一种免疫增强剂、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及兽用疫苗技术领域，尤其涉及一种免疫增强剂、制备方法及其应用。


背景技术：

2.免疫增强剂通常指的是在单用或与抗原同时使用时可增强机体免疫应答的物质，亦被称为免疫调节剂或免疫刺激剂。免疫增强剂可通过不同的作用途径发挥作用，如增强巨噬细胞的活性、增强抗原物质的免疫原性和稳定性以及促进抗体的合成与分泌等，从而增强机体的特异性和非特异性免疫应答。
3.目前，兽用疫苗多以油佐剂和水佐剂制备灭活疫苗，防控各类病毒性和细菌性疾病。这些疫苗在清除和防控病原方面发挥了重要作用，但仍存在免疫效力方面的缺陷，主要包括以下几个方面：
4.第一，矿物油佐剂的灭活疫苗免疫机体后几乎不产生粘膜抗体。然而，黏膜是感染发生的首要部位，机体95％的感染发生在黏膜，病原体一旦从黏膜突围至机体，很容易引起感染；此外多种病原体如病毒、支原体和细菌等也可以在黏膜中滋生，黏膜的损伤以及黏膜免疫功能的紊乱，将为病原提供感染机体的跳板；黏膜还是机体抵御感染的主战场，从数量上说，黏膜免疫是机体最大的免疫系统，提高粘膜免疫应答，可以将病毒等病原体在即将进入宿主时清除或阻拦，从而降低感染疫病的风险。
5.第二，水佐剂的灭活疫苗免疫持续期短，疫苗免疫后，一般在免疫后第3周达到有效保护的合格抗体，导致有较长的时间处于无法对野外变异毒株提供有效保护的状态，进而给临床生产带来很大的疫病风险。
6.第三，无论是哪种佐剂，都需要较高的抗原含量。兽用疫苗采用提高抗原量来提高疫苗免疫后的效力，但受限于低廉的价格，导致疫苗抗原纯度差，杂蛋白较多，也导致副反应较大。
7.第四，矿物油佐剂用量较大，机体免疫后副反应较大。为了提升免疫效力，一方面提高抗原含量，另一方面加大油佐剂的使用量，使免疫刺激反应加重，影响疫苗产品质量。
8.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

9.为解决上述技术问题，本发明提供一种免疫增强剂及其制备方法和应用。所述免疫增强剂能提高兽用疫苗质量，使兽用疫苗产生高水平的体液、细胞及黏膜免疫反应，且抗体产生期短，抗体效价高，持续期长。所述免疫增强剂能在保证疫苗效力的前提下，有效降低抗原用量，降低副反应，降低生产成本。所述免疫增强剂还有助于提升疫苗免疫效果，使机体产生消除性免疫。
10.具体的，本发明的技术方案如下：
11.第一方面，本发明提供了一种免疫增强剂，包括如下质量份的组分：25-60份脂质体和4-6份cpg核苷酸。
12.在本发明中，按质量份计，所述脂质体的用量为25-60份，优选为40-50份，更优选为45份。所述cpg的用量为4-6份，优选为5份。
13.脂质体类似于生物膜，一般由磷脂和胆固醇形成的双分子层包被抗原形成的超微球状制剂，既能够运输抗原，又可作为疫苗的佐剂。cpg寡聚脱氧核苷酸(cpg oligodeoxynucleotides,cpg odn)，又称cpg核苷酸，能识别toll样受体9(tlr9)，进而激活b细胞，抑制b细胞凋亡和诱导树突状细胞的成熟分化；在小鼠模型中，cpg核苷酸能促进th1型免疫反应，提高ifnγ、tnf-α、il-12细胞因子的分泌及ig g2a抗体和特有ctl反应；另外，cpg核苷酸还能提高乙型肝炎表面抗原在非人类灵长类动物和人类的抗体反应；与人用炭疽吸附疫苗结合，可诱导小鼠、猕猴和人类产生更强的炭疽特异性体液免疫反应。
14.本发明所述免疫增强剂中包括脂质体和cpg核苷酸，其中，脂质体具有极强的运载药物的能力，cpg核苷酸可通过tlr9信号通路有效引发哺乳动物免疫反应。脂质体和cpg核苷酸联用，能显著提升疫苗的免疫效果，使免疫应答更快、更强。
15.本发明对所述脂质体和cpg核苷酸的来源不作特别限定，已知的或常规市售来源的脂质体产品、cpg核苷酸即可用作本发明原料。例如，cpg核苷酸可由订制厂家锐博生物有限公司购买得到。
16.在本发明优选的实施方式中，所述脂质体包括磷脂、胆固醇和生育酚。其中，磷脂和胆固醇的质量比例优选为(10-30):(10-20)，更优选为(15-20):(12-20)，更优选为15:20；磷脂和生育酚的质量比例优选为(10-30):(5-10)，更优选为(15-20):10，更优选为15:10。
17.磷脂是生物体正常新陈代谢和健康生存的必不可少的物质，对体内的细胞活化、生存及器官功能的维持、肌肉关节的活化、脂肪代谢、机体免疫力等都起到非常重要的作用。磷脂有乳化分散的作用，有助于药物的转运和吸收；其可用于构建细胞膜，有助于将抗原递呈给抗原处理细胞；可组成磷脂双分子层，既能够运输抗原，又可作为疫苗的佐剂。
18.胆固醇有形成胆酸、构成细胞膜、合成激素的作用，是构成脂质体细胞膜的重要组成成分，维持其正常的结构和功能，形成的激素是协调多细胞机体中不同细胞代谢作用的化学信使，参与机体各种物质的代谢，对维持机体正常的生理功能十分重要。
