基于RPA检测mcr-1基因的组合物、试剂盒和应用的制作方法

基于rpa检测mcr-1基因的组合物、试剂盒和应用
技术领域
1.本发明涉及生物学检测技术领域，尤其是涉及一种基于rpa检测mcr-1基因的组合物、试剂盒和应用。


背景技术：

2.多黏菌素类抗生素因具有抗菌作用、促进畜禽生长等显著优势，长期饲料添加剂广泛应用。随着临床多重耐药菌(mdr)以及耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(cre)的出现，多黏菌素受到重视，一度被认为是治疗mdr和cre感染的最后一道防线。随着质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1的发现，并被证实其可通过结合性质粒在不同菌种间进行水平传播，介导多黏菌素耐药。因此，加强对质粒介导多黏菌素耐药基因细菌的监测和防控迫在眉睫。
3.目前国内针对mcr-1基因已建立了多种检测方法，其中包括普通pcr法、荧光定量pcr法和环介导等温扩增(lamp)等方法。这些技术大多针对纯培养的细菌，且需借助于pcr仪等大型精密仪器设备，操作繁琐，耗时耗力，结果判读不够直观。因此，亟需一种针对原始样本(如粪便等)操作简便、检测时间短、结果易判读、灵敏度高、特异性强的多黏菌素耐药基因mcr-1核酸检测方法。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的在于提供一种基于rpa检测mcr-1基因的组合物和含有该组合物的检测mcr-1基因的试剂盒，以提升耐药基因mcr-1检测的特异性及检测效率，具有很好的临床应用价值。
6.本发明的另一目的在于提供上述基于rpa检测mcr-1基因的组合物和含有该组合物的试剂盒的应用。
7.为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
8.根据本发明的一个方面，提供了一种基于rpa检测mcr-1基因的组合物，该组合物包含上游引物、下游引物和探针，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；
9.所述探针为3’端阻断的寡聚核苷酸，且含有核酸内切酶nfo识别位点，所述核酸内切酶nfo识别位点与5’端的距离≥30bp；
10.所述探针的5’端标记第一标记物，所述下游引物的5’端标记第二标记物，所述第一标记物和所述第二标记物与不同的分子特异性结合。
11.优选地，所述第一标记物包括荧光素；和/或，所述第二标记物包括生物素；
12.优选地，所述荧光素包括6-羧基荧光素或异硫氰酸荧光素；
13.优选地，所述探针的3’端经封闭修饰形成3’端阻断的寡聚核苷酸，所述封闭修饰选自间臂修饰或3’磷酸化修饰；所述间臂修饰包括spacer c3修饰、spacer c6修饰、spacer 9修饰、dspacer修饰或pc-linker修饰；
14.优选地，所述核酸内切酶nfo识别位点为使用四氢呋喃取代该位点的核苷酸；
15.优选地，seq id no.3所示核苷酸的第31位替换为四氢呋喃。
16.优选地，所述组合物包括：
17.上游引物：5
’‑
gataccgccaaataccaagaaaatgtgc-3’；
18.下游引物：3
’‑
acaaagtcatctaagccaacgagcat-biotin-5’；
19.探针：
[0020]5’
6-fam-cgattataaatccgcgaccaacaacgccat/idsp/tgcaacaccaatcct-3’c3-spac er；
[0021]
其中，biotin表示下游引物的5’端标记生物素，6-fam表示探针的5’端标记6-羧基荧光素，/idsp/表示将seq id no.3所示核苷酸的第31位替换为四氢呋喃作为核酸内切酶nfo的切断位点，c3-spacer表示探针的3’端经spacer c3修饰。
[0022]
根据本发明的一个方面，还提供了一种检测mcr-1基因的试剂盒，该试剂盒包含上述组合物和免疫层析试纸；
[0023]
所述免疫层析试纸沿待测样本流动方向依次包括样品垫和检测线；所述样品垫包被有示踪标记物标记的第一结合分子，所述第一结合分子特异性结合所述第一标记物；所述检测线包被有第二结合分子，所述第二结合分子特异性结合所述第二标记物。
[0024]
根据本发明的另一个方面，还提供了基于rpa检测mcr-1基因的引物对，该引物对包括上述核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物。
[0025]
根据本发明的另一个方面，还提供了mcr-1基因的检测方法，该检测方法包括上述基于rpa检测mcr-1基因的组合物，或上述检测mcr-1基因的试剂盒，或上述引物对扩增待测样本。
[0026]
根据本发明的另一个方面，还提供了上述基于rpa检测mcr-1基因的组合物，或上述检测mcr-1基因的试剂盒，或上述引物在鉴别耐多黏菌素细菌，或制备鉴别耐多黏菌素细菌的产品中的应用。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0028]
