结合LAG-3的抗体及其用途的制作方法

结合lag-3的抗体及其用途
1.本技术为2018年7月12日提交的、发明名称为“结合lag-3的抗体及其用途”的pct申请pct/cn2018/095528的分案申请，所述pct申请进入中国国家阶段的日期为2020年1月13日，申请号为201880046646.x。


背景技术：

2.治疗性抗体是制药工业中增长最快的部分之一，特别是靶向某些与疾病相关的细胞蛋白的单克隆抗体。
3.一种这样的靶蛋白是淋巴细胞激活基因3，其也被称为lag3(cd223)，是人类中lag3基因编码的蛋白。lag3是cd4样蛋白，其与cd4一样，与mhc ii类分子结合，并且在功能上属于负性共刺激群(抑制性辅助受体)[crawford a等,ej.curr opin immunol.21:179-86(2009)]，并且参与t细胞应答的下降/抑制。
[0004]
深入分析显示lag-3负调节t细胞的稳态、细胞增殖和激活[workman cj等,eur jimmunol 33:970-9(2003)]。使用抗体阻断lag-3进行癌症治疗的临床前研究显示肿瘤部位处抗原特异性t细胞的激活增强和对肿瘤生长的破坏[grosso jf等,j clin invest 117:3383-92(2007)]。此外，双重抗lag-3/抗pd-1抗体治疗治愈了大多数荷有在很大程度上对单一抗体治疗具有抗性的既定肿瘤的小鼠。[woo sr等,cancer res；72:917-27(2011)]。
[0005]
尽管与lag-3结合的单克隆抗体是已知的(例如us 2011/0150892和us 2014/0093511)，但是需要具有增强的结合亲和力和其它所期望的药物特征的另外的单克隆抗体。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供了一种分离的单克隆抗体，例如人类单克隆抗体，其与lag-3(例如人类lag-3和猴lag-3)结合并且与现有的抗lag-3抗体(例如由百时美施贵宝公司(bristol-myers squibb)开发的bms-986016)相比，具有增加的亲和力。
[0007]
本发明的抗体可以用于多种应用，包括在携带肿瘤或携带病毒的受试者中检测lag-3蛋白和刺激抗原特异性t细胞应答。
[0008]
因此，在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体(例如人类抗体)或其抗原结合部分，其具有重链可变区，所述重链可变区包含：包含seq id no:2的氨基酸序列的cdr1区；包含seq id no:4的氨基酸序列的cdr2区；和包含seq id no:6的氨基酸序列的cdr3区。在一个实施方案中，seq id no:2、4和6的氨基酸序列可以分别由seq id no:1、3和5的核酸序列编码。
[0009]
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体(例如人类抗体)或其抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:32的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以由seq id no:31的核酸序列编码。
[0010]
在一个实施方案中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区，所
述轻链可变区包含：包含seq id no:8的氨基酸序列的cdr1区；包含seq id no:10的氨基酸序列的cdr2区；和包含seq id no:12的氨基酸序列的cdr3区。在一个实施方案中，seq id no:8、10和12的氨基酸序列可以分别由seq id no:7、9和11的核酸序列编码。
[0011]
在一个方面，本发明的分离的单克隆抗体(例如人类抗体)或其抗原结合部分包含轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:34的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以由seq id no:33的核酸序列编码。
[0012]
在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含：包含seq id no:32的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:34的氨基酸序列的轻链可变区。
[0013]
在一个实施方案中，本发明的抗体在重链可变区中包含具有seq id no:14、16、18和20的氨基酸序列的四个框架区并且在轻链可变区中包含具有seq id no:22、24、26和28的氨基酸序列的四个框架区。在一个实施方案中，seq id no:14、16、18和20的氨基酸序列可以分别由seq id no:13、15、17和19的核酸序列编码。在一个实施方案中，seq id no:22、24、26和28的氨基酸序列可以分别由seq id no:21、23、25和27的核酸序列编码。
[0014]