19.生育酚具有较强的抗氧化性，可维持和促进人体多种机能，起到抗氧化效果，改善脂肪代谢，增强免疫的作用。其中，生育酚及其衍生物提高机体免疫功能主要是通过增强b淋巴细胞的体液免疫、增强巨噬细胞的吞噬功能、提高t淋巴细胞的细胞免疫、增强相关细胞的抗原呈递功能来实现。
20.本发明利用上述优选方案中具有特定比例组成的脂质体作为疫苗病毒的主要载体，有助于降低抗原毒性，促进抗原在宿主体内的降解。且上述优选方案中具有特定比例组成的脂质体能够进一步增强机体的体液免疫应答和细胞免疫应答，其结构有利于将抗原递呈给抗原处理细胞。
21.本发明对磷脂、胆固醇和生育酚的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的具体实施方式中，所述磷脂为蛋黄卵磷脂，购买自河北斯维生物技术有限公司，货号e-30；所述胆固醇购买自上海璧合生化科技有限公司，货号rwe20220112；所述生育酚为α-生育酚，购买自上海惠诚生物科技有限公司，货号cas:59-02-9。
22.在本发明优选的实施方式中，所述cpg核苷酸的序列为
agcgctttatagtcgacgtcaacgtt(seq id no:1)。
23.seq id no:1所示序列的cpg核苷酸与脂质体联用，在非特异性免疫和特异性免疫(包括提高共免疫抗原的特异性免疫应答、提高细胞毒性t细胞反应、提高免疫球蛋白的产量等)方面，均表现出明显作用。
24.seq id no:1所示序列的cpg核苷酸具有相较更好的通用性，能在不同类型的抗原(如猪流行性腹泻抗原、猪传染性胃肠炎抗原、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原、猪冠状病毒抗原、猪伪狂犬灭活抗原、猪口蹄疫o型灭活抗原、猪口蹄疫a型灭活抗原、牛轮状灭活抗原和牛副流感灭活抗原)免疫反应中激发系统免疫(包括体液免疫和细胞免疫)功能和黏膜抗原特异性免疫应答。
25.在本发明更具体的实施方式中，seq id no:1所示序列的cpg核苷酸由北京华大科技有限公司合成，合成时将其骨架作硫代修饰。
26.进一步的，在本发明中，所述免疫增强剂优选还包括30-70份的植物多糖；所述植物多糖包括黄芪多糖和当归多糖。
27.黄芪多糖是黄芪根提取物中主要的生物活性成分，其能刺激巨噬细胞活性，促进t细胞增殖，还能促进表面抗原在淋巴细胞中的表达，诱导较强的体液和细胞免疫应答，在非特异性及特异性免疫反应中发挥作用。黄芪多糖具有免疫调节，改善免疫应答，缓解环境应激造成的免疫功能紊乱等多种功能。
28.当归多糖是当归中的主要成分之一，在抗肿瘤、肝损伤、免疫增强等方面具有明显的作用，能抑制环磷酰胺引起的小鼠脾脏萎缩和胸腺萎缩，也能对抗氢化可的松引起的小鼠脾脏萎缩，增加小鼠脾重，而对于正常及免疫抑制小鼠胸腺影响不大。当归多糖可使荷瘤小鼠的巨噬细胞数目及吞噬能力及脾细胞的nk活性显著增加，从而提高主动免疫治疗效应；促进小鼠淋巴细胞增殖，提高il-2和血清抗体的水平。
29.本发明在免疫增强剂的组成成分中加入黄芪多糖和当归多糖。黄芪多糖和当归多糖联用，可显著增强cpg核苷酸诱导的黏膜免疫反应。且本发明的免疫增强剂以特定比例组成的脂质体为载体，能显著提升多糖化合物的运载和吸收能力，延长体内半衰期；在靶向免疫器官和免疫细胞的同时，改善多糖化合物的药动学性质，提高多糖化合物的效果；减轻不良反应。
30.优选的，黄芪多糖和当归多糖质量比例为(10-30):(20-40)，更优选为(15-25):(25-35)，更优选为20:30。上述比例组成的植物多糖效果相较更好。
31.本发明对黄芪多糖和当归多糖的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的具体实施方式中，黄芪多糖购买自青岛万康生物科技有限公司，当归多糖购买自江西天施康中药股份有限公司。
32.在本发明中，所述免疫增强剂的各组分原料来源广泛，黄芪多糖、当归多糖为多糖化合物中药成分，磷脂、生育酚、胆固醇等为天然物质，安全性可靠。
33.进一步的，在本发明优选的部分实施方式中，所述疫苗增强剂包括如下质量份的组分：15份磷脂、20份胆固醇、10份生育酚、20份黄芪多糖、30份当归多糖和5份cpg核苷酸。
34.或者，20份磷脂、12份胆固醇、7份生育酚、22份黄芪多糖、35份当归多糖和4份cpg核苷酸。
35.或者，20份磷脂、15份胆固醇、5份生育酚、25份黄芪多糖、30份当归多糖和5份cpg
核苷酸。
36.或者，26份磷脂、20份胆固醇、10份生育酚、15份黄芪多糖、25份当归多糖和4份cpg核苷酸。
37.或者，18份磷脂、18份胆固醇、8份生育酚、20份黄芪多糖、30份当归多糖和6份cpg核苷酸。
38.第二方面，本发明提供了所述免疫增强剂的制备方法，包括如下步骤：
39.s1、将所述免疫增强剂的原料溶解，混合，得到混合溶液；
40.s2、去除所述混合溶液的溶剂，得到固形物。
