一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针及制备方法和应用

1.本发明属于荧光探针
技术领域：
：，具体涉及一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针及制备方法和应用。
背景技术：
：：2.生命系统中酶水平的异常总是与各种疾病有关，特别是癌症，这使得酶成为各种癌症的典型生物标志物1.。亮氨酸氨基肽酶(lap)作为一种能专门催化蛋白质或多肽水解n端亮氨酸的蛋白水解酶2.，广泛存在于微生物、植物、动物和人类中。研究发现lap参与了各种生理和病理过程，尤其是肿瘤细胞增殖、侵袭和血管生成等相关过程[3,4]，这使lap可以作为肿瘤跟踪的癌症相关生物标志物，如乳腺癌、肝癌、卵巢上皮性恶性肿瘤等。此外，lap还在药物诱导的肝损伤(dili)中表达上调，是药物诱导肝损伤的诊断生物标志物[5]。dili是由治疗性药物或其他化学品引起的，是多种药物的常见副作用，对人类健康构成严重威胁。肝损伤与近1000种药物有关，其中对乙酰氨基酚(apap)是主要的诱因[6]。因此，在生命系统中监测lap水平及波动对与其相关的病理生理学阐明和疾病诊断至关重要。但是现有的检测方法，由于大多数探针存在发射波长短、荧光强度弱或选择性差，以及无法满足活体检测等问题，因此，开发一种特异性的lap检测和成像方法具有重要意义。[0003]参考文献：[0004][1]guk,xuy,lih,etal.real-timetrackingandinvivovisualizationofbeta-galactosidaseactivityincolorectaltumorwitharatiometricnear-infraredfluorescentprobe[j].jamchemsoc.2016,138:5334-5340.[0005][2]cheny.fluorescentprobesfordetectionandbioimagingofleucineaminopeptidase[j].matertodaychem.2020,15,100216.[0006][3]meij,kimdh,ayzneral,etal.siloxane-terminatedsolubilizingsidechains:bringingconjugatedpolymerbackbonescloserandboostingholemobilitiesinthin-filmtransistors[j].jamchemsoc.2011,133:20130-20133.[0007][4]tsujimotom,gotoy,maruyamam,etal.biochemicalandenzymaticpropertiesofthem1familyofaminopeptidasesinvolvedintheregulationofbloodpressure[j].heartfailrev.2008,13:285-291.[0008][5]houx,yuq,zengf,etal.ratiometricfluorescenceassayforgamma-glutamyltranspeptidasedetectionbasedonasinglefluorophoreviaanalyte-inducedvariationofsubstitution[j].chemcommun.2014,50:3417-3420.[0009][6]zhangy,chenx,yuanq,etal.enzyme-activatednear-infraredfluorogenicprobewithhigh-efficiencyintrahepatictargetingabilityforvisualizationofdrug-inducedliverinjury[j].chemsci.2021,12:14855-14862.技术实现要素：[0010]本发明的目的在于提供一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针及制备方法和应用，具有稳定性高、选择性好、水溶性好、灵敏度高、检出限低等优势，可通过荧光法和比色法实现对lap的定量检测，且可成功应用于生命系统中lap的成像。[0011]本发明提供了一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针，所述荧光探针具有式i所示的结构；[0012][0013]本发明还提供了上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：[0014](1)将lan-oh与式ii所示化合物进行第一取代反应，得式iii所示化合物；[0015](2)利用式iii所示化合物进行第二取代反应，得式i所示荧光探针；[0016][0017]优选的，步骤(1)所述lan-oh具有如式iv所示的结构；[0018][0019]本发明还提供了上述荧光探针在制备检测亮氨酸氨基肽酶的产品中的应用。[0020]本发明还提供了上述荧光探针在制备疾病诊断产品中的应用，所述疾病的诊断生物标志物包括亮氨酸氨基肽酶。[0021]优选的，所述疾病包括肝损伤类疾病和肿瘤。