红色和绿色荧光两者(merge)代表新生血管。
[0245]
上述结果证实，以afg和ha为代表的糖胺聚糖基水凝胶具有显著的促进糖尿病创面愈合和修复的功能。
[0246]
【实施例11】糖胺聚糖基水凝胶显著降低糖尿病大鼠伤口组织炎症因子表达
[0247]
11.1材料
[0248]
(1)试剂及仪器：abi quantstudio 7 flex荧光定量pcr仪，美国abi公司；悬液芯片系统bio-plex 200，美国bio-rad公司；qpcr荧光定量试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；八因子检测试剂盒，包括il-6、tnf-α、ip-10、 il-1β等细胞因子，美国r&d公司。
[0249]
(2)生物样本：本发明实施例10实验的各组糖尿病大鼠的伤口组织。
[0250]
11.2方法
[0251]
分别将术后第3、10天和14天的糖尿病大鼠伤口组织匀浆，按标准流程提取 rna和蛋白，采用qpcr荧光定量试剂盒进行基因表达量分析测试，以及应用八因子检测试剂盒进行细胞因子蛋白表达量检测。
[0252]
11.3结果
[0253]
结果如图13、图14和图15所示，与空白对照组和g30组相比，糖胺聚糖基水凝胶处理组显著的抑制il-6、tnf-α、ip-10和il-1β促炎因子的基因水平和蛋白水平的表达，以第3天和第10天最为显著(p《0.05)；在第14天，afg-g30 水凝胶处理组的促炎细胞因子表达水平接近正常皮肤组织水平(未创伤皮肤组织的促炎细胞因子蛋白表达水平，unwound)，表明该组伤口已完全愈合而无炎症反应。
[0254]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0255]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种水凝胶生物材料，其特征在于，所述水凝胶生物材料具有糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶交联形成的三维网络结构，所述糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶之间的交联包括酰胺键共价交联，所述糖胺聚糖类物质为糖胺聚糖、糖胺聚糖的结构修饰物和糖胺聚糖的解聚产物中的至少一种。2.如权利要求1所述的水凝胶生物材料，其特征在于，所述糖胺聚糖的结构修饰物包括糖胺聚糖中糖环上羟基的烷基化产物、酰基化产物和硫酸酯化产物中的至少一种；和/或，所述糖胺聚糖的解聚产物包括自由基解聚法、beta-消除法和/或脱氨基解聚法制备的解聚产物。3.如权利要求2所述的水凝胶生物材料，其特征在于，所述羟基的烷基化为甲基化、乙基化、异丙基化、烯丙基化和苄基化中的至少一种，所述羟基的酰基化为乙酰化、丙酰化、苯甲酰化和苯乙酰化中的至少一种。4.如权利要求1所述的水凝胶生物材料，其特征在于，所述糖胺聚糖选自蜗牛糖胺聚糖、透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、岩藻糖化糖胺聚糖中的至少一种。5.如权利要求1至4任一项所述的水凝胶生物材料，其特征在于，所述甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化取代度为10％～100％。6.如权利要求1至4任一项所述的水凝胶生物材料，其特征在于，所述水凝胶生物材料的制备原料中，以质量份数计，所述糖胺聚糖类物质的质量份数为0.375～5份，甲基丙烯酰化明胶的质量份数为0.5～10份。7.如权利要求6所述的水凝胶生物材料，其特征在于，所述水凝胶生物材料的制备原料中，以质量份数计，所述糖胺聚糖类物质的质量份数为0.375～1.5份，甲基丙烯酰化明胶的质量份数为2～8份。8.一种水凝胶生物材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将糖胺聚糖类物质溶于生物相容性介质中并加入羧基活化剂，得到溶液a；所述糖胺聚糖类物质为糖胺聚糖、糖胺聚糖的结构修饰物和糖胺聚糖的解聚产物中的至少一种；将甲基丙烯酰化明胶溶于生物相容性介质中并加入光引发剂混匀，得到溶液b；将所述溶液a和所述溶液b混匀后得到水凝胶前体溶液，光照交联。9.如权利要求1至7任一项所述的水凝胶生物材料在制备创面组织修复药品或组织液渗透封堵用品的应用，或者作为药物、蛋白质和/或细胞的载体制备缓释制剂。10.一种创面组织修复药品，其特征在于，包含有如权利要求1至7任一项所述的水凝胶生物材料。11.一种组织液渗透封堵用品，其特征在于，包含有如权利要求1至7任一项所述的水凝胶生物材料。12.一种缓释制剂，其特征在于，采用如权利要求1至7任一项所述的水凝胶生物材料作为药物、蛋白质和/或细胞的载体。

技术总结
本发明涉及一种水凝胶生物材料及其制备方法和应用。所述水凝胶生物材料具有糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶交联形成的三维网络结构，所述糖胺聚糖类物质和甲基丙烯酰化明胶之间的交联包括酰胺键共价交联，所述糖胺聚糖类物质为糖胺聚糖、糖胺聚糖的修饰物和糖胺聚糖的解聚产物中的至少一种。该水凝胶生物材料的生物相容性较好、且可促进伤口愈合和可生物降解。物降解。物降解。


技术研发人员：吴明一 周志鹏 罗兰 高冬秀 陶买仙 邓拓 宋雪梅 蒋泽秀 孙路云
受保护的技术使用者：中国科学院昆明植物研究所
技术研发日：2022.01.25
技术公布日：2023/8/5