41.在本发明优选的实施方式中，所述脂质体包括磷脂、胆固醇和生育酚。其中，磷脂和胆固醇的溶解溶剂优选包括三氯甲烷；生育酚的溶解溶剂优选包括乙醇；黄芪多糖、当归多糖和cpg核苷酸的溶解溶剂优选包括注射水。
42.在本发明中，步骤s1优选采用如下步骤：将磷脂和胆固醇溶解于三氯甲烷，得到溶液a；将生育酚溶解于乙醇，得到溶液b；将黄芪多糖、当归多糖和cpg溶解于注射水中，振荡混匀，静置后过滤，收集上清液，得到溶液c；再将溶液a、溶液b和溶液c混合，得到混合溶液。本发明优选的溶解步骤有助于使各组分充分溶解，形成脂质体网状结构。其他能使各组分充分溶解形成脂质体网状结构的方法亦可。比如，将各组分分别加入合适的溶剂中溶解得到6种不同的溶液后，再将各溶液混合得到混合溶液。
43.在本发明中，步骤s2去除溶剂的方法优选包括旋转蒸发；所述旋转蒸发的温度优选为40-50℃，转速优选为100-200r/min。
44.本发明提供的免疫增强剂是一种复合增强剂，其可以是固体剂型(如冻干粉)，也可以添加注射用分散液(如pbs溶液或者生理盐水等)，制成免疫增强剂分散液。
45.第三方面，本发明提供了一种免疫增强剂分散液，包括所述免疫增强剂或者所述制备方法制备得到的免疫增强剂，还包括注射用分散液。
46.在本发明中，所述免疫增强剂在所述免疫增强剂分散液中的浓度为80-120g/l，优选为90-110g/l，更优选为100g/l。
47.在本发明中，所述免疫增强剂分散液的制备方法优选在前述免疫增强剂的制备方法基础上，进一步地包括步骤s3：将步骤s2得到的固形物溶解于注射用分散液中，超声处理，过滤。
48.其中，步骤s3所述超声处理的温度优选为20-30℃；所述超声处理的功率优选为50-70w；所述超声处理的总时长优选为20-30min；所述超声处理的循环周期优选为：超声8-12s，间隔8-12s，更优选为超声10s，间隔10s。
49.进一步的，步骤s3所述过滤的滤孔规格优选为0.10-0.22μm，更优选为0.22μm。该过滤范围可达到良好的除菌目的。
50.超声和过滤处理后，得到的免疫增强剂安全性好，且更为均一、稳定。
51.在本发明更具体的实施方式中，所述免疫增强剂的制备方法包括如下步骤：
52.t1：将10-30g蛋黄卵磷脂和10-20g胆固醇溶解在100ml三氯甲烷中混合，完全溶解得到溶液a；
53.t2：将5-10g生育酚溶解在100ml 95％的无水乙醇中，完全溶解得到溶液b；
54.t3：将10-30g黄芪多糖、20-40g当归多糖及4-6g cpg溶解在800ml纯化水中，进行
震荡混匀，静置后过滤，收集上清液，得到溶液c；
55.t4：将步骤t1中得到的溶液a，步骤t2中得到的溶液b及步骤t3中得到的溶液c，均匀震荡混合，得到混合溶液d；
56.t5：将步骤t4中得到的混合溶液d转移至旋转蒸发仪中，40-50℃，100-200r/min条件下旋转蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发仪烧瓶内壁形成固形物；
57.t6：用1l pbs溶液溶解步骤t5得到的固形物，得到第一混合溶液；
58.t7：对步骤t6得到的第一混合溶液进行50-70w超声处理，超声处理的温度为20-30℃，总时长为20-30min，循环周期为：超声8-12s，间隔8-12s。超声处理后，得到颗粒物分散均匀、稳定性好、粒径小的第二混合溶液；
59.t8：对步骤t7得到的第二混合溶液用0.10-0.22μm滤膜过滤处理，得到第三混合液。
60.通过本发明所述方法制备得到的免疫增强剂，其原料中使用了蛋黄卵磷脂、胆固醇、黄芪多糖、当归多糖、cpg核苷酸和α-生育酚，可形成稳定的双分子层，具有高效运载药物的能力，无毒无副作用。同时，黄芪多糖和当归多糖作为中药成分，能刺激巨噬细胞活性，促进t细胞增殖，还能促进表面抗原在淋巴细胞中的表达，诱导较强的体液和细胞免疫应答；cpg核苷酸(cpg odns)作为黏膜免疫佐剂，既有激发系统免疫(包括体液免疫和细胞免疫)的功能，又可以激发黏膜抗原特异性免疫应答，除对非特异性免疫有影响外，还能提高共免疫抗原的特异性免疫应答，不仅提高细胞毒性t细胞反应，而且能提高免疫球蛋白的产量。利用本发明提供的增强剂制备得到的疫苗(例如，使用其制备得到的猪急性腹泻综合征冠状病毒灭活疫苗)可有效提升黏膜免疫反应。
61.第四方面，本发明提供了所述免疫增强剂，或者所述制备方法制备得到的免疫增强剂，或者所述免疫增强剂分散液在制备疫苗中的应用。
62.第五方面，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包括灭活抗原，还包括所述免疫增强剂，或者所述制备方法制备得到的免疫增强剂，或者所述免疫增强剂分散液。
63.优选的，所述灭活抗原包括猪流行性腹泻抗原、猪传染性胃肠炎抗原、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原、猪冠状病毒抗原、猪伪狂犬灭活抗原、猪口蹄疫o型灭活抗原、猪口蹄疫a型灭活抗原、牛轮状灭活抗原和牛副流感灭活抗原中的一种或者多种。