[0022]优选的，所述疾病诊断产品为可视化诊断产品。[0023]优选的，所述疾病诊断产品基于荧光法或比色法完成可视化诊断。[0024]有益效果：本发明提供了一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针，基于ict机理响应lap，可应用于检测细胞及活体内lap水平。本发明所述荧光探针lan-lap由荧光团lan-oh通过对氨基苯甲醇连接子与l-亮氨酸残基相连构成，具有稳定性高、选择性好、水溶性好、灵敏度高、检出限低等优势，可通过荧光法和比色法实现对lap的定量检测。基于低细胞毒性，该探针被成功应用于生命系统中lap的成像。在本发明实施例中，探针lan-lap能够对肝癌细胞及药物诱导肝损伤细胞内lap水平进行成像，并证实了lap在肝癌细胞和肝损伤细胞中上调；探针lan-lap通过响应lap成功实现对荷瘤小鼠、apap诱导的肝损伤小鼠、rfp诱导的胆汁淤积型肝损伤小鼠体内lap水平的可视化，并证实了其体内lap水平均较正常小鼠上调。因此，本发明所述探针lan-lap是一种很有前途的诊断与lap作为生物标志物的疾病的有效手段，如肝癌及肝损伤相关疾病等的有效诊断。附图说明[0025]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0026]图1为探针lan-lap的完整合成路线图；[0027]图2为溶剂dmso-d6中化合物lan-oh的1h-nmr谱；[0028]图3为溶剂dmso-d6中化合物lan-oh的13c-nmr谱；[0029]图4为化合物lan-oh的lc-hrms谱；[0030]图5为溶剂dmso-d6中化合物lan-lap的1h-nmr谱；[0031]图6为溶剂dmso-d6中化合物lan-lap的13c-nmr谱；[0032]图7为化合物lan-lap的lc-hrms谱；[0033]图8为探针lan-lap的光谱特性结果图；(a)和(b)为探针(10μm)和反应体系(10μm探针与400u/llap)的荧光光谱/吸收光谱；(c)为探针(10μm)和反应体系(10μm探针与400u/llap)在连续580nm激发光照射下的光稳定性；(d)为探针(10μm)和反应体系(10μm探针与400u/llap)在25-42℃温度内的荧光变化情况；(e)为10μm探针与不同浓度lap反应时间变化情况；(f)为ph对探针(10μm)和反应体系(10μm探针与400u/llap)的影响；[0034]图9为探针lan-lap的分析性能结果图；(a)为探针lan-lap与不同浓度lap(0-400u/l)响应的荧光光谱；(b)为反应体系在642nm处的荧光强度与lap浓度(0-50u/l)之间的线性关系；(c)为探针lan-lap与不同浓度lap(0-400u/l)响应的吸收光谱；(d)为反应体系在575nm处的吸光度与lap浓度(0-50u/l)之间的线性关系；[0035]图10为酶动力学研究结果；(a)为36u/llap与不同浓度(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μμ)探针lan-lap酶促反应的michaelis-menten图；(b)为酶促反应的lineweaver-bulk图；[0036]图11为在各种分析物(1mm)存在下探针lan-lap的荧光强度：1.blank；2.mn2+；3.li+；4.cu2+；5.mg2+；6.ag+；7.hg2+；8.ca2+；9.cd2+；10.pb2+；11.ni2+；12.al3+；13.zn2+；14.k+；15.ba2+；16.fe2+；17.co2+；18.na+；19.fe3+；20.aco-；21.cn-；22.clo4-；23.hso4-；24.scn-；25.cn-；26.h2po4-；27.f-；28.cl-；29.br-；30.i-；31.lysine；32.valine；33.tryptophan；34.asparticacid；35.histidine；36.l-arginine；37.l-alanine；38.dl-homocysteine；39.dl-phenylalanine；40.l-cysteine；41.l-leucine；42.dl-methionine；43.glycine；44.l-glutamic；45.d(+)-mannose；46.d-fructose；47.dithiothreitol；48.l-ascorbic；49.chitosan；50.citrulline；51.5000u/lalkalinephosphatase；52.1μmthrombin；53.10mg/lglucoseoxidase；54.10mg/lglucoseoxidase；55.10mg/lcarcinoembryonicantigen；56.10mg/lalbuminbovinev；57.20mg/lhyaluronidase；58.7000u/lmaltase；59.h2o2；60.50u/llap；[0037]图12为反应体系的质谱；[0038]图13为探针lan-lap(10μm)，荧光团lan-oh(10μm)，反应体系(10μm探针与