一种凝血酶液体冷冻制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种凝血酶液体冷冻制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.在交通事故和临床手术操作的突发性意外中，常容易引起大量出血，未能及时止血是伤亡的主要原因。因此，有效地控制出血状况是急救护理的首要环节，有一个广谱的止血材料来封闭出血点能大大降低患者死亡的机率。凝血酶是重要的凝血因子，属于胰凝乳蛋白酶家族，由凝血酶原酶复合物对无活性前体凝血酶原水解、切割而生成。凝血酶止血材料的止血原理是模拟人体内凝血的最后一步反应，但它并不依赖于机体自身的凝血成分，因此它对具有凝血功能障碍或正在服用抗凝药物的患者仍有理想止血效果。凝血酶有较强的专一性，其作用原理是能够直接作用于血中的纤维蛋白原，水解血纤维蛋白原的4个精氨酸-甘氨酸(arg-gly)肽键，促进其转化为不溶性纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，从而达到迅速止血的目的。
3.现今临床使用的凝血酶均来源于人或哺乳动物，须从人或动物的血浆中分离提取，而血浆原材料缺乏一直是困扰此类产品大规模应用的障碍。相较于人血浆的获取，猪血浆来源广泛。因此，近年来猪源凝血酶制剂临床应用广泛，市场销量连年增加。猪源纤维蛋白制剂的主要组分有猪源纤维蛋白原和凝血酶；其中临床应用中的主要问题是猪源凝血酶制剂是冻干粉制剂，临床使用时需要配制溶解后使用，这对于临床应用带来了不便，同时也限制了猪源凝血酶制剂的使用场景。另外，蛋白质冻干制剂可能存在配制使用，复原程序的错误可能性。生产过程中，蛋白冻干工艺过程耗时长，成本高。因此，猪源凝血酶液体冷冻制剂是临床上和大生产迫切需要的，一种稳定的高效的，便于临床给药，可拓展应用至紧急出血等多种临床场景的改良型制剂。
4.因为蛋白质稳定性与蛋白溶液环境、环境组成等密切相关。因此，为了增加蛋白质的稳定性，减少蛋白聚集体产生，有必要发明一种在冷冻下长期稳定性高的猪源凝血酶液体制剂，增加临床给药便利性。


技术实现要素：

5.为了提高凝血酶制剂稳定性及使用便捷性的技术问题，而提供一种凝血酶液体冷冻制剂及其制备方法和应用。本发明的凝血酶液体冷冻制剂在-20℃的条件下具有长期稳定性。
6.为了达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：
7.一种凝血酶液体冷冻制剂，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的凝血酶0.1-1mg/ml、表面活性剂0.1-10mg/ml、渗透压调节剂2.5-15mg/ml和稳定剂7-170mg/ml；
8.所述稳定剂为蔗糖、右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙中任意三种或三种以上的组合物。
9.进一步地，所述稳定剂为蔗糖、右旋糖酐、氯化钙的组合物，或者蔗糖、甘氨酸、氯
化钙的组合物，或者右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙的组合物，或者蔗糖、右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙的组合物；
10.所述蔗糖在所述制剂中的浓度为0-100mg/ml，所述右旋糖酐在所述制剂中的浓度为0mg-50mg/ml；所述甘氨酸在所述制剂中的浓度为0-10mg/ml；所述氯化钙在所述制剂中的浓度为2-6mg/ml。
11.进一步地，所述凝血酶为猪源凝血酶，所述凝血酶在所述制剂中的浓度为0.6mg/ml。
12.进一步地，所述ph缓冲体系为含组氨酸的缓冲体系、醋酸缓冲体系、氨丁三醇缓冲体系中的一种；所述含ph缓冲体系的水溶液的ph值为6-8。
13.优选地，所述ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，所述含ph缓冲体系的水溶液中组氨酸的浓度为10mmol/l，所述含ph缓冲体系的水溶液的ph值为6-7。
14.进一步地，所述表面活性剂为聚山梨酯80，所述表面活性剂在所述制剂中的浓度为0.5-1mg/ml。
15.进一步地，所述渗透压调节剂为氯化钠，所述渗透压调节剂在所述制剂中的浓度为2.5-7mg/ml。