64.其中，猪流行性腹泻病毒以黏膜免疫为主，因此，本发明在后续的实施例中主要应用猪流行性腹泻病毒灭活疫苗对本发明所述免疫增强剂的免疫效果进行评价。
65.有益效果：
66.本发明提供了一种免疫增强剂、制备方法及其应用。所述免疫增强剂包括特定比例的脂质体和cpg核苷酸，cpg核苷酸可通过tlr9信号通路有效引发哺乳动物免疫反应，可用于抗感染和增强免疫反应。脂质体与cpg核苷酸复配能显著提升疫苗的免疫效果，激发黏膜抗原的特异性免疫应答。
67.进一步的，本发明所述免疫增强剂优选还包括特定比例的黄芪多糖和当归多糖。二者属于多糖类化合物，是良好的免疫调节剂，在提高和改善动物免疫功能方面具有明显作用。黄芪多糖和当归多糖两种免疫增强剂联合使用，在效果上起协同作用，二者的添加能显著提升免疫增强剂作用，使兽用疫苗产生高水平的体液、细胞及黏膜免疫反应，且抗体产生期短，抗体效价高，持续期长。
68.本发明所述脂质体具有极强的运载药物的能力，能显著增加黄芪多糖、当归多糖及cpg核苷酸的免疫反应，使免疫应答更快、更强，又能准确识别并启动非特异性防御机制，提升自身的抵抗力，增强抗病能力。
69.另外，本发明提供的免疫增强剂具有良好的水溶性，对疫苗的理化特性无影响；其进一步制备的兽用疫苗安全高效无毒，可实现抗原缓释，显著提升免疫效果，延长疫苗的免疫期，极大提高疫苗品质。
具体实施方式
70.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
71.实施例1
72.本实施例提供了一种免疫增强剂，其配方包括：
73.15g磷脂，20g胆固醇，10g生育酚，20g黄芪多糖、30g当归多糖和5g cpg核苷酸(agcgctttatagtcgacgtcaacgtt)。
74.本实施例同时提供了上述免疫增强剂的液体剂型——免疫增强剂分散液。该免疫增强剂分散液的制备方法包括以下步骤：
75.t1：将15g磷脂和20g胆固醇溶解在100ml三氯甲烷中混合，完全溶解得到溶液a；
76.t2：将10g生育酚溶解在100ml 95％的无水乙醇中，完全溶解得到溶液b；
77.t3：将20g黄芪多糖、30g当归多糖和5g cpg溶解在800ml纯化水中，进行震荡混匀，静置后过滤，收集上清液，得到溶液c；
78.t4：将步骤t1中得到的溶液a，步骤t2中得到的溶液b及步骤t3中得到的溶液c，均匀震荡混合，得到混合溶液d；
79.t5：将步骤t4中得到的混合溶液d转移至旋转蒸发仪中，进行旋转蒸发除去有机溶剂，旋转蒸发仪烧瓶内壁形成固形物；旋转蒸发温度为40-50℃，转速为100-200r/min；
80.t6：用1l pbs溶液溶解步骤t5得到的固形物，得到第一混合溶液；pbs溶液的制备：将8g nacl，0.2g kcl，2.68g na2hpo4·
7h2o，0.24g kh2po4溶解在800ml注射用水中；用hcl溶液调节ph值至7.4；补充注射用水至1l，过0.22μm滤膜过滤除菌或121℃，30分钟高压灭菌备用。配制pbs缓冲液的无机盐均购自国药集团化学试剂有限公司。
81.t7：对步骤t6得到的第一混合溶液进行超声处理，得到第二混合溶液；超声处理的条件包括：温度为20-30℃，功率为50-70w，总超声处理的时间为20-30min，超声方式为：超声10s，暂停10s。
82.t8：对步骤t7得到的第二混合溶液用0.22μm滤膜过滤处理，得到第三混合液，即为免疫增强剂分散液。
83.本实施例应用上述免疫增强剂分散液，提供了一种包含免疫增强剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗(zj08株)。该猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备步骤包括：
84.(1)制苗用病毒液(效价为10
6.0
tcid
50
/ml，由金宇保灵生物药品有限公司制备保存)的制备：
85.t1：取工作种细胞vero 1-2支，复苏贴壁培养1-2代，细胞生长至单层后转摇瓶中
悬浮培养，细胞浓度达2
×
106个/ml以上，进行悬浮细胞逐级扩大培养，定时进行细胞观察。
86.t2：当悬浮细胞数达到2
×
106个/ml时，将猪流行性腹泻病毒(zj08株)二级种子按moi值接毒(pfu：细胞数＝1:10-1:100)分别接种悬浮培养vero细胞，设定培养参数(ph值7.0、do值45％、搅拌转数100rpm)在36-37℃下悬浮培养，溶氧降为零后取样，显微镜下观察，细胞活率小于5％，收获培养物。
87.t3：测定步骤t2收获的猪流行性腹泻病毒(zj08株)对vero细胞的tcid
50
。病毒液病毒含量应≥10
6.0
tcid50/ml。
