金钗石斛总生物碱及其提取方法和在降血糖药物中的应用与流程

1.本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种金钗石斛总生物碱及其提取方法和在降血糖药物中的应用。


背景技术：

2.金钗石斛(dendrobium nobile lindl)又名：万丈须、金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草，为多年生草本，因形像古代头上的发钗而得名。茎丛生，上部稍扁而稍弯曲上升，高10～60厘米，粗达1.4厘米。石斛具有其功效都为益胃生津，滋阴清热。多用于阴伤津亏、口干烦渴、食少干呕病后虚热、目暗不明等。
3.糖尿病(diabetes mellitus，dm)是由胰岛素分泌不足或胰岛素作用障碍所致的一种代谢性疾病，它的发病率逐年增加，已成为继心脑血管病以及癌症之后严重威胁人类生命健康的第三大疾病，中药治疗糖尿病有极大的优势和潜力。
4.中医药是我国医药卫生的宝贵资源，从中草药资源中寻找安全有效的预防或延缓降血糖进程的药物不仅具有科学依据，也具有现实意义。金钗石斛主要含有生物碱类、多糖类、黄酮类、甾体糖苷类、香豆素类及酚类等多种活性成分，其中金钗石斛总生物碱(dendrobium nobile lindl.alkaloids,dnla)是金钗石斛的主要活性成分之一，因此选取了金钗石斛总生物碱进行降血糖的研究。
5.目前金钗石斛总生物碱的提取一般采用大孔吸附树脂或有机溶剂萃取，但是大孔吸附树脂纯化效率一般较高，处理量大，成本低，回收率高，且可长期重复使用，但是所得产品的纯度较低；有机溶剂萃取具有操作简单，所得产品纯度较高等优点，但大量使用成本较高，易造成环境污染。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是现有金钗石斛总生物碱的提取方式各自存在一定的问题，例如大孔吸附树脂所得产物纯度低，有机溶剂成本高且易造成环境污染。
7.本发明的目的在于提供一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括：
8.金钗石斛茎粉末经乙醇回流提取后浓缩得到浸膏；
9.采用酸将浸膏进行溶解且调节ph值为3～4，通过大孔吸附树脂进行动态吸附纯化；
10.依次使用蒸馏水、10wt％～30wt％乙醇以及70wt％～80wt％乙醇清洗大孔吸附树脂，收集洗脱液且浓缩，得到浓缩液；
11.用酸溶液将浓缩液稀释，后加入碱性溶液调节ph至9～10，后采用有机溶剂萃取，干燥得到金钗石斛总生物碱。
12.作为一种可能的设计，所述回流提取中乙醇的浓度为70wt％～75wt％，料液比为1：8～1:12。
13.作为一种可能的设计，通过所述大孔吸附树脂的液体的流速为2～3bv/h。
14.作为一种可能的设计，所述大孔吸附树脂的径高比1：6～8，优选1:8。
15.作为一种可能的设计，所述有机溶剂为二氯甲烷。
16.作为一种可能的设计，所述大孔吸附树脂的型号为ab-8，体积为4bv。
17.作为一种可能的设计，乙醇回流提取中温度为60℃～80℃，优选70℃～80℃。
18.本发明的有益效果为：
19.1.本发明巧妙地将大孔吸附树脂吸附和有机溶剂萃取相结合，在降低成本的同时也提高了金钗石斛总生物碱的纯度，纯度大于65％，并且金钗石斛总生物碱中除了石斛碱以外的其它生物碱的含量均有所提高，特别是红星碱b的含量。
20.2.本发明制得的金钗石斛总生物碱在降血糖方面具有显著的效果，可应用了糖尿病的血糖控制。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。在附图中：