16.本发明提供上述凝血酶液体冷冻制剂的制备方法，将凝血酶与含有ph缓冲体系的水溶液均匀混合，然后与表面活性剂、稳定剂、渗透压调节剂混合均匀，调节ph值为6-8，在零下温度下储存即得到凝血酶液体冷冻制剂。
17.本发明最后一方面提供上述凝血酶液体冷冻制剂在止血材料中的应用。
18.有益技术效果：
19.蛋白质溶液经过深度冷冻，在长期贮存过程中，可能会导致蛋白质构象不稳定和聚集现象，导致在使用时可能活性丧失。因此在冷冻过程中，需要通过选择最佳的溶液ph缓冲体系、加入合适的稳定剂或保护剂以实现蛋白质液体冷冻制剂的稳定贮存和生物学活性。本发明的凝血酶液体冷冻制剂在冷冻过程中，组氨酸-盐酸缓冲体系的ph不易发生变化，并配合表面活性剂和特定稳定剂组合，使凝血酶蛋白与特定的表面活性剂、稳定剂之间竞争冰-液体界面，从而起到抑制蛋白质变性，使得该冷冻制剂能够在-20℃下保持至少两年，特定稳定剂组合包括蔗糖、右旋糖酐、氯化钙的组合物，或者蔗糖、甘氨酸、氯化钙的组合物，或者右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙的组合物，或者蔗糖、右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙的组合物，均对蛋白活性具有较好的稳定作用；大大缩短临床上使用的制备时间，拓展了适用场景，增加了临床给药便利性。
附图说明
20.图1为实施例6的猪源凝血酶液体制剂在-20℃下不同保存时间下得到的非还原蛋白电泳图。
具体实施方式
21.下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使
用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
23.实施例1
24.一种凝血酶液体冷冻制剂，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的猪源凝血酶0.6mg/ml、表面活性剂聚山梨酯80 0.5mg/ml、渗透压调节剂氯化钠5.8mg/ml、稳定剂共7.25mg/ml；
25.其中稳定剂由蔗糖1mg/ml、甘氨酸3.75mg/ml、氯化钙2.5mg/ml组成；
26.其中含ph缓冲体系的水溶液中的ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，组氨酸在含ph缓冲体系的水溶液中的浓度为10mmol/l；
27.制备：在定量水溶液中加入10mmol/l的组氨酸，然后滴入适量盐酸调节溶液ph值为7.0得到含ph缓冲体系的水溶液(即含有组氨酸-盐酸缓冲体系的水溶液)；在含有组氨酸-盐酸缓冲体系的水溶液中加入0.6mg/ml猪源凝血酶，混合均匀后，加入表面活性剂聚山梨酯80 0.5mg/ml、稳定剂7.25mg/ml、渗透压调节剂氯化钠5.8mg/ml，均匀混合，最后调节ph值为7.0，得到凝血酶液体制剂。
28.采用se-hplc先测试凝血酶液体制剂起始条件下的蛋白聚集体含量，然后分别在4℃和-20℃下储存6个月测试蛋白聚集体含量。
29.实施例2
30.一种凝血酶液体冷冻制剂，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的猪源凝血酶0.6mg/ml、、表面活性剂聚山梨酯80 0.5mg/ml、渗透压调节剂氯化钠5.8mg/ml、稳定剂17.5mg/ml；
31.其中稳定剂由蔗糖5mg/ml、甘氨酸7.5mg/ml、氯化钙5mg/ml组成；
32.其中含ph缓冲体系的水溶液中的ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，组氨酸在含ph缓冲体系的水溶液中的浓度为10mmol/l；
33.制备方法与测试方法同实施例1。
34.实施例3
35.一种凝血酶液体冷冻制剂，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的猪源凝血酶0.6mg/ml、表面活性剂聚山梨酯80 0.5mg/ml、渗透压调节剂氯化钠5.8mg/ml、稳定剂16.25mg/ml；
36.其中稳定剂由右旋糖酐40 10mg/ml、甘氨酸3.75mg/ml、氯化钙2.5mg/ml组成；