rpa扩增成功的关键是相应靶基因保守区的选择，其引物和探针的长度及复杂性也高于普通pcr扩增，以使在检测的过程中特异性更好，灵敏度更高，能够快速精准的得到检测结果。本发明中的引物和探针均经过了严格的实验验证及优化筛选，具有优异的特异性和灵敏度。
[0029]
本发明提供的基于rpa检测mcr-1基因的组合物及包含其的试剂盒检测样本具有检测快速的优势：其采用恒温扩增方式进行多黏菌素耐药基因mcr-1的扩增，能直接对原始样本进行检测，无需对其进行菌株培养，节省了培养菌株所需的18～24h；扩增时间相比于普通pcr方法显著缩短，通常不超过10min；对于扩增产物的检测，采用免疫层析试纸实现，检测时间短，通常约5min即可完成免疫层析试纸检测，从获得样本到得到检测结果，通常15min内即可完成全部检测。
[0030]
本发明提供的基于rpa检测mcr-1基因的组合物及包含其的试剂盒检测样本具有检测简便的优势：由于其可以直接对原始样本进行检测，因此省略了菌株培养的操作步骤，减少了大量的工作量；其在恒温下扩增，以及可视化结果呈现方式能够摆脱对大型精密仪
器设备的依赖；其使用方便，操作简单，可视化结果呈现方式直观明了，无需过多的人为参与解读。
[0031]
本发明提供的基于rpa检测mcr-1基因的组合物及包含其的试剂盒检测样本具有较高的灵敏度和特异性：其检测多黏菌素耐药基因mcr-1的最低检测限为5
×
102copies/ml～1
×
103copies/ml，具有较高的灵敏度；并且对mcr-2基因、mcr-3基因和mcr-4基因均无检出，具有良好的灵敏度。
附图说明
[0032]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]
图1为本发明实施例1提供的试剂盒结果判读示意图；
[0034]
图2为本发明效果例1中各引物探针组合的检测阴性样本的检测结果；
[0035]
图3为本发明效果例1中第19～第27组引物和探针的组合检测阳性样本的检测结果；
[0036]
图4为本发明效果例2中各浓度引物和探针的组合检测阳性样本的检测结果；
[0037]
图5为本发明效果例3中灵敏度考察结果；
[0038]
图6为本发明效果例4中特异性考察结果；
[0039]
图7为本发明效果例5中考察实施例1试剂盒检测真实样本的考察结果；
[0040]
图8为本发明效果例5中考察实施例1试剂盒检测菌株样本的考察结果；
[0041]
图9为本发明效果例6中考察试剂盒中反应液加样方式的考察结果。
具体实施方式
[0042]
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0043]
rpa(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶介导等温扩增)是一种恒温核酸扩增技术。反应原理为：在恒定温度下，两个特异性引物与重组酶结合形成复合体，搜寻同源模板序列，确定特异性位点，打开双链dna，形成互补链。将rpa与免疫层析试纸结合可以实现即时诊断，通过设计特异性的rpa引物和探针，在恒温条件下引物和探针通过重组酶的帮助与模板结合并在dna聚合酶和核酸外切酶的作用下，实现模板的快速扩增。经过不同标记物标记的探针和引物共同扩增形成两端有不同标记的目标片段。最终反应产物通过免疫层析试纸进行结果的呈现。该方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、不需要昂贵仪器、结果判读直观等优势。
[0044]
基于该检测原理，本发明针对mcr-1基因保守区域，提供了一种基于rpa检测mcr-1基因的组合物。本文中多黏菌素耐药基因mcr-1也记为mcr-1基因，二者可以互相替换使用。
[0045]
本发明提供的组合物包含上游引物、下游引物和探针，上游引物的核苷酸序列如
seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，最终反应产物可以通过免疫层析试纸进行结果的呈现。
[0046]
在该组合物中，探针为3’端阻断的寡聚核苷酸，且含有核酸内切酶nfo识别位点，所述核酸内切酶nfo识别位点与5’端的距离≥30bp。
[0047]
在可选的实施方式中，探针的3’端经封闭修饰形成3’端阻断的寡聚核苷酸，所述封闭修饰选自间臂修饰或3’磷酸化修饰；所述间臂修饰包括但不限于spacer c3修饰、spacer c6修饰、spacer 9修饰、dspacer修饰或pc-linker修饰。
[0048]
在可选的实施方式中，在seq id no.3所示核苷酸的距离5’端最短30bp以及距离3’端最远15bp处的一碱基替换为四氢呋喃(thf)作为内切酶nfo的切断位点。
[0049]
在可选的实施方式中，在seq id no.3所示核苷酸距离5’端30bp以及距离3’15bp处，且在左右需为胸腺嘧啶的一碱基替换为四氢呋喃，即将seq id no.3所示核苷酸的第31位替换为四氢呋喃作为核酸内切酶nfo的切断位点。