22.图1为本发明实施例1中给予stz后五周到取材时的sd大鼠的体重变化趋势图；
23.图2为本发明实施例1中第九周各组别sd大鼠24h尿液中蛋白含量测试结果图；
24.图3为本发明实施例1中各组别sd大鼠血清中tc含量的测定图；
25.图4为本发明实施例1中各组别sd大鼠血清中tg含量的测定图；
26.图5为本发明实施例1中金钗石斛总生物碱对各组大鼠血糖水平的影响图。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
28.本发明的发明人想探究金钗石斛总生物碱在降血糖方面的效果，因此在从金钗石斛中提取金钗石斛总生物碱的过程中发现现有的两种提取方式主要存在以下问题：1.大孔吸附树脂纯化效率一般较高，处理量大，成本低，回收率高，且可长期重复使用，但是所得产品的纯度较低；2.有机溶剂萃取具有操作简单，所得产品纯度较高等优点，但大量使用成本较高，易造成环境污染。
29.为了解决前述两种方式各自存在的上述问题，本发明一种金钗石斛总生物碱的提取方法，将大孔吸附树脂纯化和有机溶剂萃取相结合，两者互补不仅能够降低成本和提高总生物碱的纯度，而且还能提高红星碱b的含量。
30.本发明公开一种金钗石斛总生物碱的提取方法包括：
31.s1.金钗石斛茎粉末经乙醇回流提取后浓缩得到浸膏；
32.s2.采用酸将浸膏进行溶解且调节ph值为3～4，通过大孔吸附树脂进行动态吸附纯化；
33.s3.依次使用蒸馏水、10wt％～30wt％乙醇以及70wt％～80wt％乙醇清洗大孔吸
附树脂，收集洗脱液且浓缩，得到浓缩液；
34.s4.用酸溶液将浓缩液稀释，后加入碱性溶液调节ph至9～10，后采用有机溶剂萃取，干燥得到金钗石斛总生物碱。
35.步骤s1中乙醇回流提取过程中的温度一般为60℃～80℃，例如60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，优选75℃～80℃，更优选80℃。乙醇回流提取过程中的料液比一般为1:8～1:12，优选1:10～1:12，更优选1:12。乙醇的浓度一般为70wt％～75wt％，例如：70wt％、72wt％、75wt％等等。
36.步骤s2中酸一般为盐酸/或硫酸。大孔吸附树脂的型号一般为ab-8，体积为4bv，流速一般为2～3bv/h，优选3bv/h。大孔吸附树脂的径高比一般为1：6～8，优选1:8。
37.步骤s4中碱性溶液一般为氢氧化钠饱和溶液或浓氨水。所述有机溶剂为二氯甲烷。
38.实施例1
39.本实施例公开了一种金钗石斛总生物碱的提取方法，包括以下步骤：
40.1.1取金钗石斛干燥药材10kg，采用10倍量的75％乙醇提取，回流提取两次，每次煎煮2小时，水用量为药材的10倍，将醇提液滤过，合并滤液浓缩、干燥后得到金钗石斛提取物浸膏；将制得的浸膏用ph＝3-4的盐酸溶液溶解，过滤得到上样液；
41.1.2取适量ab-8大孔树脂于烧杯中，加入3倍体积95％乙醇置于室温下，浸泡一天，使树脂充分溶胀；之后处理过的树脂转移至树脂柱内，继续加95％乙醇冲洗，直至冲洗液在试管中加5倍体积的水稀释时不浑浊；进一步用去离子水洗涤至乙醇无醇味即可；然后以5bv/h流速加入5％盐酸溶液浸泡后，用去离子水洗至中性，之后以同样流速加入5％氢氧化钠溶液浸泡后，洗至中性；浸泡在去离子水中备用；
42.1.3取1.1中的上样液装到ab-8大孔吸附树脂上，先用水冲洗除杂，再用25％乙醇冲洗除去醇溶性杂质，再用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥后得到金钗石斛总生物碱。
43.对实施例1制得的金钗石斛总生物碱中生物碱含量的测定方法，包含以下步骤：