在一个实施方案中，本发明的抗体包含具有seq id no:36的氨基酸序列的重链和具有seq id no:38的氨基酸序列的轻链，这两者可以分别由seq id no:35和37的核酸序列编码。在一个实施方案中，本发明的抗体包含各自具有seq id no:36的氨基酸序列的两条重链和各自具有seq id no:38的氨基酸序列的两条轻链。此外，本发明的抗体包含seq id no:30的氨基酸序列，其可以由seq id no.:29的核酸序列编码。
[0015]
在另一个实施方案中，所述抗体刺激抗原特异性t细胞应答，如抗原特异性t细胞应答中的干扰素γ(ifnγ)和/或干扰素-2(il-2)产生。在其它实施方案中，所述抗体刺激免疫应答，如抗肿瘤应答(例如在体内肿瘤移植模型中抑制肿瘤生长)或自身免疫应答(例如nod小鼠中糖尿病的发展)。
[0016]
在另一个实施方案中，所述抗体与人类lag-3的表位结合，从而阻断lag-3与mhc ii类或lsectin(肝和淋巴结窦内皮细胞c型凝集素)的相互作用。
[0017]
本发明的抗体可以是全长抗体，例如igg1、igg2或igg4同种型的全长抗体，任选地在重链恒定区铰链区中(在对应于如angal等(1993)mol.immunol.30:105-108中所述的位置241的位置处)具有丝氨酸
→
脯氨酸突变，从而减少或消除重链间二硫桥的异质性。在一个方面，恒定区同种型是在氨基酸残基220处具有突变，例如s220p的igg4。可选地，所述抗体可以是抗体片段，如fab、fab'或fab'2片段或单链抗体。
[0018]
在本发明的另一个方面，所述抗体或其抗原结合部分是免疫缀合物的一部分，所述免疫缀合物包含与所述抗体连接的治疗剂，例如细胞毒素或放射性同位素。在另一个方面，所述抗体是双特异性分子的一部分，所述双特异性分子包含与所述抗体或其抗原结合部分具有不同的结合特异性的第二功能部分(例如第二抗体)。在另一个方面，所述抗体或其抗原结合部分(例如scfv，参见下文)可以被制成作为过继性t细胞免疫治疗策略的一部分的嵌合抗原受体(car)或工程化t细胞受体(tcr)的一部分。
[0019]
还提供了一种组合物，所述组合物包含本发明的抗体或其抗原结合部分、免疫缀合物或双特异性分子，任选地在药学上可接受的载体中配制。
[0020]
还提供了一种编码本发明的抗体或其抗原结合部分(例如可变区和/或cdr)的核酸分子以及一种包含所述核酸的表达载体和一种包含所述表达载体的宿主细胞。还提供了
一种使用包含所述表达载体的宿主细胞制备抗lag-3抗体的方法，并且所述方法包括以下步骤：(i)使所述抗体在所述宿主细胞中表达；和(ii)从所述宿主细胞中分离所述抗体。
[0021]
在另一个方面，本发明提供了一种使用本发明的抗lag-3抗体在受试者中刺激免疫应答的方法。在一个实施方案中，所述方法包括通过使t细胞与本发明的抗体接触来刺激抗原特异性t细胞应答。在一个优选的实施方案中，刺激抗原特异性t细胞产生干扰素γ(ifnγ)和/或干扰素-2(il-2)。在另一个实施方案中，所述受试者是携带肿瘤的受试者并且刺激针对所述肿瘤的免疫应答。在另一个实施方案中，所述受试者是携带病毒的受试者并且刺激针对所述病毒的免疫应答。
[0022]
在又一个实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分。在又一个实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，所述方法包括施用本发明的组合物、双特异性分子或免疫缀合物。
[0023]
在又一个实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分和至少一种另外的免疫刺激抗体，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗ctla-4抗体，从而在所述受试者中刺激免疫应答，例如以抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。在一个实施方案中，所述另外的免疫刺激抗体是抗pd-1抗体。在另一个实施方案中，所述另外的免疫刺激剂是抗pd-l1抗体。在又一个实施方案中，所述另外的免疫刺激剂是抗ctla-4抗体。在又一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如il-2和/或il-21)或共刺激抗体(例如抗cd137抗体和/或抗gitr抗体)一起施用。所述抗体可以是例如人类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
[0024]
在另一个方面，本发明提供了本发明的抗lag-3抗体和组合物，其用于上述方法中或用于制造用于上述方法中(例如用于治疗)的药物。
[0025]
根据不应当被解释为具有限制性的以下详细描述和实例，本公开的其它特征和优势将是显而易见的。在整个本技术中所引用的所有参考文献、基因库条目、专利和公开的专利申请的内容明确地以引用的方式并入本文。
附图说明
[0026]
图1是示出了pcr扩增和单链fv(scfv)噬菌体展示文库的构建的流程图。
[0027]
图2是示出了在elisa测定中2号、8号、13号抗lag-3抗体和lag3.5对人类lag-3重组蛋白的结合活性的图表。
[0028]
图3是示出了在elisa测定中2号、8号、13号和14号抗lag-3抗体对人类lag-3重组蛋白的结构域1-2的结合活性的图表。
[0029]
图4是示出了2号抗lag-3抗体和lag3.5在jurkat-lag3细胞上的内化的图表。
