一种肝癌专用的类器官培养基、培养方法与传代方法与流程

1.本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种肝癌专用的类器官培养基、培养方法与传代方法。


背景技术：

2.肝癌最为常见，据最新数据统计，其可占到肝癌的80％左右。随着人们的生活习惯和工作环境的变化，并且医疗卫生水平的提高，肝癌的确诊人数在逐年增加。2020年全球的肝癌确诊患者超过了90万，在我国，原发性肝癌是排在第4位的常见恶性肿瘤。由于肝癌多于晚期才被诊断，导致其在肿瘤致死病因中排第2位。肝癌发生发展机制仍不清楚，目前只能通过手术、放化疗和肝移植等手段治疗，但预后仍较差，且易复发，有研究表明其五年生存率仅为12.1％。由于肝癌肿瘤异质性的临床用药问题以及预防术后复发的风险变得极其困难，迫切需要有异质性和稳定的临床前肝癌模型。肿瘤细胞系内细胞组成单一，仅由肿瘤细胞构成，不包含间质细胞、内皮细胞和免疫细胞等，无法模拟肿瘤微环境不能代表肿瘤在体内的环境，无法反应药物对肿瘤的作用；而另一种常用的人类肿瘤研究模型——患者来源的肿瘤异种移植(patient-drived xenograft，pdx)模型直接来源于患者，能准确反映肿瘤的遗传异质性，但建立模型成本高、耗时长等缺点限制了其在肿瘤精准治疗中的广泛应用。而类器官与体内器官高度相似的遗传学背景及组织学特征；拥有类似真实器官的复杂结构，并能部分模拟来源组织器官的生理功能。
3.由于类器官是多能干细胞或器官祖细胞分化，自组装成有结构和功能的三维组织结构。形成各种类器官往往需要培养基、基质、生长因子和小分子化合物等等组分，且不同种了器官所需要的组分不尽相同。而现有的技术中，针对肝癌类器官的培养基以及肝癌的培养方法的研究较少，且培养效果不佳，难以获得在体外长期稳定培养的肝癌类器官模型。寻找一种能够高效培养得到肝癌类器官的培养基、高效的肝癌类器官的培养及传代方法是对临床医学研究有着重大的意义。


