引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型及其构建方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的构建方法。


背景技术：

2.rna结合蛋白在基因转录后调控过程发挥着重要的作用。神经元elav蛋白可作为神经元的分子标记物，靶向结合rna并介导rna的出核、可变剪切、转录和翻译等过程来调节神经元的发育。nelavls与脆性x综合征、神经母细胞瘤、脊髓侧索硬化症及阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等多种神经退行性疾病的发生发展密切相关。有研究报道nelavls仅表达于早期分化的斑马鱼视网膜神经元如神经节细胞和无长突细胞中。
3.elavl2是nelavls家族中重要的成员，虽然目前的研究中并未直接动物模型证明elavl2在神经系统中的作用机制，但有研究发现，在神经系统发育过程中elavl2 mrna最早表达于小鼠胚胎期16天的脑室区神经元祖细胞中，且elavl2与中间神经元祖细胞标记物tbr2有共定位，表明elavl2在神经元祖细胞中发挥作用。除此之外，elavl2还可拮抗microrna-9对转录因子foxg1的抑制作用，调节前脑细胞的增殖和分化。对精神分裂症家系样本进行的全基因组关联分析表明elavl2是精神分裂症的易感基因，在红藻酸诱导的小鼠癫痫模型中发现，ca3椎体神经元中elavl2蛋白和靶向gap-43mrna的水平急剧下降，提示elavl2的表达受神经元活性的调节。以上研究表明elavl2与精神分裂症与大脑功能异常相关。
4.elavl4是nelavls家族中第一个被成功克隆的成员，它参与神经元的增殖、分化和神经突的生长等过程。之前的研究证明，elavl4促进gap-43、c-fos、p21waf1、n-myc和tau基因的mrna稳定性和蛋白的表达，正向调节神经元突起的形成和再生。elavl4基因的缺失会导致运动神经元的轴突分支和海马区ca3锥体神经元的树突减少；在背根神经节损伤模型中抑制elavl4的表达，会导致轴突的再生能力下降。此外，elavl4选择性表达于新皮层和海马的兴奋性谷氨酸能神经元，而不表达与抑制性γ-氨基丁酸能的中间神经元中，因而elavl4可能参与神经元兴奋性的形成。
5.因此，有必要开发一种elavl2、elavl4特异性敲除模型小鼠，用于探索神经元rna结合蛋白elavl2和elavl4在视网膜发育过程中发挥的作用。


技术实现要素：

6.本发明目的是提供一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型及其构建方法，成功获得引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除的模式小鼠。
7.在本发明的第一方面，提供了用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的模式小鼠的打靶载体，所述打靶载体包括：
8.elavl4打靶载体，核苷酸序列如seq id no.1所示；
9.elavl2打靶载体，核苷酸序列如seq id no.2所示。
10.在本发明的第二方面，提供了一种用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的特异性靶位点导向rna，包括：
11.sgrna1，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.3所示；
12.sgrna3，所述sgrna3的核苷酸序列如seq id no.4所示。
13.在本发明的第三方面，提供了一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的构建方法，所述方法包括：
14.将如seq id no.3所示和cas9质粒分别体外转录成有活性的sgrna1和cas9 mrna；
15.将所述有活性的sgrna1、cas9 mrna和如seq id no.1所示的elavl4打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得f0代小鼠；
16.将如seq id no.4所示的sgrna3体外转录成有活性的sgrna3；
17.将所述有活性的sgrna3、cas9 mrna和如seq id no.2所示的elavl2打靶载体混合后显微注射到所述f0代小鼠中，获得elavl2
fl/fl
elavl4
fl/fl
小鼠，使其与视网膜特异性敲除工具鼠six3-cre进行交配，从而获得具有稳定基因型的f1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得引起视网膜无长突细胞特异性减少的模式小鼠。
18.在本发明的第四方面，提供了一种用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的小鼠模型的成套核酸分子，所述成套核酸分子包括：
19.(a)所述的用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的特异性靶位点导向rna；
20.(b)所述的打靶载体。
21.在本发明的第五方面，提供了采用所述的方法获得的用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的小鼠模型。
22.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
