富集免疫球蛋白的血清蛋白浓缩物的制作方法

富集免疫球蛋白的血清蛋白浓缩物
1.本发明涉及具有高免疫球蛋白含量的血清蛋白浓缩物、其生产和用途。
2.在哺乳动物后代能够消化其他来源的食物之前，乳是它们的唯一营养源。所有泌乳动物的初乳和乳都含有免疫球蛋白(ig)，免疫球蛋白为后代提供针对微生物病原体和毒素的免疫保护，并保护乳腺免受感染。牛乳和人乳中的主要类别的免疫球蛋白是igg、iga和igm，这些免疫球蛋白在结构和生物活性上有所不同。igg可细分为igg1和igg2。在人乳中，主要的ig是iga。人母乳含有约85-90wt％的iga、约2-3wt％的igg、以及约8-10wt％的igm(j.a.cakebread等人,j.agric.food chem.[农业食品化学杂志],63(2015)7311-7316)。
[0003]
另一方面，在牛乳中，主要的ig是igg。成熟牛乳含有约80wt％的igg(绝大多数是igg1)、约10wt％的igm、以及约10％的iga。牛初乳的ig含量比成熟牛乳的ig含量高得多：初乳的总蛋白含量的70％-80％是ig，而在成熟牛乳中，这些ig只占总蛋白含量的小于1wt％。
[0004]
人们一直希望生产与人母乳尽可能相似的婴儿配方乳。因此，为实现此目标，人们希望增加婴儿配方乳中的活性免疫球蛋白含量。
[0005]
通常，通过将乳与至少一种乳清蛋白源、至少一种脂质源、至少一种碳水化合物源、以及维生素和矿物质组合来制备婴儿配方乳。
[0006]
乳清蛋白源优选地选自乳清蛋白浓缩物(wpc)和血清蛋白浓缩物(spc)。这两种产物都是通过凝乳(即奶酪制作)、酸化或微过滤将脱脂乳分离成富含酪蛋白级分和富含乳清蛋白级分的结果。免疫球蛋白存在于乳清相而非酪蛋白胶束相中，因此被认为是乳清蛋白。
[0007]
乳清蛋白浓缩物(wpc)是通过对酸或干酪乳清进行超过滤和/或反渗透以及任选地去矿化而获得的产物。通过超过滤，大部分的水、乳糖和灰分从产物中去除，从而将乳清蛋白浓缩。反渗透可用于去除水并进一步浓缩wpc。
[0008]
血清蛋白浓缩物(spc)也是浓缩的乳清蛋白产物，与wpc的不同之处在于乳清级分的来源。与酸或干酪乳清相反，spc中的乳清蛋白来自于脱脂乳的微过滤。所述微过滤产生浓缩的酪蛋白渗余物(retentate)级分和含有大部分乳清蛋白作为渗透物(permeate)级分的血清级分。常规地，对这种渗透物级分然后进行超过滤和/或反渗透以去除乳糖、灰分和水。
[0009]
基于总血清蛋白，常规spc的免疫球蛋白含量低于6wt％。这与成熟牛乳中的含量相当，这意味着常规的spc制备不会导致ig含量的显著富集。
[0010]
本发明涉及提供具有高于常规spc的免疫球蛋白含量的血清蛋白浓缩物，以及导致总ig含量相对于总血清蛋白富集至少1.5倍、优选地至少1.7倍、最优选地至少2.0倍的方法。根据本发明的spc含有基于总血清蛋白的8-12wt％、优选地10-12wt％的免疫球蛋白(即igg+iga+igm)。
[0011]
通过测定总蛋白含量并减去该总蛋白含量中的非蛋白氮(npn)和酪蛋白含量来测定总血清蛋白含量；全部通过熟知的凯氏定氮法(kjeldahl method)(换算系数6.38)来测定。
[0012]
可使用如下所述的牛igg、iga和igm elisa定量集合测定免疫球蛋白含量：r.l.valk-weebera,t.eshuis-de ruiter,l.dijkhuizen和s.s.van leeuwen,
international dairy journal[国际乳制品杂志],第110卷,2020年11月,104814)。
[0013]
应注意的是，wo 2004/094027披露了在短螺旋中空纤维膜上对乳、优选地含有人免疫球蛋白的转基因乳进行微过滤，随后使用100kda膜进行超过滤(uf)。进行微过滤的进料已含有高水平的人免疫球蛋白。然而，在本发明的方法中使用的成熟牛乳的ig含量要低得多。