88.t4：将灭活剂bei环化后按比例加入到步骤t3收获的猪流行性腹泻病毒液中(bei的终浓度为0.003mol/l)，充分搅匀后升温至26℃，开始计时，灭活24小时，期间每隔200分钟搅拌一次。计时结束后将过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其硫代硫酸钠的终浓度为2％，充分混匀后，同时取样进行灭活检验。
89.t5：将步骤t4中收获的灭活病毒液，进行灭活检验，合格后，作为制苗用病毒液，保存备用。
90.(2)猪流行性腹泻病毒灭活疫苗(zj08株)的配制：
91.t1：将免疫增强剂分散液与猪流行性腹泻病毒抗原(上述获得的制苗用病毒液)按照1:99的质量比混合，在25-30℃，200rpm/min下搅拌5分钟，制备成抗原混合液。
92.t2：将seppic isa206疫苗佐剂(购自seppic公司，批号，221111025409)与上述抗原混合液按照1:1的质量比混合，在25-30℃，500rpm/min下乳化15分钟，制备成猪流行性腹泻病毒灭活疫苗。
93.实施例2
94.本实施例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗(zj08株)。
95.本实施例与实施例1的不同之处仅在于免疫增强剂的配方不同：
96.18g磷脂、18g胆固醇、8g生育酚、20g黄芪多糖、30g当归多糖和6g cpg核苷酸。
97.实施例3
98.本实施例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗(zj08株)。
99.本实施例与实施例1的不同之处仅在于免疫增强剂的配方不同：
100.26g磷脂、20g胆固醇、10g生育酚、15g黄芪多糖、25g当归多糖和4g cpg核苷酸。
101.实施例4
102.本实施例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗。
103.本实施例与实施例1的不同之处仅在于免疫增强剂的配方不同：
104.15g磷脂，20g胆固醇，10g生育酚和5g cpg核苷酸。
105.实施例5
106.本实施例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗。
107.本实施例与实施例1的不同之处仅在于免疫增强剂的配方不同：
108.15g磷脂，20g胆固醇，10g生育酚，50g当归多糖和5g cpg核苷酸。
109.实施例6
110.本实施例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪传染性胃肠炎灭活疫苗(hb08株)，本实施例与实施例1的不同之处仅在于疫苗种类不同：
111.本实施例提供了一种包含免疫增强剂的猪传染性胃肠炎灭活疫苗(hb08株)。该猪传染性胃肠炎灭活疫苗的制备步骤包括：
112.(1)制苗用病毒液(效价为10
6.5
tcid50/ml，由金宇保灵生物药品有限公司制备保存)的制备：
113.t1：取工作种细胞st 1-2支，复苏贴壁培养1-2代，细胞生长至单层后转摇瓶中悬浮培养，细胞浓度达3
×
106个/ml以上，进行悬浮细胞逐级扩大培养，定时进行细胞观察。
114.t2：当悬浮细胞数达到3
×
106个/ml时，将猪传染性胃肠炎病毒(hb08株)二级种子按moi值接毒(pfu：细胞数＝1:10-1:100)分别接种悬浮培养st细胞，设定培养参数(ph值7.0、do值45％、搅拌转数100rpm)在36-37℃下悬浮培养，溶氧降为零后取样，显微镜下观察，细胞活率小于5％，收获培养物。
115.t3：测定步骤t2收获的猪传染性胃肠炎病毒(hb08株)对st细胞的tcid
50
。病毒液病毒含量应≥10
6.5
tcid
50
/ml。
116.t4：将灭活剂bei环化后按比例加入到步骤t3收获的猪流行性腹泻病毒液中(bei的终浓度为0.003mol/l)，充分搅匀后升温至26℃，开始计时，灭活24小时，期间每隔200分钟搅拌一次。计时结束后将过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其硫代硫酸钠的终浓度为2％，充分混匀后，同时取样进行灭活检验。
117.t5：将步骤t4中收获的灭活病毒液，进行灭活检验，合格后，作为制苗用病毒液，保存备用。
118.猪传染性胃肠炎病毒(hb08株)的配制：
119.t1：将免疫增强剂分散液与猪传染性胃肠炎抗原(hb08株)(上述获得的制苗用病毒液)按照1:99的质量比混合，在25-30℃，200rpm/min下搅拌5分钟，制备成抗原混合液。
120.t2：将seppic isa206疫苗佐剂(购自seppic公司，批号，221111025409)与上述抗原混合液按照1:1的质量比混合，在25-30℃，500rpm/min下乳化15分钟，制备成猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗(hb08株)。