23.我们采用了基于crispr/cas9开发的ege(extreme genome editing system)系统制备小鼠模型，可将基因敲进效率提高近20倍、且快速、便捷，提高了成功率，节约了成本，缩短了周期，更有利于工业化及大规模的商业应用。最终得到elavl2
fl/fl
elavl4
fl/fl
；six3特异性敲除模型小鼠，用于探索神经元rna结合蛋白elavl2和elavl4在视网膜发育过程中发挥的作用。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
25.图1为elavl4的打靶载体图谱；
26.图2为elavl2的打靶载体图谱；
27.图3为sgrna体外转录的rna电泳图；
28.图4为转基因小鼠模型构建之后，分别在dna水平上进行视网膜特异性elavl2和elavl4敲除验证(a、b)；以及rna水平验证视网膜内基因敲除效率(c、d)，证明敲除模型构建
成功。
29.图5为基因敲除成年小鼠视网膜细胞数量变化观察，结果为视网膜无长突细胞特异性减少(a、b)，相应ap2α的mrna表达水平也下降(c)；
30.图6为elavl2及elavl4视网膜特异性敲除后成年小鼠的暗适应视功能分析发现b波振幅下降约30％(a)，暗适应a波波幅未出现明显下降(b)。在1、3、8个月的实验显示3.0ops振幅下降约40％(c)。
31.图7为elavl2及elavl4视网膜特异性敲除后成年小鼠的暗适应视视力分析发现小鼠暗适应视力下降。
32.图8为pcs(puro)载体图谱；
33.图9为对构建好的cas9/sgrna质粒进行活性检测的结果；
34.图10为构建好的cas9/sgrna质粒进行活性检测的结果。
具体实施方式
35.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
36.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
37.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
38.下面将结合实施例及实验数据对本技术的一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型及其构建方法进行详细说明。
39.实施例1、引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的构建
40.(一)elavl4
41.1、cas9/sgrna质粒的设计及构建；
42.1.1、cas9/sgrna质粒的设计；
43.基于sgrna的设计原则，elavl4具有6个外显子，设计elavl4的sgrna序列，在靶位点区域共设计sgrna，对应的oligo序列如表1所示：
44.表1
[0045][0046][0047]
1.2、cas9/sgrna质粒的构建；
[0048]
按照上述已设计的sgrna序列合成相应引物，退火聚合后通过gibson assembly的方式分别连入如图8所示的pcs(puro)载体，连接产物分别转化后送样测序验证正确，从而构建出cas9/sgrna质粒。
[0049]
2、cas9/sgrna的活性检测
[0050]
采用一种自主研发的crispr/cas9活性检测方法-ucatm方式进行。其具有无物种限制，高通量，适应性广，灵敏度高，简便性等优点。对构建好的cas9/sgrna质粒进行活性检测后，得出如图9所示的检测结果。
[0051]
从下表中可以看出，第1个的cas9/sgrna质粒的的活性和特异性明显优于其他cas9/sgrna质粒的活性和特异性，因此综合选择这1个cas9/sgrna质粒所对应的sgrna1进行下一个步骤；
[0052]
表2
[0053][0054]
3、sgrna的显微注射rna的制备
[0055]
先将sgrna的序列连入带t7启动子的pt7-4g质粒载体上，然后将质粒测序验证正确后，使用通用扩增引物进行扩增t7启动子及sgrna核苷酸序列，最后以该pcr产物为模板进行体外转录，得到sgrna的显微注射rna；
[0056]
并且其制备时反应条件为65℃下反应5min，rna电泳图如图3所示，表示sgrna12在所需浓度下成功转录。
[0057]
4、打靶载体的构建；
[0058]
确认靶序列(序列见表1)。
[0059]
选取目的dna片段，将seq id no.7所示的dna片段结构连入tv-4g载体(可市售获得，比如可购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司)中，得到elavl4打靶载体(elavl4打靶载体的核苷酸序列如seq id no.1所示)。然后将得到的打靶载体再通过酶切鉴定和测序，从而确认打靶载体构建完成；打靶载体酶切鉴定和测序的结表明打靶载体构建成功。
[0060]
5、f0代小鼠的制备；
[0061]
cas 9mrna：cas9表达质粒(addgene no.44758)，经ageⅰ酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板用于体外转录；依照t7 ultra kit(ambion，
am1345)试剂盒，体外利用t7 rna聚合酶合成cas 9mrna。
[0062]
sgrna12：sgrna的表达载体经draⅰ酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板用于体外转录，并依照megashortscript kit(ambion，am1354)试剂盒体外经t7 rna聚合酶合成sgrna。