技术实现要素：

4.针对上述背景技术中的问题，本发明的目的在于提供一种肝癌专用的类器官培养基、应用和培养方法、传代方法。
5.第一方面，本发明提供一种肝癌专用的类器官培养基。具体技术方案如下：
6.一种肝癌专用的类器官培养基，所述培养基包含：advanced dmem/f12培养基、l-谷氨酰胺、hepes缓冲液、a83-01、n-乙酰半胱氨酸、b-27、spondin 1重组蛋白、noggin头蛋白、y-27632、地塞米松、重组人-gastrinⅰ、wnt3a、胰岛素样生长因子-1、胰岛素、forskolin、tnf-α。
7.进一步地，所述培养基组成如下：
8.3％l-谷氨酰胺、
9.500nmol/l a83-01、
10.1-1.5mmol/l n-乙酰半胱氨酸、
11.2％b-27、
12.100-200ug/ml spondin 1重组蛋白、
13.100-200ng/ml noggin头蛋白、
14.10-20μmol/l y-27632、
15.2-10nmol/l地塞米松、
16.10-50nmol/l重组人-gastrinⅰ(胃泌素)、
17.10-100ng/ml wnt3a、
18.0-50ng/ml胰岛素样生长因子-1、
19.1-2μg/ml胰岛素、
20.10-100nmol/l forskolin(毛喉素)、
21.10-100nmol/l tnf-α(炎症细胞因子)；
22.其它为advanced dmem/f12培养基和hepes缓冲液。
23.第二方面，本发明提供一种前述培养基在培养肝癌类器官中的应用。
24.第三方面，本发明提供一种采用前述培养基培养人原肝癌类器官的培养方法，包括以下步骤：
25.(一)将肝癌组织提前预冷含有抗生素的pbs溶液清洗剪碎；
26.(二)使用含有由胶原酶ⅱ、dnase i、advanced dmem/f12配制而成的消化液进行37℃水浴震荡分次消化；
27.(三)每消化30min，进行一次静置，待较大组织块自然沉降收集浑浊的消化液体上层，进行至少三次，期间可使用吹打帮助消化；
28.(四)将收集到的液体通过100μm的细胞筛过滤；
29.(五)4℃、300g离心收集，获得肝癌细胞簇沉淀；
30.(六)加入红细胞裂解液，4℃裂解红细胞，离心4℃、300g；
31.(七)加入适量的培养基重悬沉淀，进行台盼蓝计数，将上述步骤得到的肝癌细胞簇悬液以200-400个细胞簇/10ul基质胶(matrigel)的密度接种于低吸附24孔培养板中，在37℃下倒置直至胶滴凝固；
32.(八)加入提前预热的第一方面的肝癌类器官培养基后在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，培养5-10天得到类器官。
33.第四方面，本发明提供一种采用前述培养基培养人原肝癌类器官的快速稳定传代方法，具体步骤如下：
34.(一)收集第三方面培养成功的类器官胶滴，溶解胶质200g离心得到类器官悬液；
35.(二)通过40μm和70μm和100μm细胞筛筛选获得不同大小的类器官；
36.(三)将不同大小的类器官悬液分别进行收集，用胰酶的分别进行消化，然后用40μm过筛收集筛选悬液，得到大小均一的细胞簇，使用台盼蓝计数；
37.(三)上述步骤得到的肝癌细胞簇悬液以200-400个细胞簇/10ul基质胶(matrigel)的密度接种于新的24孔板中，在37℃下倒置直至胶滴凝固。
38.(四)加入提前预热的第一方面的肝癌类器官培养基后在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，培养3-7天得到传代类器官。
39.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
40.本发明肝癌类器官培养基中添加的胰岛素可以促进葡萄糖的吸收，tnf-α(炎症细胞因子)可通过nf-κb信号在肝细胞中诱导dna复制，影响细胞增殖，促进肝癌类器官的培养，能够在培养初期快速得到类器官，且类器官不易凋亡可以稳定传代。
41.本发明提供的肝癌类器官传代方法，能够提供大小均一的传代肝癌类器官，并使其大量而且快速的增殖。
附图说明
42.图1为肝癌类器官培养基进行培养得到的肝癌类器官的生长情况图；图1-a为第一天培养图，图1-b为培养到第8天原代类器官生长图。
43.图2为经过本发明方法传代的类器官培养初期情况图；
44.图3为经过本发明方法传代的类器官培养后期情况图。
具体实施方式
45.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
46.实施例1
47.一种肝癌类器官培养基，包括：3％l-谷氨酰胺、500nmol/l a83-01、1-1.5mmol/l n-乙酰半胱氨酸、2％b-27、100-200ug/ml spondin 1重组蛋白、100-200ng/ml noggin头蛋白、10-20μmol/l y-27632、2-10nmol/l地塞米松、10-50nmol/l重组人-gastrinⅰ、10-100ng/ml wnt3a、0-50ng/ml胰岛素样生长因子-1、1-2μg/ml胰岛素、10-100nmol/l forskolin、10-100nmol/l tnf-α；其它为advanced dmem/f12培养基和hepes缓冲液。
48.实施例2
49.使用实施例1的肝癌类器官培养基按照如下方法进行肝癌类器官的培养。
50.具体步骤如下：
51.将肝癌组织提前预冷含有抗生素的dpbs溶液清洗剪碎。使用含有由胶原酶ⅱ、dnase i、advanced dmem/f12配制而成的消化液进行37℃水浴震荡分次消化。每消化30min，进行一次静置，待较大组织块自然沉降收集浑浊的消化液体上层。进行至少三次，期间可使用吹打帮助消化。
52.将收集到的液体通过100μm的细胞筛过滤。4℃、300g离心收集的上层液体，获得肝癌细胞簇沉淀。加入适量的培养基重悬沉淀，进行台盼蓝计数，将上述步骤得到的肝癌细胞簇悬液以200-400个细胞簇/10ul基质胶(matrigel)的密度接种于24孔板中，在37℃下倒置直至胶滴凝固。
53.加入提前预热的实施例1的肝癌类器官培养基后在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，培养5-10天得到类器官。
54.肝癌类器官培养基进行培养得到的肝癌类器官的生长情况见图1。
55.图1-a为第一天培养图，图1-b为培养到第8天原代类器官生长图。肝癌组织从细胞培养到肝癌类器官共8天，可以明显看出肝癌组织生长较快形成类器官。
56.实施例3
57.使用实施例1的肝癌类器官培养基按照如下方法进行肝癌类器官的传代培养。
58.具体步骤如下：
59.收集实施例2中培养成功的类器官胶滴，溶解胶质200g离心得到类器官悬液。通过40μm和70μm和100μm细胞筛筛选获得不同大小的类器官。将不同大小的类器官悬液分别进行收集，用胰酶的分别进行消化，然后用40μm过筛收集筛选悬液，得到大小均一的细胞簇，使用台盼蓝计数。上述步骤得到的肝癌细胞簇悬液以200-400个细胞簇/10ul基质胶(matrigel)的密度接种于新的24孔板中，在37℃下倒置直至胶滴凝固。
60.加入提前预热的实施例1的肝癌类器官培养基后在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，培养3-7天得到传代类器官。
61.传代后，类器官生长情况见图2-3。
62.图2-a、2-b、2-c为原代肝癌类器官培养情况，为经过本方法传代的类器官培养初期情况，传代初期，细胞生长较小，但是大小均一。图3-a、3-b、3-c为经过本方法传代的类器官培养后期情况，经过本方法传代的类器官的生长速度趋同，生长大小更加均一，且可以大量快速的繁殖，方便下一步类器官实验，可以提供更高通量实验，对实验结果的准确更加可靠，更节省时间和成本，因此提高通量。
63.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