[0050]
并且，该组合物中探针的5’端标记第一标记物，下游引物的5’端标记第二标记物，且第一标记物和第二标记物能够被不同的分子识别并结合。第一标记物和第二标记物的作用是使扩增产物继承引物和探针的标记物，在使用免疫层析试纸检测的步骤中，扩增产物可以被试纸中包被的能与之结合的分子捕获，形成可检测的抗体-抗原-抗体免疫复合物。需要说明的是，本发明不限制第一标记物和第二标记物具体的选择何种标记物，只要能分别与被包被在免疫层析试纸中不同区域的分子结合且不干扰扩增反应即可，本领域技术人员可以根据实际需要结合本领域一般知识选择第一标记物和第二标记物。
[0051]
在可选的实施方式中，所述第一标记包括荧光素，所述荧光素包括但不限于6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-fam)或异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，fitc)。
[0052]
在可选的实施方式中，所述第二标记包括生物素(biotio)。
[0053]
在可选的实施方式中，基于rpa检测mcr-1基因的组合物如下所示：
[0054]
上游引物mcr-1-p3f：5
’‑
gataccgccaaataccaagaaaatgtgc-3’；
[0055]
下游引物mcr-1-p3biotinr：3
’‑
acaaagtcatctaagccaacgagcat-biotin-5’；
[0056]
探针mcr-1-p3famp：
[0057]5’
6-fam-cgattataaatccgcgaccaacaacgccat/idsp/tgcaacaccaatcct-3’c3-spac er。
[0058]
其中，biotin表示下游引物的5’端标记生物素，6-fam表示探针的5’端标记6-羧基荧光素，/idsp/表示将seq id no.3所示核苷酸的第31位替换为四氢呋喃作为核酸内切酶nfo的切断位点，c3-spacer表示所述探针的3’端经spacer c3修饰。
[0059]
根据本发明的另一个方面，还提供了用于检测mcr-1基因的试剂盒，该试剂盒包含上述基于rpa检测mcr-1基因的组合物和免疫层析试纸，
[0060]
所述免疫层析试纸具有本领域一般的免疫层析试纸的结构，沿待测样本流动方向依次包括样品垫和检测线，以及如本领域一般的、公知的例如质控线、吸水垫和支撑结构等。
[0061]
所述样品垫包被有示踪标记物标记的第一结合分子，所述第一结合分子特异性结合所述第一标记物，构成特异性结合对；所述检测线包被有第二结合分子，所述第二结合分
子特异性结合所述第二标记物，构成特异性结合对。特异性结合对是指具有特异性结合关系的两种物质，例如抗体和抗原，或受体和配体。试剂盒的检测原理基于“三明治夹心法”，具体的：
[0062]
经rpa扩增反应，若待测样本中存在编码mcr-1基因的多核苷酸，则扩增产物中存在第一标记物和第二标记物标记的目的片段，当样本流经样品垫，样品垫上包被的示踪标记物标记的第一结合分子与目的片段上标记的第一标记物结合，形成“第二标记物-第一标记物-第一结合分子-示踪标记物”复合物；该复合物流经检测线，检测线处包被有第二结合分子，第二结合分子通过与第二标记物特异性结合捕获上述复合物，在检测线区域形成“第二结合分子-第二标记物-第一标记物-第一结合分子-示踪标记物”，从而使检测线由于聚集了示踪标记物显示出现可检测的信号。
[0063]
质控线的设置可根据本领域公知的方式设置，本发明对此不做限制。在可选的实施方式中，质控线包被有第三结合分子，所述第三结合分子特异性结合第一结合分子。如有目标片段生成，检测体系在经过检测线时，“第二标记物-第一标记物-第一结合分子-示踪标记物”复合物与第二结合分子结合，且多余体系被质控线包被的第三结合分子通过与第一结合分子结合，捕获上述复合物，以及体系中未充分反应而游离的“第一标记物-第一结合分子”，因此检测线和质控线均能够出现可检测信号；如无目标片段生成，检测体系在经过检测线时，游离的“第一标记物-第一结合分子”被第三结合分子捕获。只有质控线能够出现可检测信号。
[0064]
在可选的实施方式中，第一标记物与第一结合分子构成抗原-抗体特异性结合对，优选地，所述第一标记物包括荧光素，所述第一结合分子包括荧光素抗体；进一步优选的，所述荧光素包括6-羧基荧光素或异硫氰酸荧光素，所述第一结合分子包括抗fitc抗体。在可选的实施方式中，第二标记物与第二结合分子构成受体-配体特异性结合对，优选地，所述第二标记物包括生物素，所述第二结合分子包括链霉亲和素。
[0065]
在可选的实施方式中，第一结合分子与第三结合分子构成抗原-抗体特异性结合对，所述第三结合分子优选为能够特异性结合第一份子的抗体。
[0066]
在可选的实施方式中，所述第三结合分子包括结合抗fitc抗体的抗体。
[0067]