[0063]
将所述打靶载体和cas 9mrna、sgrna12通过显微注射受精卵及移植到c57/bl6j，通过特异打靶elavl4的2号外显子得到f0代小鼠。具体包括：将转录好的cas9 mrna，sgrna和纯化后的donor片段混合并调整浓度为20ng/μl的cas9 mrna，10ng/μl的sgrna和50ng/μl的donor片段，使用te2000u显微注射仪将混合物显微注射到c57bl/6小鼠受精卵的原-核和细胞质中，再将受精卵移植到假孕的c57bl/6-母鼠子宫中，等待f0代小鼠出生。
[0064]
(1)es细胞筛选及鉴定将打靶载体elavl4-final vector采用电冲击法转到es细胞中进行打靶，使其发生同源重组，通过pcr及southern blot筛选出中靶克隆；其中，用于5’端筛选。
[0065]
(2)制备嵌合小鼠：注射用囊胚采用c57bl/6n近交系小鼠，通过超数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射；注射后移植入假孕小鼠受体子宫，假孕受体为c57bl/6n与cba的杂交一代，生育出嵌合率大于50％的嵌合雄鼠。
[0066]
7、f0代小鼠出生及鉴定及可遗传检测
[0067]
(1)f0小鼠的鉴定：在f0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠，并将剪取鼠尾组织经酚氯仿法提取dna，依据上述实验中在靶区域设计的引物进行鉴定，选取pcr阳性的样品进行测序。
[0068]
(2)f0代小鼠的可遗传性检测：将pcr以及测序正确的f0代小鼠与野生型c57bl/6小鼠进行交配，产生f1代小鼠，依据f0代小鼠的鉴定方法对f1代小鼠进行鉴定，获得的阳性f1代杂合子小鼠即可稳定遗传。
[0069]
8、繁育f1代杂合子小鼠；
[0070]
将获得的嵌合率高的嵌合雄鼠与野生型c57bl/6n背景雌鼠回交，
[0071]
得到f1代杂合子；经提取尾基因组dna进行pcr反应鉴定基因型，根据电泳结果判断野生型、杂合子或纯合子。
[0072]
9、将获得的嵌合率高的嵌合雄鼠与野生型c57bl/6n背景雌鼠回交，得到f1代杂合子；经提取尾基因组dna进行pcr反应鉴定基因型，根据电泳结果判断野生型、杂合子或纯合子。
[0073]
所述步骤(5)是将获得的f1代杂合子小鼠与先后与flper小鼠及野生型c57bl/6n小鼠交配，获得完全删去neo抗性基因的小鼠，再将完全删去neo抗性基因的小鼠与全身性敲除cre品系交配获得全身性敲除elavl4的纯合子小鼠，即为elavl4基因基于cre-loxp条件性基因敲除小鼠模型。
[0074]
(二)elavl2
[0075]
1、elavl2具有8个外显子，设计针对elavl2的sgrna序列，构建sgrna，具体序列如下：
[0076]
表2
[0077][0078]
2、体外测试
[0079]
采用一种自主研发的crispr/cas9活性检测方法-ucatm方式进行。其具有无物种限制，高通量，适应性广，灵敏度高，简便性等优点。对构建好的cas9/sgrna质粒进行活性检测后，得出如图10所示的检测结果。
[0080]
从图中可以看出，第1个的cas9/sgrna质粒的的活性和特异性明显优于其他cas9/sgrna质粒的活性和特异性，因此综合选择这个cas9/sgrna质粒所对应的sgrna3进行下一个步骤
[0081]
3、构建同源重组载体(donor vector)
[0082]
确认靶序列(序列见表2)。
[0083]
选取目的dna片段，将seq id no.8所示的dna片段结构连入tv-4g载体(可市售获得，比如可购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司)中，得到elavl2打靶载体(elavl2打靶载体的核苷酸序列如seq id no.2所示)。然后将得到的打靶载体再通过酶切鉴定和测序(测序引物见下表4)，从而确认打靶载体构建完成；打靶载体酶切鉴定和测序的结表明打靶载体构建成功。
[0084]
初筛方法为：利用琼脂糖凝胶电泳对引物可扩增性进行筛选，反应体系：2
×
mix 12.5ul；上下引物各1ul；ddh2o 9.5ul；dna 1ul；扩增条件：95℃6min；65℃30s；72℃5min；10℃维持。所用引物如表3所示。
[0085]
表3
[0086][0087][0088]
表4-测序引物
[0089][0090]
4、将cas9、grna、donor vector同时注射如elavl4-cko背景小鼠受精卵中，cas9蛋白在grna引导下结合至elavl2基因的5号外显子靶位点造成dna双链断裂，donor vector通过同源重组修复断裂的双链，从而实现对靶基因的flox修饰。此步完成得到elavl2
fl/fl
elavl4
fl/fl
小鼠。
[0091]
实施例2、结果验证
[0092]
(一)转基因构建成功的证据
[0093]
1.转基因小鼠品系建立并繁殖后采用视网膜组织裂解及基因组dna提取，用合成引物进行pcr及电泳跑胶，得到纯和敲除(elavl2条带为395bp，elavl4条带为438bp)，杂合敲除(elavl2中条带为1276bp和395bp；elavl4中条带为1655bp和438bp)及纯和不带cre(elavl2中条带为1459bp；elavl4中条带为1838bp)三种基因型。(图4a、b)
[0094]