[0014]
us 2003/059512披露了使用mwco为100-3000kda的膜对脱脂乳进行微过滤，随后在50-300kda下进行过滤，产生含有ig和白蛋白的渗余物。本文件未提及使mf渗透物富集ig含量所需的条件。
[0015]
根据本发明的spc可通过使用孔径在85-200nm的范围内、温度在10℃-15℃或50℃-55℃的范围内、错流为1-2.4m/s、以及跨膜压力为0.25-1巴的膜，对包含用水以0.5-1.5的体积比稀释的成熟牛脱脂乳的进料流进行微过滤(mf)获得。富集ig的spc作为mf渗透物获得。
[0016]
与总血清蛋白相比，这样的膜孔径和条件允许免疫球蛋白(尤其是igg)的选择性渗透，从而富集mf渗透物中相对于总血清蛋白的免疫球蛋白含量。这与常规的乳微过滤形成对比，在常规的乳微过滤中，免疫球蛋白的渗透对总血清蛋白没有选择性。
[0017]
本发明涉及始于成熟牛乳的富集免疫球蛋白的spc的生产。
[0018]
尽管牛初乳含有比成熟牛乳多得多的免疫球蛋白，但使用牛初乳来生产富集免疫球蛋白的spc仍非选择。首先，初乳的组分(例如，其高浓度的乳清蛋白)使得其倾向于沉淀在热交换器和蒸发器的表面上，从而导致它们的清洁和维护方面出现问题。此外，初乳的使用引发了伦理问题，因为它剥夺了新生小牛在其生命最初几天的必要营养。
[0019]
在本发明的上下文中，成熟牛乳是牛乳而非初乳。初乳是产犊后前三天的乳。与成熟乳相比，初乳具有更高水平的脂肪、乳清蛋白(包括ig)、维生素和矿物质，以及更低水平的乳糖和酪蛋白。
[0020]
根据本发明的并且根据权利要求1所述的方法生产的spc包含基于总血清蛋白的8-12wt％、优选地10-12wt％的免疫球蛋白(igg+iga+igm)。
[0021]
根据本发明的方法涉及在孔径在85-200nm、优选地85-150nm、最优选地90-110nm的范围内的膜上对成熟牛脱脂乳进行微过滤(mf)。所有常规类型的微过滤膜(螺旋缠绕膜、陶瓷膜、中空纤维膜等)都可以使用，但中空纤维膜是优选。可以使用任何中空纤维膜，但优选使用具有直中空纤维的模块。中空纤维膜的直径优选地在0.8-3mm、更优选地在1.0-2.0mm的范围内，长度优选地在0.75-1.5m的范围内。
[0022]
该膜可以由各种类型的聚合物构建，例如聚砜(ps)、(改性)聚醚砜、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚丙烯腈(pan)、乙酸纤维素(ca)和聚丙烯(pp)。
[0023]
与常规的微过滤膜(例如螺旋缠绕膜和陶瓷膜)相比，中空纤维膜允许免疫球蛋白与其他乳清蛋白相比具有更高的透过率，从而导致mf渗透物中更高的ig含量。
[0024]
中空纤维膜的另外的优点是其紧凑的系统设计、低容纳体积以及因此更低的清洁成本。中空纤维膜模块的垂直位置允许在生产运行结束时获得更高的产物回收率。
[0025]
将要进行微过滤的成熟牛脱脂乳用水以0.5-1.5、优选地0.75-1.25、以及最优选地约1的水/乳体积比稀释。
[0026]
穿过膜的跨膜压力(tmp)在0.25-1巴、优选地0.5-1巴的范围内。
[0027]
微过滤步骤在温度在10℃-15℃或50℃-55℃的范围内、优选地在50℃-55℃的范围内进行。
[0028]
错流在1-2.4m/s、优选地1.5-2.4m/s的范围内。
[0029]
为了进一步增加免疫球蛋白的产量，需要进行渗滤。
[0030]
可以以固定的体积浓缩因子(vcf)对稀释乳进行浓缩或渗滤。
[0031]
在一个实施例中，使用截留分子量在400-800kda、优选地400-600kda、最优选地400-500kda的范围内或孔径在25-100nm、优选地50-100nm、最优选地50-60nm的膜对通过本发明的方法获得的mf渗透物进行进一步过滤。所得的渗余物甚至进一步富集了igg含量。
[0032]