[0030]
图5是示出了在elisa测定中2号、6号、8号、13号和14号抗lag-3抗体对小鼠lag-3重组蛋白的结合活性的图表。
[0031]
图6是示出了在elisa测定中2号、6号、8号、13号和14号抗lag-3抗体对人类cd4重组蛋白的结合活性的图表。
[0032]
图7是示出了2号、8号抗lag-3抗体和igg对mhc ii类分子与lag-3的相互作用的阻
断作用的图表。
[0033]
图8是示出了2号、6号抗lag-3抗体和igg对lsectin与lag-3的相互作用的阻断作用的图表。
[0034]
图9是示出了2号、8号和13号抗lag-3抗体对激活的人类t细胞的表面上表达的lag-3的结合活性的图表。
[0035]
图10是示出了由与抗pd1抗体、2号抗lag-3抗体或igg4一起培养的人类t细胞释放的il-2水平的图表。
[0036]
图11是示出了由与2号抗lag-3抗体一起培养的人类t细胞释放的ifng的图表。
[0037]
图12是示出了2号抗lag-3抗体和/或抗pd1抗体的抗肿瘤作用的图表。
具体实施方式
[0038]
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了另外的定义。
[0039]
术语“lag-3”指的是淋巴细胞激活基因-3。术语“lag-3”包括变体、同工型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如，在某些情况下，对人类lag-3蛋白具有特异性的抗体可以与来自除人类以外的物种的lag-3蛋白发生交叉反应。在其它实施方案中，对人类lag-3蛋白具有特异性的抗体可以对人类lag-3蛋白具有完全特异性并且不对其它物种或其它类型表现出交叉反应性，或可以与来自某些其它物种而非所有其它物种的lag-3发生交叉反应(例如与猴lag-3发生交叉反应，但是不与小鼠lag-3发生交叉反应)。
[0040]
术语“人类lag-3”指的是人类lag-3序列，如具有基因库登录号np 002277(seq id no:39)的人类lag-3的完整氨基酸序列。术语“小鼠lag-3”指的是小鼠lag-3序列，如具有基因库登录号np_032505的小鼠lag-3的完整氨基酸序列。lag-3在本领域中也被称为例如cd223。人类lag-3序列与基因库登录号np 002277的人类lag-3的不同之处可以在于具有例如保守突变或非保守区域中的突变并且lag-3与基因库登录号np_002277的人类lag-3具有基本上相同的生物功能。例如，人类lag-3的生物功能是在lag-3的细胞外结构域中具有由本公开的抗体特异性结合的表位或人类lag-3的生物功能是与mhc ii类分子结合。
[0041]
术语“免疫应答”指的是例如淋巴细胞、抗原提呈细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用引起对入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或在自身免疫或病理性炎症的情况下，对正常人类细胞或组织的选择性损伤、破坏或从人体内消除。
[0042]“抗原特异性t细胞应答”指的是由t细胞特异性针对的抗原刺激t细胞而引起的t细胞应答。t细胞对抗原特异性刺激的应答的非限制性实例包括增殖和细胞因子产生(例如il-2产生)。
[0043]
如本文所提到的术语“抗体”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。完整抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链。每一条重链包含重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区(在本文中缩写为ch)。重链恒定区包含三个结构域，即c
h1
、c
h2
和c
h3
。每一条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为v
l
)和轻链恒定区(在本文中缩写为c
l
)。轻链恒定区包含一个结构域，即c
l
。vh区和v
l
区可以进一步细分成被称为互补决定区(cdr)的高变区，所述高变区与被称为框架区(fr)的
更保守的区域交替。每一个vh和v
l
由三个cdr和四个fr构成，它们从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
[0044]
如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)指的是抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如lag-3蛋白)特异性结合的能力。已经证实的是，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(i)fab片段，即由v
l
、vh、c
l
和c
h1
结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，即包含在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh结构域和c
h1
结构域组成的fd片段；(iv)由单臂的v
l