可选地实施方式中，所述示踪标记物包括但不限于胶体金、胶体硒、胶体银、胶体碳、乳胶微球、彩色微球、荧光微球或荧光分子中的任意一种。可检测的信号可由仪器检测，例如采用荧光微球或荧光分子作为示踪标记物形成的荧光信号；或者直接形成肉眼可观测的信号，例如彩色微球、胶体金、胶体银、胶体碳的富集导致的检测区显色。优选的实施方式中，示踪标记物选自能够直接形成肉眼可观测的信号的标记物，例如胶体金。
[0068]
可选地实施方式中，所述试剂盒还包括酶、dntps、atp(三磷酸腺苷)、磷酸肌酸二钠盐、dtt(二硫苏糖醇)、缓冲体系和冻干保护剂中的至少一种；所述酶包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、重组酶辅酶、核酸内切酶nfo和ck(磷酸激酶)。
[0069]
可选地实施方式中，所述试剂盒还包括冻干试剂，所述冻干试剂包括所述引物探针组合物、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、重组酶辅酶、核酸内切酶nfo、dntps、atp、ck、磷酸肌酸二钠盐、dtt、缓冲体系和冻干保护剂。其中冻干试剂可选择本领域可接受的任选的冻干保护剂。
[0070]
可选地实施方式中，所述试剂盒的反应体系中上游引物和下游引物的终浓度分别
独立的为50～100nm，例如可以为但不限于为50、60、70、80、90或100nm，或其任意两点的范围，优选为80nm。
[0071]
可选地实施方式中，所述试剂盒的反应体系中探针的终浓度为20～30nm，例如可以为但不限于为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30nm，或其任意两点的范围，优选为24nm。
[0072]
可选地实施方式中，所述试剂盒还包括反应液、稀释液、阴性对照和阳性对照中的至少一种，优选还包括反应液、稀释液、阴性对照和阳性对照。
[0073]
可选地实施方式中，反应液包括聚乙二醇和镁离子。镁离子可选地由本领域常规的镁盐提供，包括但不限于乙酸镁、氯化镁和硫酸镁中的至少一种，镁离子在反应液中的浓度优选为10～20mm，例如可以为但不限于为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mm，或其中任意两点间的范围。聚乙二醇(peg)可选地为peg30000～40000，优选peg35000。聚乙二醇在反应液中的浓度优选为1～2％wt，例如可以为但不限于为1、1.1、1.2、1.3、1.14、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0％wt，或其中任意两点间的范围。在一些可选的实施方式中，聚乙二醇选自peg35000，镁离子由乙酸镁提供。可选地实施方式中，聚乙二醇和乙酸镁经预混作为成反应液；在另一可选地实施方式中，聚乙二醇和乙酸镁分别独立包装作为组成反应液的成分。
[0074]
可以理解的是，前述实施方式提供的基于rpa检测mcr-1基因的组合物中是联合了rpa和免疫层析试纸检测扩增产物提供的引物对和探针，其中探针的作用主要是实现后续采用免疫层析试纸检测。当不采用免疫层析试纸检测扩增产物时，该组合物中的引物对也可以独立使用，或者配合用于实现其他检测方法的探针使用，因此本发明还保护基于rpa检测mcr-1基因的组合物中核苷酸序列分别如seq id no.1和2的引物对。
[0075]
根据本发明的一个方面，还提供了一种mcr-1基因的检测方法，该检测方法包括使用前述基于rpa检测mcr-1基因的组合物或其中的引物对，或前述检测mcr-1基因的试剂盒扩增待测样本。
[0076]
在可选的实施方式中，使用前述基于rpa检测mcr-1基因的组合物或前述检测mcr-1基因的试剂盒扩增待测样本的扩增程序为37～44℃反应5～20min后终止反应，反应温度例如可以为但不限于为37、38、39、40、41、42、43或44℃，或其中任意两点间的温度范围；反应时间例如可以为但不限于为5～20min，例如可以为但不限于为5、10、15或20min，或其中任意两点间的时间范围。终止反应可选择本领域常规方式，例如高温将用于扩增反应的酶灭活。
[0077]
可选的实施方式中，扩增程序为39℃恒温反应8min；95℃酶灭活2min。
[0078]
可选的实施方式中，先将聚乙二醇和乙酸镁混合，再与其他组分混合成反应体系。
[0079]
可选的实施方式中，所述检测方法包括：获取待测样本核酸作为模板，使用所述试剂盒扩增模板并将反应产物滴加至所述免疫层析试纸的样本区中，然后滴加稀释液，根据免疫层析试纸检测线和质控线的检测值判定检测结果。根据免疫层析试纸检测线和质控线的检测值判定检测结果指的是根据检测线和质控线是否出现可观测的检测值，以及出现可观测的检测值的组合形式判断检测结果，具体的：当检测线和质控线均出现可观测的检测值，则判断待测样本中存在检测阈值含量以上的mcr-1基因；当只有质控线出现可观测的检测值，则判断待测样本中mcr-1基因的拷贝量不足检测阈值；当质控线不能出现可观测的检
测值，则判断检测无效。
[0080]
根据本发明的一个方面，还提供了前述基于rpa检测mcr-1基因的组合物或其中的引物对，或前述检测mcr-1基因的试剂盒在鉴别耐多黏菌素细菌，或制备鉴别耐多黏菌素细菌的产品中的应用。