121.对比例1
122.本对比例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗(zj08株)。
123.本对比例与实施例1的不同之处仅在于免疫增强剂的配方不同。
124.对比例1所用免疫增强剂为5g cpg核苷酸，不含脂质体成分。其分散液使用1l pbs溶液溶解5g cpg核苷酸得到，后续超声及过滤步骤、参数同实施例1。
125.对比例2
126.本对比例提供了一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗(zj08株)。
127.本对比例与实施例1的不同之处在于：猪流行性腹泻病毒灭活疫苗中未添加增强剂：
128.将seppic isa206疫苗佐剂(购自seppic公司，批号，221111025409)与猪流行性腹泻抗原按照1:1的质量比混合，在25-30℃，500rpm/min下乳化15分钟，制备成猪流行性腹泻
灭活疫苗(zj08株)。
129.对比例3
130.本对比例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪传染性胃肠炎灭活疫苗(hb08株)。
131.本对比例与实施例6的不同之处仅在于免疫增强剂的配方不同。
132.对比例3所用免疫增强剂为5g cpg核苷酸，不含脂质体成分。其分散液使用1l pbs溶液溶解5g cpg核苷酸得到，后续超声及过滤步骤、参数同实施例1。
133.对比例4
134.本对比例提供了一种猪传染性胃肠炎灭活疫苗(hb08株)。
135.本对比例与实施例6的不同之处在于：猪传染性胃肠炎灭活疫苗中未添加增强剂：
136.将seppic isa206疫苗佐剂(购自seppic公司，批号，221111025409)与猪传染性胃肠炎抗原按照1:1的质量比混合，在25-30℃，500rpm/min下乳化15分钟，制备成猪传染性胃肠炎灭活疫苗(hb08株)。
137.对比例5
138.本对比例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗(zj08株)。
139.本对比例与实施例1的不同之处仅在于增强剂的制备中所用cpg的序列不同“tcgacgttcgtcgttcgtcgttc”(seq idno:2)，其制备参数和方法步骤同实施例1。
140.对比例6
141.本对比例提供了一种免疫增强剂及其分散液，还提供了一种包含免疫增强剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗(zj08株)。
142.本对比例与实施例1和对比例5的的不同之处仅在于增强剂的制备中所用cpg的序列不同“tcggcgacgttcgccgacgttcgta”(seq id no:3)，其制备参数和方法步骤同实施例1。
143.实验例1
144.挑选28日龄阴性仔猪35头(猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、非洲猪瘟抗体抗原均为阴性)，随机分为7组，每组5头。对各组仔猪注射(单点臀部肌肉注射)上述实施例1-5和对比例1-2制得的猪流行性腹泻灭活疫苗(zj08株)，另挑选28日龄抗体阴性的仔猪5头作为空白对照组。免疫后第2周以同样接种剂量和方法加强免疫一次，空白组不注射疫苗。在一免14d、二免14d、28d、60d、90d采集仔猪全血，分离血清，用细胞中和实验方法检测血清中和抗体。每组疫苗接种的5头仔猪应至少有4头仔猪中和抗体≥1：25。并分别于注射前三天、注射后第1天、注射后第2天、注射后第3天，到注射后第14天的上午和下午监测各试验组和空白对照组仔猪的体温，同时观察各组仔猪的采食活动及注射后部位有无肿胀、结节、溃烂等情况并记录。各试验组仔猪的抗体效价测定结果如下表1所示，各组仔猪的体温监测结果如下表2所示。
145.表1：各组仔猪流行性腹泻抗体效价测定结果
146.147.[0148][0149]
表2：各组仔猪的体温监测结果(以各组仔猪监测体温的平均值计，单位℃)
[0150][0151]
由上表1结果可知，免疫前后空白对照组中和抗体均为阴性，各疫苗免疫组抗体水平呈上升后下降的趋势，本次试验成立。实施例1-3为本发明制备的含增强剂的猪流行性腹泻灭活疫苗，实施例4与实施例1-3的区别是增强剂配方中无黄芪多糖和当归多糖，实施例5与实施例1-3的区别是在增强剂配方中将黄芪多糖更换为当归多糖，对比例1与实施例1的区别是在增强剂的配方中无脂质体、黄芪多糖和当归多糖，仅有cpg，对比例2与实施例1的区别是无增强剂。各免疫组一免14天及二免14天至28天中和抗体均表现出逐渐升高的趋势，二免60天至90天，抗体开始下降。对组间抗体值进行比较后按照从大到小的顺序排列：