结构域和vh结构域组成的fv片段；(v)由两个fc片段组成的bi-fv片段；(vi)由vh结构域组成的dab片段(ward等,(1989)nature341:544-546)；(vii)分离的互补决定区(cdr)；和(viii)纳米抗体，即含有单一可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域v
l
和vh由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，所述合成接头使得它们能够被制成单一蛋白质链，其中所述v
l
区和vh区配对以形成单价分子(被称为单链fv(scfv)；参见例如bird等(1988)science 242:423-426；和huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883)。这些单链抗体也意图被涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用筛选片段。
[0045]
如本文所用的“分离的抗体”意图指的是基本上不含具有不同的抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合lag-3蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除lag-3蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人类lag-3蛋白的分离的抗体可以对其它抗原，如来自其它物种的lag-3蛋白具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
[0046]
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指的是具有单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。
[0047]
如本文所用的术语“人类抗体”意图包括具有可变区的抗体，其中框架区和cdr区这两者都源自于人类生殖系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么所述恒定区也源自于人类生殖系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可以包括并非由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机诱变或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人类抗体”不意图包括其中源自于另一种哺乳动物物种，如小鼠的生殖系的cdr序列已经被移植到人类框架序列上的抗体。
[0048]
术语“人类单克隆抗体”指的是具有可变区的显示出单一结合特异性的抗体，其中框架区和cdr区这两者都源自于人类生殖系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人类单克隆抗体是由杂交瘤产生的，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的从具有包含人类重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人类动物，例如转基因小鼠获得的b细胞。
[0049]
如本文所用的术语“重组人类抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，如(a)从人类免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体；(b)从被转化成表达人类抗体的宿主细胞中，例如从转染瘤中分离的抗体；(c)从重组的组合人类抗体文库中分离的抗体；和(d)通过
涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人类抗体具有其中框架区和cdr区源自于人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，可以对这样的重组人类抗体进行体外诱变(或当使用人类ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)并且因此，重组抗体的v
l
区和vh区的氨基酸序列是这样的序列，虽然所述序列源自于人类生殖系v
l
序列和vh序列并且与之相关，但是所述序列在体内人类抗体生殖系谱库内可能不天然存在。
[0050]
术语“同种型”指的是由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如igm或igg1)。
[0051]
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
[0052]
术语“人类抗体衍生物”指的是人类抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一种药剂或抗体的缀合物。
[0053]
术语“人源化抗体”意图指的是其中源自于另一种哺乳动物物种，如小鼠的生殖系的cdr序列已经被移植到人类框架序列上的抗体。可以在人类框架序列内进行另外的框架区修饰。
[0054]