44.1.1标准曲线的制备：精密称取石解碱对照品0.50mg，置50ml容量瓶中，少量三氯甲烷充分溶解后定容至刻度；用移液枪分别取50、150、200、300、400微升于1.5ml具塞玻璃试管中，分别加适量三氯甲烷补至500微升体积；加入ph＝4.5的缓冲溶液250微升和0.04％溴甲酚绿溶液100微升，剧烈振摇3min，静置30min，分层，取下层三氯甲烷液100微升于96孔板，加0.01mol/lnaoh-无水乙醇溶液20微升，摇匀，以上操作均在冰上进行，取三氯甲烷溶液，同法操作，作为空白对照；于酶标仪620nm处测定吸光度。以石解碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线得回归方程，a＝21.681c+0.071(r＝0.9991)，在1.5-5.5μg/ml有良好的线性关系；
45.1.2金钗石斛总生物碱样品的测定：称取供试品金钗石斛总生物碱0.50mg，置5ml容量瓶中，少量三氯甲烷完全溶解后定容至刻度；移液枪移取200微升于1.5ml具塞玻璃试管中，加三氯甲烷300微升，摇匀，作为样品液，其余操作参照1.1进行。
46.金钗石斛总生物碱含量以及各生物碱在总生物碱中的比重，其中主要生物碱有：石斛碱、红星碱b、石斛星碱、2-羟基石斛碱、6-羟基石斛碱、4-羟基石斛碱、红星碱a、红星碱c、石斛酮碱等，它们分别占金钗石斛总生物碱的79.242wt％、1.238wt％、0.423wt％、
0.277wt％、0.231wt％、0.062wt％、0.101wt％、0.007wt％、0.016wt％。
47.本实施方式得到的金钗石斛总生物碱纯度达65wt％以上，其中：石斛碱和红星碱b占金钗石斛总生物碱的79.242wt％、1.238wt％。
48.金钗石斛总生物碱降血糖的药效研究
49.1.1高血糖动物模型的建立、实验分组及给药
50.spf级雄性sd大鼠随机分为空白组(c)、模型组(m)、卡格列净组(y、10mg/kg)、金钗石斛总生物碱低、中、高剂量组(d：20mg/kg、z：40mg/kg、g/h：80mg/kg)，每组10只。除了空白组以外，采用高脂高糖饲料干预3周后，一次腹腔注射stz40mg/kg诱导糖尿病大鼠模型；模型建立成功后药物组分别给予对应剂量的药物灌胃给药5周，空白组和模型组采用蒸馏水灌胃给药5周。
51.1.2金钗石斛总生物碱缓解糖尿病大鼠体重下降，降低糖尿病大鼠摄食/水量
52.在给药过程中，对各组大鼠的体重、摄食、摄水进行监控。大鼠体重变化结果如图1所示，由图1可知，模型组大鼠的体重与空白组相比显著下降，平均摄食量和平均摄水量与空白组相比显著增加；与模型组相比经过金钗石斛总生物碱治疗后，金钗石斛总生物碱40mg/kg、80mg/kg治疗组的体重下降趋势有所减弱，平均摄食量和平均摄水量显著降低。
53.1.3金钗石斛总生物碱降低糖尿病大鼠空腹血糖
54.在给药过程中每周测定一次大鼠的空腹血糖(fbg)，测定前一天晚上，动物禁食不禁水(12小时)，翌晨用血糖仪测量大鼠空腹血糖。结果如图5所示，结果表明，模型组大鼠血糖长期维持在较高水平，约为空白组的5倍左右；经过金钗石斛总生物碱给药后，糖尿病大鼠的空腹血糖显著性降低(p＜0.05)，并随给药时间的延长持续降低；统计分析结果显示三个剂量组降血糖的作用呈现剂量依赖性。
55.1.4金钗石斛总生物碱改善糖尿病大鼠血脂代谢紊乱
56.各组大鼠连续灌胃给药5周后，麻醉后腹主动脉取血，采用试剂盒测定各组大鼠血清甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)等水平。结果如图3和图4所示，结果表明，与空白组相比，模型组大鼠tg、tc等水平明显升高(p＜0.05)，脂质代谢紊乱；与模型组相比，金钗石斛总生物碱40mg/kg、80mg/kg治疗组大鼠tg、tc等水平明显下降(p＜0.05)。表明金钗石斛总生物碱可通过改善血脂代谢紊乱起到治疗糖尿病的作用。