[0081]
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0082]
实施例1
[0083]
本实施例提供了一种检测mcr-1基因的试剂盒，包括含有基于rpa检测mcr-1基因的组合物的冻干试剂，以及胶体金免疫层析试纸、反应液、稀释液、阴性对照和阳性对照。
[0084]
根据genbank中多黏菌素耐药基因mcr-1的序列(kp347127.1)进行序列比对，确定保守区域，设计得到下述引物和探针：
[0085]
mcr-1-p3f：5
’‑
gataccgccaaataccaagaaaatgtgc-3’(seq id no.1)；
[0086]
mcr-1-p3r：3
’‑
acaaagtcatctaagccaacgagcat-5’(seq id no.2)；
[0087]
mcr-1-p3p：5
’‑
cgattataaatccgcgaccaacaacgccatctgcaacaccaatcct-3’(seq id no.3)。
[0088]
添加修饰后得到如下组合物：
[0089]
mcr-1-p3f：5
’‑
gataccgccaaataccaagaaaatgtgc-3’[0090]
mcr-1-p3biotinr：3
’‑
acaaagtcatctaagccaacgagcat-biotinr-5’；
[0091]
mcr-1-p3famp：
[0092]5’
6-fam-cgattataaatccgcgaccaacaacgccat/idsp/tgcaacaccaatcct-3’c3-spac er。
[0093]
其中，biotin表示下游引物的5’端标记生物素，6-fam表示探针的5’端标记6-羧基荧光素，/idsp/表示将seq id no.3所示核苷酸的第31位替换为四氢呋喃作为核酸内切酶nfo的切断位点，c3-spacer表示所述探针的3’端经spacer c3修饰。
[0094]
免疫层析试纸沿待测样本流动方向依次包括样品垫、检测线和质控线。样品垫包被标记胶体金的抗fitc抗体，能够与扩增产物中标记的6-fam结合；检测线包被链霉亲和素，能够与扩增产物中标记的生物素结合；质控线包被羊抗兔igg抗体，可以与包被有抗fitc抗体的胶体金结合。
[0095]
所述冻干试剂中还包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、重组酶辅酶、核酸内切酶nfo、特异性引物探针、海藻糖、dntps、atp、ck、磷酸肌酸二钠盐、dtt和缓冲体系。
[0096]
反应液包括浓度为3％wt的聚乙二醇peg35000和浓度为280mm的乙酸镁。该试剂盒单人份反应液36.5μl中包括peg35000 29.4μl和乙酸镁2.5μl。
[0097]
稀释液如表1所示：
[0098]
表1
[0099][0100]
该试剂盒的反应体系为50μl反应体系，包括36.5μl反应液和13.5μl待检测的核酸样品或13.5μl阴/阳性对照。
[0101]
反应体系中，各物质的终浓度为：
[0102]
表2
[0103]
mcr-1-p3f/mcr-1-p3biotinr80nmmcr-1-p3famp24nm重组酶120ng/μl单链结合蛋白600ng/μl聚合酶30ng/μl重组酶辅酶60ng/μl核酸内切酶nfo90ng/μldntps200μmatp5mmck100ng/μl磷酸肌酸二钠盐50mmdtt2mm缓冲体系50mm
[0104]
反应程序为：39℃恒温反应8min；95℃酶灭活2min。
[0105]
本试剂盒的使用方法为：
[0106]
(a)提取待测样品的核酸为模板。
[0107]
(b)按照上述试剂盒反应体系将冻干试剂、反应液和13.5μl待检测的核酸样品或13.5μl阴/阳性对照混合，按照上述反应程序进行快速扩增。
[0108]
(c)取扩增产物10μl加入试纸条样本孔中，并滴两滴(约100μl)稀释液于样本孔中，5分钟内观察试验结果。若检测线和质控线均显色，则表示待测样本中存在mcr-1基因，若检测线显色，质控线不显色，则表示待测样本中不存在mcr-1基因，或存在的mcr-1基因的拷贝量低于检测线；若质控线不显色，无论检测线是否检测，表示检测结果无效。具体判定方式如图1所示。
[0109]
本实施例试剂盒的检测原理为：若待测样本中存在mcr-1基因，则扩增产物中存在6-fam和生物素标记的扩增产物。免疫层析试纸条为“三明治夹心法”胶体金试纸条，在样品垫上端含有包被抗fitc抗体的胶体金，可与探针的5’端修饰的6-fam标记结合，形成“生物素-fam-抗fitc抗体-胶体金”复合物；试纸检测线(t线)处包被有链霉亲和素，可与生物素结合，质控线(c线)处包被igg，可以与包被抗fitc抗体的胶体金结合。如有目标片段生成，