50u/llap)的hplc分析结果图；[0039]图14为抑制剂bestatin对探针lan-lap(10μm)、荧光团lan-oh(10μm)及反应体系(10μm探针与50u/llap)荧光强度的影响结果图；[0040]图15探针lan-lap用于lap的检测机理示意图；[0041]图16为探针lan-lap与lap的分子对接模拟及探针lan-lap与荧光团lan-oh的homo/lumo能级图；[0042]图17为不同浓度探针lan-lap的细胞毒性分析结果图；[0043]图18为探针lan-lap在hepg2细胞内成像的荧光强度随时间的变化图；(a)为hepg2细胞内荧光强度随时间变化趋势；(b)为对应(a)中hepg2细胞内平均荧光强度值；[0044]图19为肝癌细胞与正常肝细胞内源性lap水平；(a)为hepg2细胞和lo2细胞内源性lap荧光成像；(b)为对应(a)中细胞内平均荧光强度值；[0045]图20为肝损伤细胞内lap水平；(a)为对apap诱导肝损伤细胞内lap水平波动的监测；(b)为对应(a)中细胞内平均荧光强度值；[0046]图21为活体小鼠注射lah-lap的荧光成像结果图，(a)为对照组、(b)为瘤内注射-肿瘤组、(c)为尾静脉注射-肿瘤组、(d)为apap诱导的肝损伤组、(e)为rfp诱导的胆汁淤积型肝损伤组；[0047]图22为手术切除肿瘤过程的荧光成像结果图；[0048]图23为探针lan-lap用于腹膜转移小鼠体内lap的荧光成像结果图，(a)为对照组，(b)为腹膜转移组小鼠尾静脉注射探针(200μm，100μl)后的荧光成像情况；(c)为对照组/(d)为腹膜转移组小鼠解剖后内脏的成像情况。具体实施方式[0049]本发明提供了一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针，所述荧光探针具有式i所示的结构；[0050][0051]本发明所述荧光探针lan-lap，在580nm激发波长照射下，lap的加入使探针在642nm处的荧光发射明显增强并伴随着溶液颜色由橙色转变为荧光红(365nm紫外光照射下)；lap的加入使探针lan-lap在575nm处的吸收峰明显增强并伴随溶液颜色由淡黄色向红色的转变。因此本发明所述荧光探针lan-lap可以通过荧光法和比色法有效地检测lap。[0052]本发明还提供了上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：[0053](1)将lan-oh与式ii所示化合物进行第一取代反应，得式iii所示化合物；[0054](2)利用式iii所示化合物进行第二取代反应，得式i所示荧光探针；[0055][0056]本发明步骤(1)所述lan-oh优选具有如式iv所示的结构；[0057][0058]本发明所述荧光探针lan-lap的完整合成路线优选如图1所示，其中化合物1的合成方法优选参照zhangm等进行(zhangm,tianz,wangj,etal.visualanalysisandinhibitorscreeningofleucineaminopeptidase,akeyvirulencefactorforpathogenicbacteria-associatedinfection[j].acssens.2021,6:3604-3610.)；化合物2(式ii)的合成方法优选参照chaiy等进行(chaiy,gaoy,xiongh,etal.anear-infraredfluorescentprobeformonitoringleucineaminopeptidaseinlivingcells[j].analyst.2019,144:463-467.)。[0059]本发明还提供了上述荧光探针在制备检测亮氨酸氨基肽酶的产品中的应用。[0060]本发明所述荧光探针lan-lap对lap具有良好的亲和力和高度的敏感性和高度特异性，且对lap进行检测的机理优选包括：lap特异性识别并切断探针lan-lap的l-亮氨酸残基，随后对氨基苯甲醇连接子自发离去最终释放荧光团lan-oh从而实现对lap的检测。[0061]本发明还提供了上述荧光探针在制备疾病诊断产品中的应用，所述疾病的诊断生物标志物包括亮氨酸氨基肽酶。[0062]本发明利用cck-8法探究所述荧光探针lan-lap对hepg2细胞的毒性，结果显示即使探针lan-lap的浓度高达50μm，细胞存活率仍高达90％以上，表明探针lan-lap的细胞毒性低，可应用于细胞检测和活体检测。在本发明实施例中，在细胞成像中，探针lan-lap能够可视化肝癌细胞内源性lap水平并成功监测apap诱导的肝损伤细胞内lap水平的波动，证实了在肝损伤细胞内lap表达水平上调。在活体成像中，探针lan-lap成功用于荷瘤小鼠、apap诱导的肝损伤小鼠、rfp诱导的胆汁淤积型肝损伤小鼠以及腹膜转移小鼠体内lap水平的成像，并证实了其体内lap水平较正常小鼠明显上调。此外，探针lan-lap可用于荧光指导-手术切除肿瘤过程。因此，本发明所述探针lan-lap是一种很有前途的用于肝癌及肝损伤等肝相关疾病诊断的有力工具。