57.大鼠饲养至第9周观察sd大鼠24h尿量中蛋白含量情况，结果如图2所示，由图2可知，与模型组相比，金钗石斛总生物碱40mg/kg、80mg/kg治疗组大鼠尿液中蛋白含量明显下降(p＜0.05)，表明金钗石斛总生物碱可通过改善蛋白的代谢紊乱起到治疗糖尿病的作用。
58.实施例2
59.金钗石斛干燥茎20kg粉碎后，过筛、称重；75％乙醇浸泡药材过夜后，分成两份，两份分别按照12:1、8:1的液料比混合，加热回流提取2次，每次提取3h；过滤后合并滤液，浓缩干燥后得到金钗石斛提取物浸膏；采用ab-8大孔树脂进行纯化，选择径高比1：8、流速3bv/h，水洗脱除杂，25％乙醇洗脱除杂后，采用75％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥得第一次纯化后得到的富集产物；再用酸水溶解第一次纯化后得到的富集产物，加入碱性试剂调节ph＝10，用二氯甲烷萃取除杂后，收集有机溶剂层并回收有机溶剂、干燥后得到最终的金钗石斛总生物碱富集产物；经hplc-ms/ms分析，可以得到金钗石斛总生物碱含量以及各生物碱在总生物碱中的占比，具体实施方法参照例1所述。
60.本实施方式得到的金钗石斛总生物碱纯度达73％以上，其中石斛碱和红星碱b占金钗石斛总生物碱的82.736％、5.3％。
61.实施例3
62.金钗石斛干燥茎20kg粉碎后，过筛、称重；75％乙醇浸泡药材过夜后，按照12:1的液料比混合，加热回流提取2次，每次提取3h；过滤后合并滤液，浓缩干燥后得到金钗石斛提取物浸膏；采用ab-8大孔树脂进行纯化，选择径高比1：8、流速2bv/h，水洗脱除杂，10％乙醇洗脱除杂后，采用85％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥得第一次纯化后得到的富集产物；再用酸水溶解第一次纯化后得到的富集产物，加入碱性试剂调节ph＝9，用二氯甲烷萃取除杂后，收集有机溶剂层并回收有机溶剂、干燥后得到最终的金钗石斛总生物碱富集产物；经hplc-ms/ms分析，可以得到金钗石斛总生物碱含量以及各生物碱在总生物碱中的占比，具体实施方法参照例1所述，
63.本实施方式得到的金钗石斛总生物碱纯度达68％以上，其中石斛碱和红星碱b占金钗石斛总生物碱的79.248％、3.4％。
64.实施例4
65.金钗石斛干燥茎20kg粉碎后，过筛、称重；75％乙醇浸泡药材过夜后，按照12:1的液料比混合，加热回流提取2次，每次提取3h；过滤后合并滤液，浓缩干燥后得到金钗石斛提取物浸膏；采用ab-8大孔树脂进行纯化，选择径高比1：8、流速2bv/h，水洗脱除杂，10％乙醇洗脱除杂后，采用85％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥得第一次纯化后得到的富集产物；再用酸水溶解第一次纯化后得到的富集产物，加入浓氨水调节ph＝9，用二氯甲烷萃取除杂后，收集二氯甲烷层并回收有机溶剂、干燥后得到最终的金钗石斛总生物碱富集产物；经hplc-ms/ms分析，可以得到金钗石斛总生物碱含量以及各生物碱在总生物碱中的占比，具体实施方法参照例1所述，
66.本实施方式得到的金钗石斛总生物碱纯度达68％以上，其中石斛碱和红星碱b占金钗石斛总生物碱的79.248％、3.4％。
67.实施例5