技术特征：
1.一种肝癌专用的类器官培养基，其特征在于，所述培养基包含：advanced dmem/f12培养基、l-谷氨酰胺、hepes缓冲液、a83-01、n-乙酰半胱氨酸、b-27、spondin1重组蛋白、noggin头蛋白、y-27632、地塞米松、重组人-gastrinⅰ、wnt3a、胰岛素样生长因子-1、胰岛素、forskolin、tnf-α。2.根据权利要求1所述的一种肝癌专用的类器官培养基，其特征在于，所述培养基组成如下：3％l-谷氨酰胺、500nmol/l a83-01、1-1.5mmol/l n-乙酰半胱氨酸、2％b-27、100-200ug/ml spondin 1重组蛋白、100-200ng/ml noggin头蛋白、10-20μmol/l y-27632、2-10nmol/l地塞米松、10-50nmol/l重组人-gastrinⅰ、10-100ng/ml wnt3a、0-50ng/ml胰岛素样生长因子-1、1-2μg/ml胰岛素、10-100nmol/l forskolin、10-100nmol/l tnf-α；其它为advanced dmem/f12培养基和hepes缓冲液。3.一种如权利要求1-2任一所述的培养基在培养肝癌类器官中的应用。4.一种采用权利要求1-2任一所述的培养基培养人原肝癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)将肝癌组织提前预冷含有抗生素的pbs溶液清洗剪碎；(二)使用含有由胶原酶ⅱ、dnase i、advanced dmem/f12配制而成的消化液进行37℃水浴震荡分次消化；(三)每消化30min，进行一次静置，待较大组织块自然沉降收集浑浊的消化液体上层，进行至少三次，期间可使用吹打帮助消化；(四)将收集到的液体通过100μm的细胞筛过滤；(五)4℃、300g离心收集，获得肝癌细胞簇沉淀；(六)加入红细胞裂解液，4℃裂解红细胞，离心4℃、300g；(七)加入适量的培养基重悬沉淀，进行台盼蓝计数，将上述步骤得到的肝癌细胞簇悬液以200-400个细胞簇/10ul基质胶(matrigel)的密度接种于低吸附24孔培养板中，在37℃下倒置直至胶滴凝固；(八)加入提前预热的肝癌类器官培养基后在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，培养5-10天得到类器官。5.一种采用权利要求1-2任一所述的培养基培养人原肝癌类器官的快速稳定传代方法，其特征在于，具体步骤如下：
(一)收集培养成功的类器官胶滴，溶解胶质200g离心得到类器官悬液；(二)通过40μm和70μm和100μm细胞筛筛选获得不同大小的类器官；(三)将不同大小的类器官悬液分别进行收集，用胰酶的分别进行消化，然后用40μm过筛收集筛选悬液，得到大小均一的细胞簇，使用台盼蓝计数；(三)上述步骤得到的肝癌细胞簇悬液以200-400个细胞簇/10ul基质胶(matrigel)的密度接种于新的24孔板中，在37℃下倒置直至胶滴凝固。(四)加入提前预热的肝癌类器官培养基后在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，培养3-7天得到传代类器官。

技术总结
本发明公开了一种肝癌专用的类器官培养基、应用和培养方法、传代方法，本发明肝癌类器官培养基中添加的胰岛素可以促进葡萄糖的吸收，TNF-α(炎症细胞因子)可通过NF-κB信号在肝细胞中诱导DNA复制，影响细胞增殖，促进肝癌类器官的培养，能够在培养初期快速得到类器官，且类器官不易凋亡可以稳定传代。本发明提供的肝癌类器官传代方法，能够提供大小均一的传代肝癌类器官，并使其大量而且快速的增殖。并使其大量而且快速的增殖。并使其大量而且快速的增殖。


技术研发人员：苗春光 王倩 许心悦
受保护的技术使用者：安徽骆华生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/8/5