[0063]为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针及制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。[0064]实施例1[0065]根据图1所示路线合成荧光探针lan-lap：[0066](1)化合物1的合成[0067]冰浴条件下，将4-氨基苯甲醇(400mg，3.25mmol)、boc-l-亮氨酸(694mg，3mmol)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.14g，3mmol)溶解在15ml无水四氢呋喃中，在氮气保护下搅拌10min。然后滴加n,n-二异丙基乙胺(523μl，3mmol)继续搅拌20min。最后在室温条件下搅拌过夜。以石油醚和乙酸乙酯的混合物(v/v＝1：1)为流动相，经硅胶柱层析法纯化乳白色固体化合物1(产率75％)。[0068](2)化合物2的合成[0069]冰浴条件下，将化合物1(0.336g，1mmol)溶于10ml无水四氢呋喃中搅拌，10min后滴加三溴化磷(142μl，1.5mmol)并继续搅拌3h。停止反应，向其中滴加饱和碳酸钠溶液使其调整为中性，然后加入二氯甲烷进行萃取，分层后将二氯甲烷层低温旋蒸得乳白色固体化合物2(产率53％)，无需进一步提纯直接用于下一步反应。[0070](3)化合物3的合成[0071]冰浴条件下，依次向烧杯中加入350ml冰水和6.3ml浓硫酸并充分搅拌，然后将间苯二酚(14.5g，0.13mol)与亚硝酸钠(10.8g，0.15mol)的混合液逐滴加入烧杯，滴加完毕后继续搅拌20min后停止反应，然后将产物进行抽滤、冷冻干燥。最终产物为明黄色固体，不需要进一步提纯即可用于下一步合成(17.93g，96％)。[0072](4)化合物lan-oh的合成[0073]室温下，将化合物3(0.153g，1.1mmol)和1-萘酚(0.144g，1mmol)加入到5ml二氯甲烷中进行充分搅拌。随后将3ml浓盐酸逐滴加入反应瓶，搅拌5h后停止反应。以石油醚和乙酸乙酯(v/v＝5:1)作为流动相，通过硅胶柱层析法进行纯化，化合物lan-oh为黄褐色固体(130mg，65％)。1hnmr(300mhz,dmso-d6)δ8.60(d,j＝8.0hz,1h),8.14(d,j＝7.8hz,1h),7.85(t,j＝7.5hz,1h),7.78(d,j＝7.4hz,1h),7.70(d,j＝8.7hz,1h),6.85(d,j＝8.8hz,1h),6.76(s,1h),6.36(s,1h)(图2)。13cnmr(75mhz,dmso-d6)δ182.42,161.50,151.35,145.32,142.41,132.03,131.33,131.20,131.09,131.01,126.14,125.11,123.82,114.02,105.70,105.64,101.77(图3)。ms(lc-hrms,m/z)forc16h10no3+[m+h]+:calculated,264.0655；found:264.0652(图4)。[0074](4)化合物4的合成[0075]室温条件下，向反应瓶中相继加入化合物lan-oh(0.263g，1mmol)、化合物2(0.398g，1mmol)和碳酸钾(0.138g，1mmol)，最后加入10mln,n-二甲基甲酰胺搅拌3h。停止反应，向反应瓶中加入饱和食盐水，将产生的沉淀离心后进一步通过硅胶柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝30:1)进一步纯化得到黄色固体化合物4(产率78％)。[0076](5)探针lan-lap的合成[0077]室温条件下，将化合物4(0.26g，0.446mmol)溶解于5ml二氯甲烷中，然后滴加1ml三氟乙酸搅拌1h。停止反应，向反应瓶中加入饱和食盐水，分层后收集有机层进行旋蒸。最后通过硅胶柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝20:1)进一步纯化，得到黄色固体产物(产率81％)。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ9.55(s,1h),8.59(d,j＝7.3hz,1h),8.21(d,j＝7.1hz,1h),7.74–7.54(m,6h),7.33(d,j＝7.9hz,2h),7.19(s,1h),6.90(d,j＝7.8hz,1h),6.78(s,1h),6.34(s,1h),5.04(s,2h),3.48–3.40(m,1h),1.74(d,j＝11.5hz,2h),1.40–1.33(m,1h),0.91(dd,j＝12.8,5.7hz,6h)(图5)。13cnmr(126mhz,cdcl3)δ183.89,173.83,161.51,151.36,145.46,144.37,138.15,132.02,131.85,131.52,131.22,131.03,130.90,128.44,127.67,125.85,124.36,119.54,113.56,106.98,101.21,70.50,53.92,43.86,25.02,23.45,21.32(图6)。