在该进一步过滤之前，可将mf渗透物酸化至血清蛋白β-乳球蛋白的等电点。在另一实施例中，可以将阴离子交换色谱法应用于mf渗余物以选择性地去除血清蛋白。
[0033]
可以进一步浓缩、去矿化、和/或(喷雾)干燥由本发明的方法得到的spc以制备粉末状产品。根据本发明的spc特别适合用作生产营养组合物、特别是配方乳的成分。配方乳选自下组：婴儿配方乳、较大婴儿配方乳和成长型配方乳。因此，本发明进一步涉及营养组合物、典型地用于儿童的营养组合物，例如配方乳、特别是婴儿配方乳、较大婴儿配方乳或成长型配方乳。
[0034]
营养组合物、特别是配方乳，可通过将spc与至少一种脂质源、碳水化合物源、维生素和矿物质组合来制备。
[0035]
脂质源可以是适合在配方乳中使用的任何脂质或脂肪。优选的脂肪源包括乳脂肪、红花籽油、蛋黄脂质、菜籽油、橄榄油、椰子油、棕榈仁油、大豆油、鱼油、棕榈油精、高油酸葵花籽油和高油酸红花籽油、以及含有长链多不饱和脂肪酸(lc-pufa)的微生物发酵油。在一个实施例中，使用无水乳脂肪。脂质源也可以是源自这些油例如棕榈油精、中链甘油三酯，和脂肪酸例如花生四烯酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸、亚麻酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸等的酯的级分形式。也可以添加少量的含有大量预先形成的花生四烯酸和二十二碳六烯酸的油，例如鱼油或微生物油。脂肪源优选地具有约5:1至约15:1；例如约8:1至约10:1的n-6与n-3脂肪酸比率。在一个特定方面，婴儿配方乳包含油混合物，该油混合物包含酯化成三酰基甘油的棕榈酸；例如，具有在三酰基甘油的sn-2位的20-60wt％的棕榈酸以及sn-1/sn-3位的40-80wt％的棕榈酸。
[0036]
优选地存在于配方乳中的维生素和矿物质的实例为维生素a、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12、维生素e、维生素k、维生素c、维生素d、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、钙、磷、碘、铁、镁、铜、锌、锰、氯化物、钾、钠、硒、铬、钼、牛磺酸和l-肉碱。矿物质通常以盐的形式添加。
[0037]
优选地存在于配方乳中的碳水化合物的实例为乳糖、不可消化的寡糖(例如半乳寡糖(gos)和/或果寡糖(fos))和人乳寡糖(hmo)。
[0038]
如有必要，营养组合物可含有乳化剂和稳定剂，例如大豆卵磷脂、单甘油和二甘油的柠檬酸酯等。营养组合物也可含有可能具有有益效果的其他物质，例如乳铁蛋白、核苷酸、核苷等。
[0039]
实例
[0040]
实例1
[0041]
本实验中使用了75cm长度和1.5mm纤维直径的中空纤维膜(0.1μm孔径，pes)。使用
3.5l巴氏杀菌脱脂乳的进料并将其与3.5l的脱矿质水预混合用于渗滤。通过错流为2.4m/s且tmp为1巴、操作温度为50℃的中空纤维膜浓缩进料。将总进料(7l)浓缩至体积浓缩因子(vcf)为2.8至2.5l的mf渗余物，并且将mf渗透物(4.5l)收集作为富集igg的产物。
[0042]
进料、mf渗余物和mf渗透物中的igg、iga和igm的浓度通过elisa测量，并且总血清蛋白含量通过凯氏定氮法测量。结果示于表1中。
[0043]
可以看出，相对于总血清蛋白，mf渗透物中的总ig含量是进料中的约2.5倍。
[0044]
表1
[0045] 进料mf渗透物mf渗余物igg[ppm]122.0169.22241.80iga[ppm]11.804.2942.21igm[ppm]9.130.3225.83血清蛋白[wt％]0.320.061.00相对于血清蛋白的总ig[wt％]4.4811.543.08
[0046]
实例2
[0047]
重复实例1，不同之处在于通过定期添加脱矿质水，直到添加3.5l脱矿质水为止，以1的恒定vcf过滤总进料(7l)。