检测体系在经过t线时，“生物素-fam-抗fitc抗体-胶体金”复合物与链霉亲和素结合，则t线显色，多余体系被c线捕获后c线显色；当无目标片段生成时，检测体系在经过t线时，“fam-抗fitc抗体-胶体金”复合物不与链霉亲和素结合，则t线不显色，检测体系被c线捕获后c线显色，如图1所示。下述效果例中效果例中如无特别说明，样本为粪便样本。粪便样本经培养后，通过荧光定量pcr和药敏实验确定样本为阴性样本或阳性样本。
[0110]
效果例1
[0111]
根据genbank中多黏菌素耐药基因mcr-1的序列(kp347127.1)进行序列比对，确定保守区域，设计多组rpa引物探针(表3)，其中mcr-1-p3f、mcr-1-p3biotinr和mcr-1-p3famp为实施例1中使用的引物和探针。
[0112]
表3
[0113]
引物名称 引物序列序列idmcr-1-p1f5
’‑3’
atgttcagctatctgggcgcggatgaseq id no.4mcr-1-p2f5
’‑3’
atgcttatgacaatgccttgcttgccaccgseq id no.5mcr-1-p3f5
’‑3’
gataccgccaaataccaagaaaatgtgcseq id no.1mcr-1-p1biotinr3
’‑5’
catcacgccttttgagtccgaattattatcseq id no.6mcr-1-p2biotinr3
’‑5’
gacaccgttctcacccagactttcgccatseq id no.7mcr-1-p3biotinr3
’‑5’
acaaagtcatctaagccaacgagcatseq id no.2mcr-1-p1famp5
’‑3’
gtcgataccgccaaataccaagaaaatgtgctggatacgctggatseq id no.8mcr-1-p2famp5
’‑3’
ccagtggctgcagacgcacagcaatgcctatgatgtctcaatgctseq id no.9mcr-1-p3famp5
’‑3’
cgattataaatccgcgaccaacaacgccatctgcaacaccaatcctseq id no.3
[0114]
按照实施例1中引物和探针的修饰方式对表3中的下游引物和探针进行修饰，得到如下下游引物和探针：
[0115]
下游引物：
[0116]
mcr-1-p1biotinr：3
’‑
catcacgccttttgagtccgaattattatc-biotinr-5’；
[0117]
mcr-1-p2biotinr：3
’‑
gacaccgttctcacccagactttcgccat-biotinr-5’；
[0118]
mcr-1-p3biotinr：3
’‑
acaaagtcatctaagccaacgagcat-biotinr-5’；
[0119]
探针：
[0120]
mcr-1-p1famp：
[0121]5’
6-fam-gtcgataccgccaaataccaagaaaatgt/idsp/ctggatacgctggat-3’c3-spacer；
[0122]
mcr-1-p2famp：
[0123]5’
6-fam-ccagtggctgcagacgcacagcaatgcct/idsp/tgatgtctcaatgct-3’c3-space r；
[0124]
mcr-1-p3famp：
[0125]5’
6-fam-cgattataaatccgcgaccaacaacgccat/idsp/tgcaacaccaatcct-3’c3-spac er。
[0126]
将表3中的上游引物、下游引物和探针按照表4组合，按照实施例1记载的免疫层析试纸、反应体系和检测方法检测样本。
[0127]
表4
[0128][0129]
第1～第27组检测阴性结果如图2所示，从图2可以看出探针mcr-1-p1famp和探针mcr-1-p2famp的检测结果中存在多组假阳性，探针mcr-1-p3famp无假阳性检测结果，说明以mcr-1-p3famp作为探针检测结果更佳。使用第19～第27组检测阳性样本，两次检测见过如图3所示，可以看出mcr-1-p3f和mcr-1-p3biotinr的组合更佳。
[0130]
效果例2引物探针浓度测试
[0131]
调整mcr-1-p3f、mcr-1-p3biotinr和mcr-1-p3famp的添加量，使体系中终浓度为：
[0132]
组1：上游终浓度50nm，下游终浓度50nm，探针终浓度20nm；
[0133]
组2：上游终浓度80nm，下游终浓度80nm，探针终浓度24nm；
[0134]
组3：上游终浓度100nm，下游终浓度100nm，探针终浓度30nm；
[0135]
nc为阴性对照组。
[0136]
利用已知的mcr-1基因强阳，中阳和弱阳性真实样本，按照实施例1记载的免疫层析试纸、反应体系和检测方法检测样本。结果如图4所示，从图4中结果可以针对强阳，中阳和弱阳性样本，组1～3均可检测，组2的检出效果最优。
[0137]
效果例3灵敏度检测实验
[0138]