ms(m/z)forc29h27n3o4+[m+h]+:calculated,482.2074；found:482.0473(图7)。[0078]实施例2[0079]对实施例1所述荧光探针lan-lap进行性质测定：[0080]2.1光谱实验一般程序[0081]首先将探针lan-lap溶解于二甲亚砜(dmso)中制得1mm的原液。由10μl探针原液、一定体积浓度的待分析物和一定体积的pbs构成的1ml测试样品溶液分别通过荧光光谱仪和紫外可见分光光度计采集数据。除非特殊说明，否则待测体系在37℃含有1％(v/v)dmso的pbs(10mm，ph7.4)中反应50min后用于检测。使用荧光光谱仪测试时，激发光设置为580nm，狭缝为2.5/2.5nm，电压为700v，记录590-750nm范围的发射光谱。使用紫外可见分光光度计测试时，使用1cm石英比色皿记录450-650nm范围的吸收光谱。[0082]结果如图8所示，在荧光光谱中(图8中a)，在580nm激发波长照射下，lap的加入使探针在642nm处的荧光发射明显增强并伴随着溶液颜色由橙色转变为荧光红(365nm紫外光照射下)。在吸收光谱中(图8中b)，lap的加入使探针lan-lap在575nm处的吸收峰明显增强并伴随溶液颜色由淡黄色向红色的转变。以上结果表明探针lan-lap可以通过荧光法和比色法有效地检测lap。[0083]对探针lan-lap及反应体系的光稳定性进行研究，如图8中c所示，在连续580nm激发光照射下，探针lan-lap及反应体系荧光强度基本保持不变，这表明探针及反应体系对光的稳定性。进一步探究温度对探针lan-lap及反应体系的影响，如图8中d所示，在25-42℃温度范围内，探针lan-lap荧光强度基本保持不变，而反应体系荧光强度随着温度的升高而逐渐增强，推测在一定范围内温度的升高可以加快酶促反应速率。[0084]为了探究探针lan-lap与lap的最佳响应时间，将探针lan-lap与不同浓度lap分别进行反应，结果如图8中e所示，随着时间的进行，反应体系的荧光强度逐渐增强大约在50min达到最大值。最后探究来自ph的影响，如图8中f所示，在ph5～9范围内，探针lan-lap荧光强度基本保持不变，表明探针lan-lap对ph的稳定性，而反应体系受ph影响较大，具体表现为荧光强度随着ph的增大而逐渐增强并在ph7.4时达到最大，随后逐渐减小，推测lap在酸性和碱性环境中活性较弱而在ph7.4时活性较高。综合以上实验结果并考虑到生命系统的环境，后续实验均在37℃下ph7.4的pbs中反应50min后进行检测。[0085]2.2检出限的测定[0086]通过荧光法和比色法分别采集20个探针空白样品在642nm处的荧光强度和575nm处的吸光度以计算出标准偏差σ。根据检测限计算公式dl＝3σ/k计算出溶液中探针lan-lap对lap的检出限。其中σ：空白样品的标准偏差；k：标准曲线斜率；dl：检出限。[0087]利用探针lan-lap对lap进行定量检测。结果如图9所示，在荧光法中，如图9中a、b所示，在580nm波长的激发光照射下，随着lap浓度逐渐增大反应体系在以642nm波长为中心的荧光发射峰逐渐增高，并且荧光强度与lap浓度(0-50u/l)之间存在良好的线性关系(r＝0.9993)，检出限(dl)低至0.0097u/l。探针lan-lap对lap的检测在荧光增强倍数、激发/发射波长及检出限等方面与其他已报道的荧光探针的比较如表1所示，探针lan-lap表现出明显的优势。在比色法中，如图9中c、d所示，随着lap浓度的增大反应体系在以575nm波长为中心的吸收峰逐渐增高，并且吸光度与lap浓度(0-50u/l)之间存在良好的线性关系(r＝0.9974)，检出限(dl)低至2.4u/l。以上结果表明，探针lan-lap能够通过荧光法和比色法双模式对lap进行定量检测。[0088]表1探针lan-lap与其它荧光探针分析性能的比较[0089][0090][0091]表1中各探针除lan-lap外，其余探针的来源依次为：[0092]hex,lil,fangy,etal.invivoimagingofleucineaminopeptidaseactivityindrug-inducedliverinjuryandlivercancerviaanear-infraredfluorescentprobe[j].chemsci.2017,8:3479-3483[0093]guk,liuy,guoz,etal.insituratiometricquantitativetracingofintracellularleucineaminopeptidaseactivityviaanactivatablenear-infraredfluorescentprobe[j].acsapplmaterinterfaces.2016,8:26622-26629.[0094]zhongr,jiangr,zengj,etal.enhancingtheselectivityofleucineaminopeptidasenear-infraredfluorescentprobesforassistinginsurgicaltumorresection[j].analchem.2023,95:2428-2435.