实施例1≈实施例2≈实施例3＞实施例5＞实施例4＞对比例1＞对比例2。二免28天，实施例1-3的抗体值及上升趋势最高，中和抗体平均值达到峰值1：256(1:28)；实施例5次之，抗体值及抗体趋势略低于实施例1-3，中和抗体平均值约为1:181(1:2
7.5
)；实施例4的中和抗体平均值约为1:128(1:27)；对比例1的中和抗体平均值约为1:105(1:2
6.7
)；对比例2的中和抗体平均值约为1:74(1:2
6.2
)。二免60天至90天，各免疫组中抗体均呈下降趋势，但实施例1-3的抗体值仍保持最高。使用本发明免疫增强剂使猪流行性腹泻二免后中和抗体滴度从1:32-1:90提升至1:128-360，对疫苗中和抗体水平有显著的提升作用，从而能长期有效保护机体不受猪流性腹泻病毒的攻击。
[0152]
由上表2所记载的结果可知，免疫实施例1-4和对比例1-2的猪流行性腹泻灭活疫苗免疫后体温均趋于正常，无明显的升高，未出现疫苗引起的局部或全身不良反应，注射部位正常，因此，本发明提供的猪流行性腹泻灭活疫苗具有良好的安全性。
[0153]
实验例2
[0154]
挑选28日龄阴性仔猪15头(猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、非洲猪瘟抗体抗原均为阴性)，随机分为3组，每组5头。对各组仔猪注射(单点臀部肌肉注射)上述实施例6和对比例3-4制得的猪传染性胃肠炎灭活疫苗(hb08株)，另挑选28日龄以上抗原抗体阴性的仔猪5头作为空白对照组。免疫后第2周以同样接种剂量和方法加强免疫一次，空白组不注射疫苗。在一免14d、二免14d、28d、60d、90d采集仔猪全血，分离血清，用细胞中和实验方法检测血清中和抗体。每组疫苗接种的5头仔猪应至少有4头仔猪中和抗体≥1：25。并分别于注射前三天、注射后第1天、注射后第2天、注射后第3天，到注射后第14天的上午和下午监测各试验组和空白对照组仔猪的体温，同时观察各组仔猪的采食活动及注射后部位有无肿胀、结节、溃烂等情况并记录。各试验组仔猪的抗体效价测定结果如下表3所示，各组仔猪的体温监测结果如下表4所示。
[0155]
表3：各组仔猪传染性胃肠炎抗体效价测定结果
[0156][0157]
表4：各组仔猪的体温监测结果(以各组仔猪监测体温的平均值计，单位℃)
[0158]
[0159][0160]
由上表3结果可知，应用本发明免疫增强剂制备同样以黏膜免疫为主导的灭活疫苗即猪传染性胃肠炎病毒灭活疫苗(hb08株)，表现出相似的结果，实施例6为本发明制备的含增强剂的猪传染性胃肠炎灭活疫苗，对比例3与实施例6的区别是是在增强剂的配方中无脂质体、黄芪多糖和当归多糖，仅有cpg，对比例4与实施例6的区别是无增强剂。实施例6与对比例3-4相比，抗体值上升快且抗体值高，使用本发明免疫增强剂使猪传染性胃肠炎中和抗体滴度从1:32-1:90提升至1:128-256，对疫苗中和抗体水平有显著的提升作用，且延长疫苗中和抗体持续期，在仔猪对各类疫病易感期间(仔猪30日龄至90日龄)，能起到有效且全面的保护作用。
[0161]
由上表4所记载的结果可知，实施例6和对比例3-4的猪胃肠炎灭活疫苗免疫后体温均趋于正常，无明显的升高，未出现疫苗引起的局部或全身不良反应，注射部位正常，因此，本发明提供的猪胃肠炎灭活疫苗具有良好的安全性。
[0162]
实验例3
[0163]
挑选28日龄阴性仔猪15头(猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、非洲猪瘟抗体抗原均为阴性)，随机分为3组，每组5头。对各组仔猪注射(单点臀部肌肉注射)上述实施例1和对比例5-6制得的猪流行性腹泻灭活疫苗(zj08株)，另挑选28日龄抗体阴性的仔猪5头作为空白对照组。免疫后第2周以同样接种剂量和方法加强免疫一次，空白组不注射疫苗。在一免14d、二免14d、28d、60d、90d采集仔猪全血，分离血清，用细胞中和实验方法检
测血清中和抗体。每组疫苗接种的5头仔猪应至少有4头仔猪中和抗体≥1：25。各试验组仔猪的抗体效价测定结果如下表5所示。
[0164]
表5：各组仔猪流行性腹泻抗体效价测定结果
[0165][0166][0167]
由上表5结果可知，实施例1免疫增强剂的发明中更换cpg的合成序列，如对比例5和对比例6，仅cpg序列不同，合成的增强剂对猪流行性腹泻灭活疫苗的中和抗体值、持续期及个体差异影响较大。一免14天实施例1抗体值及整齐度高于对比例5和对比例6，二免后仍体现同样的抗体规律，三组相比而言实施例1个体差异小，二免90天中和抗体值≥1:128(1:27)，对比例5和对比例6抗体平均值低于1:128。疫苗免疫后不仅要求抗体值上升快且持续期长，同时要满足群体的个体差异小，以达到群体免疫保护性及长期消除疫病的目的。由此可见，本发明对cpg序列的优选使增强剂配方最优化，免疫效果显著提升，增强抗原的免疫效果，有效预防疫病。
[0168]
实验例4
[0169]