根据多黏菌素耐药基因mcr-1(kp347127.1)质粒的分类及亲缘关系，选择序列相近的mcr-2(ng_051171.1)、mcr-3(ng_055505.1)以及mcr-4(ng_057471.1)耐药基因序列，由河马生物合成并克隆构建质粒puc-mcr-1、puc-mcr-2、puc-mcr-3以及puc-mcr-4。
[0139]
根据公式，计算puc-mcr-1等重组质粒拷贝数：拷贝数(拷贝/μl)＝6.02
×
10
23
×
质粒浓度(ng/μl)
×
10-9
/(质粒碱基数
×
660)。
[0140]
将制备得到的mcr-1阳性质粒依次进行稀释至105copies/ml、104copies/ml、103copies/ml、5
×
102copies/ml浓度，并将其作为模板。使用实施例1提供的试剂盒确定该方法的最低检测浓度。
[0141]
结果如图5所示，图5中a为模板105copies/ml的检出线，b为模板104copies/ml的检出线，c为模板103copies/ml的检出线，d为模板5
×
102copies/ml的检出线，e为阴性对照。从图5可以看出实施例提供的试剂盒检测限浓度可低至5
×
102copies/ml。
[0142]
效果例4特异性检测实验
[0143]
将效果例3获得的puc-mcr-1、puc-mcr-2、puc-mcr-3、puc-mcr-4阳性质粒以及真实mcr-1阳性大肠杆菌作为模板。使用实施例1提供的试剂盒来确定试剂盒的检出特异性。
[0144]
结果如图6所示，图6中a为模板puc-mcr-2，b为模板puc-mcr-3，c为模板puc-mcr-1，d为模板含有mcr-1基因的大肠杆菌，e为puc-mcr-4。从图6可以看出，puc-mcr-1质粒和含
有mcr-1基因的大肠杆菌基因组dna中检测出mcr-1基因，其他3种阳性质粒均未检测出mcr-1基因，说明实施例1提供的试剂盒具有良好的特异性。
[0145]
效果例5真实样本，菌株样本检测实验
[0146]
利用已经经过检测的mcr-1基因阳性真实样本和阴性真实样本以及mcr-1基因阳性菌株为实际样品检测对象，采用上海伯杰医疗核酸提取纯化试剂(沪奉械备20200012号)，提取其基因组dna，并将其作为模板。按照本发明提供的检测方法来进行检测。以puc-mcr-1质粒为阳性对照，以生理盐水为阴性对照。
[0147]
真实粪便样本检测结果如图7所示，图7中编号1-44均为阴性样本，218标记的为阳性样本，nc为阴性对照。样品编号1-44和阴性对照均无检出线产生，样品编号218和阳性对照均有检出线产生，证明实施例1提供的试剂盒对实际样本的检测结果与其他方法检测结果一致。
[0148]
菌株样本检测结果如图8所示，图8中a为阳性对照，b、c、d均为阳性菌株样本，e为阴性对照。从图8可以看出，实施例提供的试剂盒可全部检出阳性菌株样本。
[0149]
效果例6反应液组分加样方式评估实验
[0150]
利用已经经过检测的mcr-1基因弱阳、中阳、强阳性真实样本作为模板。分别设置聚乙二醇(peg35000)和乙酸镁混合后加样，聚乙二醇和乙酸镁分开加样两种加样方式。按照实施例记载的检测方法来进行检测。
[0151]
结果如图9所示，a为聚乙二醇和乙酸镁混合后加样，b为聚乙二醇和乙酸镁分开加样，s1为弱阳样本，s2为中阳样本，s3为强阳样本，nc为阴性对照。从图9可以看出反应液组分聚乙二醇和乙酸镁混合后加样方式检出效果更优，且操作步骤更精简。
[0152]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种基于rpa检测mcr-1基因的组合物，其特征在于，包含上游引物、下游引物和探针，上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述探针为3’端阻断的寡聚核苷酸，且含有核酸内切酶nfo识别位点，所述核酸内切酶nfo识别位点与5’端的距离≥30bp；所述探针的5’端标记第一标记物，所述下游引物的5’端标记第二标记物，所述第一标记物和所述第二标记物与不同的分子特异性结合。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一标记物包括荧光素；和/或，所述第二标记物包括生物素；优选地，所述荧光素包括6-羧基荧光素或异硫氰酸荧光素；优选地，所述探针的3’端经封闭修饰形成3’端阻断的寡聚核苷酸，所述封闭修饰选自间臂修饰或3’磷酸化修饰；所述间臂修饰包括spacer c3修饰、spacer c6修饰、spacer 9修饰、dspacer修饰或pc-linker修饰；优选地，所述核酸内切酶nfo识别位点为使用四氢呋喃取代该位点的核苷酸；优选地，seq id no.3所示核苷酸的第31位替换为四氢呋喃；优选地，所述组合物包括：上游引物：5
’‑
gataccgccaaataccaagaaaatgtgc-3’；下游引物：3
’‑