[0095]zhangw,liuf,zhangc,etal.near-infraredfluorescentprobewithremarkablelargestokesshiftandfavorablewatersolubilityforreal-timetrackingleucineaminopeptidaseinlivingcellsandinvivo[j].analchem.2017,89:12319-12326.[0096]huangs,wuy,zengf,etal.aturn-onfluorescenceprobebasedonaggregation-inducedemissionforleucineaminopeptidaseinlivingcellsandtumortissue[j].analchimacta.2018,1031:169-177.[0097]2.3荧光量子产率的测定[0098]首先制备待测样品和空白样品。10μm探针lan-lap待测样品：10μl探针原液加入到990μlpbs中(10mm，ph7.4)；10μm荧光团lan-oh待测样品：10μl荧光团(1mm)加入到990μlpbs中(10mm，ph7.4)；空白样品：pbs(10mm，ph7.4)。待测样品及空白样品的荧光量子产率由稳态瞬态荧光光谱仪(fls920，edinburghinstrument)测得(λex＝580nm)。[0099]2.4酶动力学实验[0100]首先在pbs(10mm，ph7.4)中制备不同浓度的探针lan-lap(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μm)，然后分别加入36u/l的lap，立即在0-10min范围内每1min记录一次荧光强度(λex＝580nm)，初始反应速率由线性响应范围内的数据确定，水解过程动力学参数由下式计算:[0101]michaelis-mentenequation:[0102]lineweaver-burkequation:[0103]v：初始反应速率v：初始反应速率最大值[0104][s]：底物(探针)浓度km：michaelis常数[0105]michaelis-menten结果如图10中a所示，随着探针lan-lap浓度的逐渐增大，反应初速度呈现出由快速到缓慢的增强效果，根据初速度和探针lan-lap浓度经换算作出lineweaver-burk图(图10中b)，计算出最大速度vmax＝65.02μmmin-1，米氏常数km＝1.55μm，表明探针lan-lap对lap具有良好的亲和力和高度的敏感性。[0106]探究包括阳离子、阴离子、氨基酸、小分子及酶在内的一系列常见潜在干扰物对探针lan-lap干扰情况，结果如图11所示，探针lan-lap对除lap以外的干扰物无明显的响应且差别十分明显，即使干扰物的浓度已高达1mm，表明探针lan-lap对lap的高选择性。[0107]2.5分子对接与理论计算[0108]利用autodock4.0软件对探针lan-lap与lap进行分子对接模拟(pdbcode:1lcp)并使用autodocktools对lap结构进行处理。在对接探针lan-lap之前，分配了ad4原子类型并计算了gasteiger电荷。所有可旋转键均设置为主动扭转。对接周期、探针lan-lap和lap参数均按缺省值配置。通过pymol2.3.3和discoverystudio2020软件对对接模型进行可视化。使用gaussian16软件在b3lyp(gd3bj)/def2-svp水平上，利用密度泛函理论(dft)和时变dft(tddft)对探针lan-βgal的最佳几何结构和电子结构进行了计算并利用multiwfn3.7软件对所得数据进行进一步分析。[0109]利用质谱检测、hplc分析以及抑制剂实验来探究探针lan-lap对lap的传感机理。质谱检测结果显示，探针lan-lap的质谱峰m/z为482.0473(图7)，荧光团lan-oh的质谱峰m/z为263.9835(图4)，而反应体系出现m/z为263.8006质谱峰(图12)，这与荧光团的质谱峰基本吻合。[0110]hplc分析结果如图13所示，探针lan-lap在2.41min出峰，荧光团lan-oh在2.72min出峰，而反应体系在2.41min和2.72min均有峰出现，其中2.72min的峰与荧光团lan-oh的相吻合。[0111]抑制剂实验结果如图14所示，抑制剂bestatin对探针lan-lap和荧光团lan-oh的荧光强度均无影响，而明显抑制了反应体系的荧光强度。综合以上实验结果，探针lan-lap与lap的响应机理如图15，lap特异性识别并切断探针lan-lap的l-亮氨酸残基，随后对氨基苯甲醇连接子自发离去最终释放荧光团lan-oh从而实现对lap的检测。[0112]探针lan-lap与lap的分子对接方式如图16所示，探针lan-lap与lap中的6个氨基酸(asn384，phe387，asn81，trp383，arg399，trp398)形成13个氢键，结合能为-10.1kcal/mol，表明探针lan-lap与lap具有较强的结合亲和力。我们又对探针lan-lap和荧光团lan-oh的分子轨道进行理论计算。