37.其中含ph缓冲体系的水溶液中的ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，组氨酸在含ph缓冲体系的水溶液中的浓度为10mmol/l；
38.制备方法与测试方法同实施例1。
39.实施例4
40.一种凝血酶液体冷冻制剂，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的猪源凝血酶0.6mg/ml、表面活性剂聚山梨酯80 0.5mg/ml、渗透压调节剂氯化钠5.8mg/ml、稳定剂
62.5mg/ml；
41.其中稳定剂由右旋糖酐40 50mg/ml、甘氨酸7.5mg/ml、氯化钙5mg/ml组成；
42.其中含ph缓冲体系的水溶液中的ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，组氨酸在含ph缓冲体系的水溶液中的浓度为10mmol/l；
43.制备方法与测试方法同实施例1。
44.实施例5
45.一种凝血酶液体冷冻制剂，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的猪源凝血酶0.6mg/ml、表面活性剂聚山梨酯80 0.5mg/ml、渗透压调节剂氯化钠5.8mg/ml、稳定剂13.5mg/ml；
46.其中稳定剂由蔗糖1mg/ml、右旋糖酐40 10mg/ml、氯化钙2.5mg/ml组成；
47.其中含ph缓冲体系的水溶液中的ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，组氨酸在含ph缓冲体系的水溶液中的浓度为10mmol/l；
48.制备方法与测试方法同实施例1。
49.实施例6
50.一种凝血酶液体冷冻制剂，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的猪源凝血酶0.6mg/ml、表面活性剂聚山梨酯80 0.5mg/ml、渗透压调节剂氯化钠5.8mg/ml、稳定剂60mg/ml；
51.其中稳定剂由蔗糖5mg/ml、右旋糖酐40 50mg/ml、氯化钙5mg/ml组成；
52.其中含ph缓冲体系的水溶液中的ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，组氨酸在含ph缓冲体系的水溶液中的浓度为10mmol/l；
53.制备方法与测试方法同实施例1。
54.实施例7
55.一种凝血酶液体冷冻制剂，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的猪源凝血酶0.6mg/ml、表面活性剂聚山梨酯80 0.5mg/ml、渗透压调节剂氯化钠5.8mg/ml、稳定剂17.25mg/ml；
56.其中稳定剂由蔗糖1mg/ml、右旋糖酐40 10mg/ml、甘氨酸3.75mg/ml、氯化钙2.5mg/ml组成；
57.其中含ph缓冲体系的水溶液中的ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，组氨酸在含ph缓冲体系的水溶液中的浓度为10mmol/l；
58.制备方法与测试方法同实施例1。
59.实施例8
60.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例1，不同之处在于，制剂中聚山梨酯80的含量为1mg/ml。
61.对比例1
62.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例1，不同之处在于，制剂中将聚山梨酯80替换为1mg/ml的泊洛沙姆188。
63.对比例2
64.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例8，不同之处在于，制剂中将聚山梨酯80替换为5mg/ml泊洛沙姆188。
65.对比例3
66.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例2，不同之处在于，将制剂的稳定剂中甘氨酸替换为谷氨酸。
67.对比例4
68.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例2，不同之处在于，将制剂的稳定剂中甘氨酸替换为异亮氨酸。
69.对比例5