acaaagtcatctaagccaacgagcat-biotin-5’；探针：5’6-fam-cgattataaatccgcgaccaacaacgccat/idsp/tgcaacaccaatcct-3’c3-spac er；其中，biotin表示下游引物的5’端标记生物素，6-fam表示探针的5’端标记6-羧基荧光素，/idsp/表示将seq id no.3所示核苷酸的第31位替换为四氢呋喃作为核酸内切酶nfo的切断位点，c3-spacer表示探针的3’端经spacer c3修饰。3.检测mcr-1基因的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的组合物和免疫层析试纸；所述免疫层析试纸沿待测样本流动方向依次包括样品垫和检测线；所述样品垫包被有示踪标记物标记的第一结合分子，所述第一结合分子特异性结合所述第一标记物；所述检测线包被有第二结合分子，所述第二结合分子特异性结合所述第二标记物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫层析试纸的质控线包被有第三结合分子，所述第三结合分子特异性结合第一结合分子；优选地，所述示踪标记物包括胶体金、胶体硒、胶体银、胶体碳、乳胶微球、彩色微球、荧光微球或荧光分子中的任意一种；优选地，所述第一标记物与所述第一结合分子构成抗原-抗体特异性结合对；优选地，所述第一标记物包括荧光素；优选地，所述荧光素包括6-羧基荧光素或异硫氰酸荧光素；优选地，所述第一结合分子包括抗异硫氰酸荧光素抗体；优选地，所述第二标记物与所述第二结合分子构成受体-配体特异性结合对；优选地，所述第二标记物包括生物素，所述第二结合分子包括链霉亲和素。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶、dntps、三磷酸腺
苷、磷酸肌酸二钠盐、二硫苏糖醇、缓冲体系和冻干保护剂中的至少一种；优选地，所述酶包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、重组酶辅酶、核酸内切酶nfo和磷酸激酶；优选地，所述试剂盒还包括冻干试剂，所述冻干试剂包括所述引物探针组合物、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、重组酶辅酶、核酸内切酶nfo、dntps、三磷酸腺苷、磷酸激酶、磷酸肌酸二钠盐、二硫苏糖醇、缓冲体系和冻干保护剂；优选地，反应体系中所述上游引物和所述下游引物的终浓度分别独立的为50～100nm；所述探针的终浓度为20～30nm；优选地，反应体系中所述上游引物和所述下游引物的终浓度分别独立的为80nm；所述探针的终浓度为24nm。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应液、稀释液、阴性对照和阳性对照中的至少一种；优选地，所述反应液包括聚乙二醇和镁离子；优选地，所述聚乙二醇包括peg30000～40000，优选为peg35000；优选地，反应体系中，聚乙二醇的终浓度为1～2％wt，乙酸镁的终浓度为10～20mm。7.基于rpa检测mcr-1基因的引物对，其特征在于，包括权利要求1或2中所述上游引物和所述下游引物。8.mcr-1基因的检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1或2所述的组合物，或权利要求3～6任一项所述的试剂盒，或权利要求7所述的引物对扩增待测样本。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的组合物，或权利要求3～6任一项所述的试剂盒扩增待测样本，扩增程序为37～44℃反应5～20min后终止反应；优选地，扩增程序为39℃恒温反应8min；95℃酶灭活2min；优选地，先将聚乙二醇和乙酸镁混合，再与其他组分混合成反应体系；优选地，所述检测方法包括：获取待测样本核酸作为模板，使用所述试剂盒扩增模板并将反应产物滴加至所述免疫层析试纸的样本区中，然后滴加稀释液，根据免疫层析试纸检测线和质控线的检测值判定检测结果。10.权利要求1或2所述的组合物，或权利要求3～6任一项所述的试剂盒，或权利要求7所述的引物对在鉴别耐多黏菌素细菌，或制备鉴别耐多黏菌素细菌的产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种基于RPA检测mcr-1基因的组合物、试剂盒和应用，涉及生物学检测的技术领域。该组合物包含上游引物、下游引物和探针，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且探针为3’端阻断的寡聚核苷酸，非末端位置还含有核酸内切酶nfo识别位点；探针的5’端标记第一标记物，下游引物的5’端标记第二标记物，第一标记物和第二标记物与不同的分子特异性结合。该基于RPA检测mcr-1基因的组合物和试剂盒简化了mcr-1基因的检测方法，且具有良好的灵敏度和特异性。特异性。特异性。


技术研发人员：丰俊 陈敏 庄源 陈洪友 张曦 袁政安 吴寰宇 罗嘉远
受保护的技术使用者：上海市疾病预防控制中心
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/8/6