探针lan-lap的homo和lumo都主要位于整个荧光团中，虽然在荧光团lan-oh的homo和lumo上没有电子密度的再分布，但对应典型ict的s1到s0的跃迁(625.7nm,f＝1.1193)导致探针lan-lap与lap响应后产生强烈的荧光。荧光团lan-oh(2.58ev)的能隙低于探针lan-lap(2.99ev)，可以合理地证明lap的加入使探针lan-lap的吸收波长的红移。以上分子对接模拟和理论计算的结果支持了图15中所提出的探针lan-lap对lap的传感机理。[0113]实施例3[0114]3.1细胞实验[0115]3.1.1细胞培养[0116]所有细胞均在含有10％胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的rpmi1640中培养并保存在37℃的含5％二氧化碳/95％空气的培养箱中。[0117]3.1.2细胞毒性分析[0118]通过mtt法进行毒性分析。向96孔板每孔中加入100μlhepg2细胞悬液(105个细胞/ml)，将其保存在37℃含5％二氧化碳/95％空气的培养箱中12h。然后在每孔中加入10μl不同浓度的探针lan-lap溶液(5，10，20，30，50μm)并孵育24h。接下来在每孔加入20μlmtt溶液，4h后除去mtt溶液并向每孔加入150μldmso以溶解甲瓒晶体。最后使用酶标仪测定细胞存活率。[0119]通过cck-8法探究探针lan-lap对hepg2细胞的毒性，结果如图17所示，即使探针lan-lap的浓度高达50μm，细胞存活率仍高达90％以上，表明探针lan-lap的细胞毒性低。[0120]3.1.3细胞成像实验[0121](1)时间成像实验。准备9组hepg2细胞并分别用10μm探针lan-lap孵育，并记录不同时间时刻细胞的成像情况。[0122]lan-lap在hepg2细胞内成像的荧光强度随时间的变化情况如图18所示，随着时间的进行，细胞内荧光强度逐渐增强具体表现为在前1h内快速增强后1h缓慢增强，因此后面成像实验将1h作为探针孵育细胞的时间。[0123](2)肝癌细胞内源性lap成像。将细胞分为四组，第一组hepg2细胞和lo2细胞作为空白对照组。第二组hepg2细胞和lo2细胞用10μm探针lan-lap孵育1h后成像。第三组hepg2细胞和lo2细胞先用100um抑制剂bestatin孵育1h，再用10μm探针lan-lap孵育1h后成像。第四组hepg2细胞和lo2细胞先用300um抑制剂bestatin孵育1h，再用10μm探针lan-lap孵育1h后成像。[0124]肝癌细胞与正常肝细胞内源性lap水平如图19所示，与空白对照组相比，hepg2细胞和lo2细胞均产生荧光信号但hepg2细胞内的荧光信号明显强于lo2细胞。而抑制剂bestatin的加入抑制了hepg2细胞和lo2细胞内的荧光信号，这进一步说明了细胞的荧光信号来自lap与探针lan-lap响应。以上结果说明探针lan-lap能够用于细胞内lap的荧光成像且lap水平在肝癌细胞内较正常肝细胞表达上调。[0125](3)肝损伤细胞内源lap成像。将细胞分为四组，第一组hepg2细胞和lo2细胞作为空白对照组。第二组hepg2细胞和lo2细胞用10μm探针lan-lap孵育1h后成像。第三组hepg2细胞和lo2细胞预先用1mm对乙酰氨基酚(apap)孵育12h，再用10μm探针lan-lap孵育1h后成像。第四组hepg2细胞和lo2细胞先用100umn-乙酰半胱氨酸(nac)孵育1h，再用1mm对乙酰氨基酚孵育12h，最后用10μm探针lan-lap孵育1h后成像。[0126]肝损伤细胞内lap水平如图20所示，与hepg2细胞和lo2细胞相比(b和f)，经apap预处理的肝损伤组细胞(c和g)显示出更强的荧光信号，而预先加入100umnac(n-乙酰半胱氨酸)再孵育apap的细胞组(d和h)相比肝损伤组(c和g)显示出较弱的荧光信号，因此lap水平的升高可能与生物硫醇的缺乏有关。以上结果表明lap在肝损伤细胞内表达水平上调而探针lan-lap能够用于监测肝损伤细胞内lap水平的波动。[0127]3.2活体实验[0128]3.2.1建立肿瘤模型[0129]动物实验程序由吉林大学动物实验伦理委员会批准。[0130](1)荷瘤小鼠(hepg2肿瘤)模型：首先将1×107个hepg2细胞悬浮于300μlpbs(10mm，ph7.4)中，然后将hepg2细胞悬浮液接种于裸鼠上肢皮下。15天后模型构建完成。[0131](2)apap诱导的肝损伤小鼠模型：首先将apap溶解于温生理盐水中配制15mg/ml的apap溶液，然后将禁食过夜的裸鼠腹腔注射300mg/kgapap溶液，10h后模型构建完成。[0132](3)rfp诱导的胆汁淤积小鼠模型：首先将rfp溶解于0.5％羧甲基纤维素钠溶液中配制50mg/ml的rfp溶液，然后对小鼠连续3天每天灌胃300mg/kgrfp溶液后模型构建完成。[0133](4)腹膜转移小鼠(hepg2肿瘤)模型：首先将1×107个hepg2细胞悬浮于300μlpbs(10mm，ph7.4)中，然后将hepg2细胞悬浮液腹腔注射到裸鼠体内。3周后模型构建完成。[0134]活体成像实验在ivisluminaltseriesiii小动物成像系统上进行，激发波长为560nm，滤光片为650nm。