70.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例2，不同之处在于，将制剂的稳定剂中甘氨酸替换为精氨酸。
71.对比例6
72.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例6，不同之处在于，将制剂的稳定剂中右旋糖酐40替换为右旋糖酐20。
73.对比例7
74.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例6，不同之处在于，将制剂的稳定剂中蔗糖替换为海藻糖。
75.对比例8
76.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例6，不同之处在于，将制剂中的“组氨酸-盐酸ph缓冲体系”替换为其它ph缓冲体系，其中其他ph缓冲体系选自蛋白质常用缓冲体系：甘氨酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液。
77.其中甘氨酸盐缓冲液，甘氨酸的浓度为50mmol/l，采用适量氢氧化钠(浓度为200mmol/l)调整至ph为8.6左右。
78.其中醋酸盐缓冲液，醋酸钠浓度为200mmol/l，采用浓度为200mmol/l的醋酸将ph调整至5.6左右。
79.其中柠檬酸盐缓冲液，柠檬酸钠的浓度为100mmol/l的柠檬酸钠，采用浓度为100mmol/l的柠檬酸将ph调整至6.2左右。
80.对比例9
81.本实施例的制剂配方、制备方法与测试方法同实施例1，不同之处在于，制剂中不含稳定剂。
82.以上实施例及对比例的制剂配方见表1和表2。
83.表1实施例1-8及对比例1-2、9的制剂配方
[0084][0085][0086]
表2实施例2、实施例6与对比例3-8制剂配方的不同点
[0087][0088]
结果讨论
[0089]
(1)液体制剂配方的选择
[0090]
以上实施例及对比例的制剂不同配方的se-hplc的结果见表3、表4、表5和表6。
[0091]
表3实施例1-8及对比例9不同稳定剂组成的制剂的se-hplc的结果
[0092][0093]
由表3可知，实施例2的蔗糖、甘氨酸、氯化钙组合，实施例4的右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙组合以及实施例6的蔗糖、右旋糖酐、氯化钙组合可使得猪源凝血酶液体制剂具有较好的稳定性。更优选地，使用实施例6的蔗糖、右旋糖酐、氯化钙组合能够较高程度抑制液体制剂中酶蛋白的聚集。
[0094]
表4实施例1、8及对比例1-2不同表面活性剂的制剂的se-hplc结果
[0095][0096]
由表4可知，与含有泊洛沙姆188表面活性剂的制剂相比，本发明采用聚山梨酯80具有更少的酶蛋白聚集体。优选的，含有0.5-1mg/ml的聚山梨酯80具有更好的稳定性。
[0097]
表5实施例2、实施例6对比例3-7稳定剂组成中替换不同氨基酸、糖类的制剂的se-hplc结果
[0098][0099]
由表5可知，与实施例2对比，稳定剂中采用谷氨酸(对比例3)、异亮氨酸(对比例4)、精氨酸(对比例5)替换实施例2中的甘氨酸，se-hplc结果不佳。这说明在实施例2的稳定剂组合中甘氨酸与蔗糖、氯化钙具有较好的协同稳定蛋白的作用。
[0100]
对比例6与实施例6对比，采用右旋糖酐20替换本发明的右旋糖酐40，未见更优效果；对比例7中稳定剂中采用海藻糖替换本发明的蔗糖，效果不佳。由此说明实施例6中的稳定剂组合中蔗糖、右旋糖酐40、氯化钙三者具有较好的协同稳定蛋白的作用。
[0101]
表6实施例6、对比例8不同ph缓冲体系的制剂的se-hplc结果
[0102][0103][0104]
由表6可知，对比例8与实施例6对比，本发明的ph缓冲体系(组氨酸-盐酸缓冲体系，ph＝7，组氨酸浓度10mmol/l)配合特定稳定剂组合(蔗糖、右旋糖酐40、氯化钙)及聚山梨酯80对猪源凝血酶具有较好的蛋白稳定功能。
[0105]
(2)-20℃下长期保存的液体冷冻制剂的稳定性
[0106]
按照实施例6的配方得到猪源凝血酶液体制剂，然后在-20℃分别储存6个月、12个月、24个月之后，通过非还原蛋白电泳和se-hplc测试进行分析液体冷冻制剂的稳定性。se-hplc结果见表7，非还原蛋白电泳图如图1所示。