[0048]
表2总结了进料、mf渗透物和mf渗余物中相关蛋白的组成。可以看出，相对于总血清蛋白，mf渗透物中的总ig含量是进料中的约1.8倍。
[0049]
表2
[0050]
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进料mf渗透物mf渗余物igg[ppm]143.233.9152.3iga[ppm]19.32.424.6igm[ppm]39.22.635.7血清蛋白[wt％]0.330.040.41血清蛋白中的总ig纯度[wt％]6.1210.815.20

技术特征：
1.一种用于生产富集免疫球蛋白的血清蛋白浓缩物(spc)的方法，所述方法包括对进料流进行微过滤(mf)，该进料流包含用水稀释至0.5-1.5的水/乳体积比的成熟牛脱脂乳，进行中的该微过滤使用孔径在85-200nm的范围内、温度在10℃-15℃或50℃-55℃的范围内、错流为1-2.4m/s、以及跨膜压力为0.25-1巴的膜，从而产生作为mf渗透物的该血清蛋白浓缩物。2.根据权利要求1所述的方法，其中该血清蛋白浓缩物包含基于总血清蛋白的8-12wt％、优选地10-12wt％的免疫球蛋白。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该膜为中空纤维膜。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该血清蛋白浓缩物相对于总血清蛋白的免疫球蛋白含量是该成熟牛脱脂乳相对于总血清蛋白的免疫球蛋白含量的至少1.5倍、优选地至少1.7倍、最优选地至少2.0倍。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将要进行微过滤的该成熟牛脱脂乳用水稀释至0.75-1.25、以及最优选地约1的水/乳体积比。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在温度处于50℃-55℃的范围内进行微过滤。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该跨膜压力为0.5-1巴。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用截留分子量在400-800kda、优选地400-600kda、最优选地400-500kda的范围内或孔径在25-100nm、优选地50-100nm、最优选地50-60nm的膜对该mf渗透物进行进一步过滤。9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述进一步过滤之前，将该mf渗透物酸化至β-乳球蛋白的等电点。10.一种血清蛋白浓缩物，其可通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得。11.一种营养组合物，其选自包含根据权利要求10所述的血清蛋白浓缩物的婴儿配方乳、较大婴儿配方乳和成长型乳。12.一种用于生产根据权利要求11所述的营养组合物的方法，该方法通过将根据权利要求10所述的血清蛋白浓缩物与至少一种脂肪源、碳水化合物源以及维生素和矿物质组合而进行。

技术总结
披露了一种用于生产富集免疫球蛋白的血清蛋白浓缩物(SPC)的方法，所述方法包括对进料流进行微过滤(MF)，该进料流包含用水稀释至0.5-1.5的水/乳体积比的成熟牛脱脂乳，进行中的该微过滤使用孔径在85-200nm的范围内、温度在10℃-15℃或50℃-55℃的范围内、错流为1-2.4m/s、以及跨膜压力为0.25-1巴的膜，从而产生作为MF渗透物的该血清蛋白浓缩物。生作为MF渗透物的该血清蛋白浓缩物。


技术研发人员：李维为 C
受保护的技术使用者：菲仕兰坎皮纳荷兰公司
技术研发日：2021.12.15
技术公布日：2023/8/5