[0135]3.2.2活体成像实验[0136](1)对比实验。将小鼠分为对照组、瘤内注射-肿瘤组、尾静脉注射-肿瘤组、apap诱导的肝损伤组以及rfp诱导的胆汁淤积型肝损伤组五组。其中瘤内注射-肿瘤组小鼠瘤内注射探针lan-lap(200μm，50μl)后记录不同时刻的荧光成像效果。其余四组小鼠尾静脉注射探针lan-lap(200μm，100μl)后记录不同时刻的荧光成像效果。[0137]利用探针lan-lap对对照组、瘤内注射-肿瘤组、尾静脉注射-肿瘤组、apap诱导的肝损伤组以及rfp诱导的胆汁淤积型肝损伤组小鼠进行荧光成像。结果如图21所示，随着时间的进行(0-300min)，对照组(图21中a)小鼠体内均匀地显示出较弱的荧光信号；瘤内注射-肿瘤组小鼠(图21中b)早在探针lan-lap注射后30min就可清晰观察到明显的荧光信号；尾静脉注射-肿瘤组小鼠(图21中c)逐渐在肿瘤部位显示出清晰的荧光信号。以上结果表明：hepg2肿瘤内lap水平表达上调，探针lan-lap能够实现活体内肿瘤的可视化。apap诱导的肝损伤组小鼠(图21中d)早在15min时就开始在肝部显示出明显的荧光信号，随着时间的进行在肝部逐渐显示出明显的、比对照组强的多的荧光信号；rfp诱导的胆汁淤积型肝损伤组小鼠(图21中e)早在15min就显示出比apap诱导的肝损伤组小鼠强得多的荧光信号。以上结果表明：肝损伤小鼠体内lap水平表达显著上调，探针lan-lap能够用于监测活体内lap水平的波动。综合以上结果，探针lan-lap是一种在活体内监测lap水平的有效手段。[0138](2)荧光指导-手术切除肿瘤实验。将荷瘤小鼠上肢部位去皮，均匀地喷涂探针(1mm，100μl)，1h后进行荧光成像，根据荧光图像的指导，切除肿瘤。[0139]结果如图22所示，喷涂探针lan-lap后小鼠上肢部分显示出明显的荧光信号(图22中c)，手术切除肿瘤后再次进行荧光成以检验肿瘤是否被完全切除，直至小鼠不显示荧光信号为止，即肿瘤被完全切除(图22中d)。以上结果表明：探针lan-lap可用于荧光指导-手术切除肿瘤过程。[0140](3)腹膜转移小鼠成像实验。将小鼠分为对照组(正常小鼠)和腹膜转移组两组，分别尾静脉注射探针lan-lap(200μm，100μl)，1h后进行荧光成像。随后将两组小鼠解剖，取出小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃以及肠等主要内脏器官进行荧光成像。[0141]将探针lan-lap用于腹膜转移小鼠体内lap的荧光成像，结果如图23所示，腹膜转移小鼠(图23中b)相对于对照组小鼠(图23中a)显示出更强的荧光信号；解剖后腹膜转移小鼠内脏(图23中d)的荧光信号整体强于对照组的内脏(图23中c)，其中肠、胃，特别是肝脏部位的荧光信号更强，推测hepg2肿瘤主要转移到了肠、胃，特别是肝脏部位。以上结果表明：探针lan-lap可用于腹膜转移小鼠的荧光成像。[0142]尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有式i所示的结构；2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将lan-oh与式ii所示化合物进行第一取代反应，得式iii所示化合物；(2)利用式iii所示化合物进行第二取代反应，得式i所示荧光探针；3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述lan-oh具有如式iv所示的结构；4.权利要求1所述荧光探针在制备检测亮氨酸氨基肽酶的产品中的应用。5.权利要求1所述荧光探针在制备疾病诊断产品中的应用，所述疾病的诊断生物标志物包括亮氨酸氨基肽酶。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述疾病包括肝损伤类疾病和肿瘤。7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述疾病诊断产品为可视化诊断产品。8.根据权利要求5或7所述应用，其特征在于，所述疾病诊断产品基于荧光法或比色法完成可视化诊断。

技术总结
本发明公开了一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针及制备方法和应用，属于荧光探针技术领域。本发明提供了一种特异性识别亮氨酸氨基肽酶的荧光探针，基于ICT机理响应LAP，可应用于检测细胞及活体内LAP水平。本发明所述荧光探针LAN-lap由荧光团LAN-OH通过对氨基苯甲醇连接子与L-亮氨酸残基相连构成，具有稳定性高、选择性好、水溶性好、灵敏度高、检出限低等优势，可通过荧光法和比色法实现对LAP的定量检测。本发明所述探针LAN-lap是一种很有前途的诊断与LAP作为生物标志物的疾病的有效手段，如肝癌及肝损伤相关疾病等的有效诊断。如肝癌及肝损伤相关疾病等的有效诊断。如肝癌及肝损伤相关疾病等的有效诊断。


技术研发人员：马品一 宋大千 高德江 徐兰兰
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/5