68.金钗石斛干燥茎40kg粉碎后，过筛、称重；80％乙醇浸泡药材过夜后，按照9:1的液料比混合，加热回流提取3次，每次提取2h；过滤后合并滤液，浓缩干燥后得到金钗石斛提取物浸膏；采用ab-8大孔树脂进行纯化，选择径高比1：8、流速2bv/h，水洗脱除杂，15％乙醇洗脱除杂后，采用70％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥得第一次纯化后得到的富集产物；再用酸水溶解第一次纯化后得到的富集产物，加入浓氨水调节ph＝10，用二氯甲烷萃取除杂后，收集二氯甲烷层并回收有机溶剂、干燥后得到最终的金钗石斛总生物碱富集产物；经hplc-ms/ms分析，可以得到金钗石斛总生物碱含量以及各生物碱在总生物碱中的占比，具体实施方法参照例1所述，
69.本实施方式得到的金钗石斛总生物碱纯度达70％以上，其中石斛碱和红星碱b占金钗石斛总生物碱的80.149％、2.7％。
70.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种金钗石斛总生物碱的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：金钗石斛茎粉末经乙醇回流提取后浓缩得到浸膏；采用酸将浸膏进行溶解且调节ph值为3～4，通过大孔吸附树脂进行动态吸附纯化；依次使用蒸馏水、10wt％～30wt％乙醇以及70wt％～80wt％乙醇清洗大孔吸附树脂，收集洗脱液且浓缩，得到浓缩液；用酸溶液将浓缩液稀释，后加入碱性溶液调节ph至9～10，后采用有机溶剂萃取，干燥得到金钗石斛总生物碱。2.根据权利要求1所述的金钗石斛总生物碱的提取方法，其特征在于，所述回流提取中乙醇的浓度为70wt％～75wt％，料液比为1：8～1:12。3.根据权利要求1所述的金钗石斛总生物碱的提取方法，其特征在于，通过所述大孔吸附树脂的液体的流速为2～3bv/h。4.根据权利要求1所述的金钗石斛总生物碱的提取方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的径高比1：6～8，优选1:8。5.根据权利要求1所述的金钗石斛总生物碱的提取方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷。6.根据权利要求1所述的金钗石斛总生物碱的提取方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的型号为ab-8，体积为4bv。7.根据权利要求1所述的金钗石斛总生物碱的提取方法，其特征在于，乙醇回流提取中温度为60℃～80℃，优选70℃～80℃。8.如权利要求1-7任一项所述提取方法所得金钗石斛总生物碱。9.根据权利要求8所述的金钗石斛总生物碱，其特征在于，所述金钗石斛总生物碱的纯度≥65％。10.一种权利要求8或9所述金钗石斛总生物碱在降低血糖药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种金钗石斛总生物碱及其提取方法和在降血糖药物中的应用，提取方法包括：金钗石斛茎粉末经乙醇回流提取后浓缩得到浸膏；采用酸将浸膏进行溶解且调节pH值为3～4，通过大孔吸附树脂进行动态吸附纯化；依次使用蒸馏水、10wt％～30wt％乙醇以及70wt％～80wt％乙醇清洗大孔吸附树脂，收集洗脱液且浓缩，得到浓缩液；用酸溶液将浓缩液稀释，后加入碱性溶液调节pH至9～10，后采用有机溶剂萃取，干燥得到金钗石斛总生物碱。将大孔吸附树脂吸附和有机溶剂萃取相结合，在降低成本的同时提高了金钗石斛总生物碱的纯度。制得的金钗石斛总生物碱在降血糖方面具有显著的效果。总生物碱在降血糖方面具有显著的效果。总生物碱在降血糖方面具有显著的效果。


技术研发人员：赵学勇 隋美玲 岑川
受保护的技术使用者：成都融济华泰医药科技有限公司
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/8/6