[0107]
表7
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20℃保存的液体冷冻制剂的稳定性
[0108][0109]
注：表7中起始值聚集体含量为1.08％、6个月的聚集体含量为1.21％与表3和表5中相应的值略有误差，这是由于不是同一批次制备的产品所造成的不可避免的误差，但误差在可接受的范围内。
[0110]
由表7可知，采用实施例6蔗糖、右旋糖酐40、氯化钙的稳定剂组成，并配合组氨酸-盐酸缓冲体系以及聚山梨酯80能够对猪源凝血酶起到较好的稳定作用，所制得的猪源凝血酶液体冷冻制即使在-20℃下仍具有两年较好的稳定性(低于3％的蛋白聚集体)，能够满足储存、运输、给药时的稳定性要求。另外，由图1的定性结果可见，本发明实施例6的猪源凝血酶液体冷冻制剂稳定性较好，储存24个月的猪源凝血酶液体冷冻制剂未发现有蛋白质明显降解和聚集体比例变化。
[0111]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种凝血酶液体冷冻制剂，其特征在于，包括在含ph缓冲体系的水溶液中混合均匀的凝血酶0.1-1mg/ml、表面活性剂0.1-10mg/ml、渗透压调节剂2.5-15mg/ml和稳定剂7-170mg/ml；所述稳定剂为蔗糖、右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙中任意三种或三种以上的组合物。2.根据权利要求1所述一种凝血酶液体冷冻制剂，其特征在于，的所述稳定剂为蔗糖、右旋糖酐、氯化钙的组合物，或者蔗糖、甘氨酸、氯化钙的组合物，或者右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙的组合物，或者蔗糖、右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙的组合物；所述蔗糖在所述制剂中的浓度为0-100mg/ml，所述右旋糖酐在所述制剂中的浓度为0mg-50mg/ml；所述甘氨酸在所述制剂中的浓度为0-10mg/ml；所述氯化钙在所述制剂中的浓度为2-6mg/ml。3.根据权利要求1所述一种凝血酶液体冷冻制剂，其特征在于，所述凝血酶为猪源凝血酶，所述凝血酶在所述制剂中的浓度为0.6mg/ml。4.根据权利要求1所述一种凝血酶液体冷冻制剂，其特征在于，所述ph缓冲体系为含组氨酸的缓冲体系、醋酸缓冲体系、氨丁三醇缓冲体系中的一种；所述含ph缓冲体系的水溶液的ph值为6-8。5.根据权利要求4所述一种凝血酶液体冷冻制剂，其特征在于，所述ph缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系，所述含ph缓冲体系的水溶液中组氨酸的浓度为10mmol/l，所述含ph缓冲体系的水溶液的ph值为6-7。6.根据权利要求1所述一种凝血酶液体冷冻制剂，其特征在于，所述表面活性剂为聚山梨酯80，所述表面活性剂在所述制剂中的浓度为0.5-1mg/ml。7.根据权利要求1所述一种凝血酶液体冷冻制剂，其特征在于，所述渗透压调节剂为氯化钠，所述渗透压调节剂在所述制剂中的浓度为2.5-7mg/ml。8.根据权利要求1-7任一项所述一种凝血酶液体冷冻制剂的制备方法，其特征在于，将凝血酶与含有ph缓冲体系的水溶液均匀混合，然后与表面活性剂、稳定剂、渗透压调节剂混合均匀，调节ph值为6-8，在零下温度下储存即得到凝血酶液体冷冻制剂。9.根据权利要求1-7任一项所述一种凝血酶液体冷冻制剂在止血材料中的应用。

技术总结
本发明涉及一种凝血酶液体冷冻制剂及其制备方法和应用，包括在含pH缓冲体系的水溶液中混合均匀的凝血酶0.1-1mg/mL、表面活性剂0.1-10mg/mL、渗透压调节剂2.5-15mg/mL和稳定剂7-170mg/mL；所述稳定剂为蔗糖、右旋糖酐、甘氨酸、氯化钙中的任意三种以上组合物；所述pH缓冲体系为组氨酸-盐酸缓冲体系；所述表面活性剂为聚山梨酯80；本发明凝血酶液体冷冻制剂的能够在-20℃下保存至少两年，对蛋白活性具有较好的稳定作用。有较好的稳定作用。有较好的稳定作用。


技术研发人员：樊婷婷 刘璐 张军东
受保护的技术使用者：上海昊海生物科技股份有限公司 上海建华精细生物制品有限公司
技术研发日：2022.01.25
技术公布日：2023/8/5