2.提取不同基因组小鼠视网膜rna，反转录为cdna进行qrt-pcr，得到在e16.5，基因敲除组的elavl2 mrna水平是对照组的34.5％左右，其elavl4的mrna水平是对照组的20.1％左右；在p6时，基因敲除组elavl2的mrna水平是对照组的51.4％左右，敲除组elavl4的mrna水平是对照组的25.3％左右。验证基因敲除模型构建之后elavl2和elavl4基因的表达效率有所下降，模型构建成功。(图4c、d)
[0095]
(二)基因敲除后产生的症状
[0096]
1.细胞数量变化：构建基因敲除鼠后发现成年小鼠视网膜细胞组成中无长突细胞数量特异性减少，其余细胞则无明显变化。进一步研究发现为γ-氨基丁酸能和甘氨酸能亚类无长突细胞数量减少(图5a、b)，qrt-pcr结果验证了上述细胞数量减少发现(图5c)。
[0097]
2.暗适应erg变化：对成年后基因敲除组与对照组小鼠进行视功能erg测定，结果发现elavl2
δfl/δfl
elavl4
δfl/δfl
组小鼠暗适应erg b波振幅相较于elavl2
fl/fl
elavl4
fl/fl
组erg b波振幅下降了约30％(图6a)。同时暗适应条件下elavl2
δfl/δfl
elavl4
δfl/δfl
组小鼠反应视网膜内层细胞尤其是无长突细胞功能3.0ops相比于对照组下降了约40％(图6c)。
[0098]
3.视功能变化：对成年小鼠不同年龄段(p30和p90)进行暗适应视动分析，结果发现elavl2
fl/fl
elavl4
fl/fl
；six3-cre组小鼠暗适应视力相较于elavl2
fl/fl
elavl4
fl/fl
组视力下降了约40％。(图7)
[0099]
综上结果显示，elavl2
fl/fl
elavl4
fl/fl
；six3-cre小鼠模型构建成功，导致小鼠的视网膜无长突细胞数量特异性减少，及小鼠视功能降低。
[0100]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0101]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0102]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0103]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：
1.用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的模式小鼠的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包括：elavl4打靶载体，核苷酸序列如seq id no.1所示；elavl2打靶载体，核苷酸序列如seq id no.2所示。2.一种用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的特异性靶位点导向rna，其特征在于，包括：sgrna1，所述sgrna1的核苷酸序列如seq id no.3所示；sgrna3，所述sgrna3的核苷酸序列如seq id no.4所示。3.一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将如seq id no.3所示和cas9质粒分别体外转录成有活性的sgrna1和cas9 mrna；将所述有活性的sgrna1、cas9 mrna和如seq id no.1所示的elavl4打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得f0代小鼠；将如seq id no.4所示的sgrna3体外转录成有活性的sgrna3；将所述有活性的sgrna3、cas9 mrna和如seq id no.2所示的elavl2打靶载体混合后显微注射到所述f0代小鼠中，获得elavl2
fl/fl
elavl4
fl/fl
小鼠，使其与视网膜特异性敲除工具鼠six3-cre进行交配，从而获得具有稳定基因型的f1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得引起视网膜无长突细胞特异性减少的模式小鼠。4.一种用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的小鼠模型的成套核酸分子，其特征在于，所述成套核酸分子包括：(a)权利要求2所述的用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型的特异性靶位点导向rna；(b)权利要求1所述的打靶载体。5.一种采用权利要求3所述的方法获得的用于构建引起视网膜无长突细胞特异性减少的小鼠模型。

技术总结
本发明提供了一种引起视网膜无长突细胞特异性减少的基因敲除小鼠模型，构建方法包括：将如SEQ ID NO.3所示的sgRNA1和Cas9mRNA和如SEQ ID NO.1所示的Elavl4打靶载体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；将如SEQ ID NO.4所示的sgRNA3、Cas9mRNA和如SEQ ID NO.2所示的Elavl2打靶载体混合后显微注射到所述F0代小鼠中，获得Elavl2


技术研发人员：沈吟 于垚 胡西塔尔
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：2023.04.11
技术公布日：2023/8/5