挑选3～5日龄新生仔猪30头，随机分为6组，每组5头，第1组仔猪肌肉注射实施例1的疫苗2ml，第2组仔猪肌肉注射对比例2的疫苗2ml，第3组仔猪肌肉注射实施例6的疫苗
2ml，第4组仔猪肌肉注射对比例4的疫苗2ml，第5组和第6组仔猪为空白对照组，不接种疫苗，14日后，第1、2、5组仔猪分别口服1000
×
mid猪流行性腹泻病毒组强毒v-zj08z株(病毒含量10
7.0
mid)，每头1.0ml，第3、4、6组仔猪分别口服1000
×
mid猪传染性胃肠炎病毒组织强毒v-hb08株(病毒含量10
7.0
mid)，每头1.0ml，连续观察7日，对照仔猪应至少4头发病，免疫仔猪应至少4头保护。(发病判定标准：仔猪出现水样腹泻，部分仔猪伴有呕吐、脱水的症状)各试验组仔猪攻毒结果如下表6所示。
[0170]
表6：各试验组免疫后攻毒保护结果
[0171][0172]
由上表6所记载的结果可知，两组空白对照组中在免疫14日分别口服猪流行性腹泻强毒v-zj08z株和猪传染性胃肠炎组织强毒v-hb08株，均导致4/5以上的发病率，该试验成立。实施例1的猪流行性腹泻灭活疫苗(zj08株)达到4/5的保护率，对比例2的猪流行性腹泻灭活疫苗(zj08株)仅为2/5的保护率，实施例6的猪传染性胃肠炎灭活疫苗(hb08株)达到5/5的保护率，对比例4的猪传染性胃肠炎灭活疫苗(hb08株)仅为2/5的保护率，实施例1和实施例6添加免疫增强剂后使两种疫苗的保护率均提升50％以上，且一次免疫即可实现80％以上的保护，对仔猪新生仔猪早期起到全面的保护作用，显著提升疫苗的品质。
[0173]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.免疫增强剂，其特征在于，包括如下质量份的组分：25-60份脂质体和4-6份cpg核苷酸；优选的，所述脂质体包括磷脂、胆固醇和生育酚；所述磷脂和所述胆固醇的质量比例为(10-30):(10-20)；所述磷脂和所述生育酚的质量比例为(10-30):(5-10)。2.根据权利要求1所述免疫增强剂，其特征在于，还包括30-70份的植物多糖；所述植物多糖包括黄芪多糖和当归多糖。3.根据权利要求2所述免疫增强剂，其特征在于，所述黄芪多糖和所述当归多糖的质量比例为(10-30):(20-40)。4.根据权利要求1-3任意一项所述免疫增强剂，其特征在于，所述cpg核苷酸的序列如seq id no:1所示。5.权利要求1-4任意一项所述免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、将所述免疫增强剂的原料溶解，混合，得到混合溶液；s2、去除所述混合溶液的溶剂，得到固形物。6.根据权利要求5所述免疫增强剂的制备方法，其特征在于，步骤s1包括：将所述磷脂和所述胆固醇溶解于三氯甲烷，得到溶液a；将所述生育酚溶解于乙醇，得到溶液b；将所述黄芪多糖、所述当归多糖和所述cpg核苷酸溶解于水，得到溶液c；将所述溶液a、溶液b和溶液c混合，得到混合溶液。7.免疫增强剂分散液，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述免疫增强剂或者权利要求5-6任意一项所述制备方法制备得到的免疫增强剂，还包括注射用分散液；所述免疫增强剂在所述免疫增强剂分散液中的浓度为80-120g/l。8.权利要求1-4任意一项所述免疫增强剂，或者权利要求5-6任意一项所述制备方法制备得到的免疫增强剂，或者权利要求7所述免疫增强剂分散液在制备疫苗中的应用。9.疫苗，其特征在于，所述疫苗包括灭活抗原，还包括权利要求1-4任意一项所述免疫增强剂，或者权利要求5-6任意一项所述制备方法制备得到的免疫增强剂，或者权利要求7所述免疫增强剂分散液。10.根据权利要求9所述疫苗，其特征在于，所述灭活抗原包括猪流行性腹泻抗原、猪传染性胃肠炎抗原、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原、猪冠状病毒抗原、猪伪狂犬灭活抗原、猪口蹄疫o型灭活抗原、猪口蹄疫a型灭活抗原、牛轮状灭活抗原和牛副流感灭活抗原中的一种或者多种。

技术总结
本发明涉及兽用疫苗技术领域，尤其涉及一种免疫增强剂、制备方法及其应用。本发明所述免疫增强剂包括特定比例的脂质体和CpG核苷酸，二者复配能显著提升疫苗的免疫效果，激发黏膜抗原的特异性免疫应答。进一步的，本发明所述免疫增强剂优选还包括特定比例的黄芪多糖和当归多糖。黄芪多糖和当归多糖的添加能显著提升免疫增强剂作用，使兽用疫苗产生高水平的体液、细胞及黏膜免疫反应，且抗体产生期短，抗体效价高，持续期长。持续期长。


技术研发人员：赵丽霞 李晓艳 陈坚 关平原 乔煜婷 李超 齐志涛 张建宏 王华
受保护的技术使用者：金宇保灵生物药品有限公司
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/8/5