术语“嵌合抗体”意图指的是其中可变区序列源自于一种物种并且恒定区序列源自于另一种物种的抗体，如其中可变区序列源自于小鼠抗体并且恒定区序列源自于人类抗体的抗体。
[0055]
如本文所用的“与人类lag-3特异性结合”的抗体意图指的是与人类lag-3蛋白(和可能的来自一种或多种非人类物种的lag-3蛋白)结合，但是基本上不与非lag-3蛋白结合的抗体。优选的是，所述抗体以“高亲和力”，即以1
×
10-7
m或更小，更优选地1
×
10-8
m或更小，更优选地5
×
10-9
m或更小，更优选地1
×
10-9
m或更小的kd与人类lag-3蛋白结合。
[0056]
如本文所用的术语“基本上不与蛋白质或细胞结合”意指不与所述蛋白质或细胞结合或不以高亲和力与所述蛋白质或细胞结合，即以1
×
10-6
m或更大，更优选地1
×
10-5
m或更大，更优选地1
×
10-4
m或更大，更优选地1
×
10-3
m或更大，甚至更优选地1
×
10-2
m或更大的kd与所述蛋白质或细胞结合。
[0057]
如本文所用的术语“k
缔合”或“k
a”意图指的是特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用的术语“k
解离”或“k
d”意图指的是特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的术语“k
d”意图指的是解离常数，其是由kd与ka的比率(即kd/ka)获得的并且被表示为摩尔浓度(m)。抗体的kd值可以使用本领域中公认的方法来确定。用于确定抗体的kd的优选方法是通过使用表面等离激元共振，优选地使用生物传感器系统，如biacore
tm
系统。
[0058]
术语igg抗体的“高亲和力”指的是对靶抗原具有1
×
10-6
m或更小，更优选地5
×
10-8
m或更小，甚至更优选地1
×
10-8
m或更小，甚至更优选地5
×
10-9
m或更小并且甚至更优选地1
×
10-9
m或更小的kd的抗体。然而，“高亲和力”结合对于其它抗体同种型可以不同。例如，igm同种型的“高亲和力”结合指的是具有10-6
m或更小，更优选地10-7
m或更小，甚至更优选地10-8
m或更小的kd的抗体。
[0059]
术语“ec
50”也被称为半数最大有效浓度，指的是在指定的暴露时间之后诱导基线与最大值之间的一半响应的抗体浓度。
[0060]
术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖动物和爬
行动物，尽管哺乳动物是优选的，如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛和马。
[0061]
在以下小节中更详细地描述本发明的各个方面。
[0062]
具有有利功能特性的抗lag-3抗体
[0063]
与先前描述的抗lag-3抗体相比，特别是与bms-bms986016相比，本发明的抗体以更好的结合能力与人类lag-3特异性结合。
[0064]
本发明的抗体优选地以1
×
10-9
m或更小的kd，更优选地以5
×
10-10
m或更小的kd与人类lag-3蛋白结合。
[0065]
本发明的抗体优选地以0.2nm或更小的ec
50
与人类lag-3蛋白结合。
[0066]
本发明的抗体与人类lag-3的前两个n末端结构域，即与mhc ii类结合的相同结构域结合。lag-3与mhc ii类的结合可以被本发明的抗体抑制。本发明的抗体还可以阻断lag-3与lsectin的相互作用，所述lsectin是也被称为clec4g(c型凝集素超家族4，成员g)的蛋白质，其被发现当在黑色素瘤细胞上表达时会促进肿瘤进展[f xu等,cancer research.74(13)
·
2014年4月]。
[0067]
另外的功能特性包括与来自其它物种，如食蟹猴和恒河猴的lag-3的交叉反应性。本发明的抗体基本上不与小鼠lag-3结合。优选的是，本发明的抗体以高亲和力与人类lag-3结合。
[0068]
其它功能特性包括抗体刺激免疫应答，如抗原特异性t细胞应答的能力。这可以例如通过评估抗体刺激抗原特异性t细胞应答中白细胞介素-2(il-2)产生的能力来测试。在某些实施方案中，所述抗体与人类lag-3结合并且刺激抗原特异性t细胞应答。在其它实施方案中，所述抗体与人类lag-3结合，但是不刺激抗原特异性t细胞应答。用于评价抗体刺激免疫应答的能力的其它手段包括测试它抑制肿瘤生长的能力，如在体内肿瘤移植模型中抑制肿瘤生长的能力，或刺激自身免疫应答的能力，如在自身免疫模型中促进自身免疫性疾病发展的能力，例如在nod小鼠模型中促进糖尿病发展的能力。本发明的抗体可以抑制肿瘤生长，特别是在与抗pd1抗体一起施用时。
[0069]
本发明的优选抗体是人类单克隆抗体。另外地或可选地，所述抗体可以是例如嵌合或人源化单克隆抗体。
[0070]
单克隆抗lag-3抗体
[0071]
本发明的优选抗体是人类单克隆抗体2号抗lag-3抗体，其如下文和以下实施例中所述在结构上和化学上表征。2号抗lag-3抗体的vh氨基酸序列如seq id no:32中所示。2号抗lag-3抗体的v
l
氨基酸序列如seq id no:34中所示。此外，2号抗lag-3抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别如seq id no:36和seq id no:38中所示，并且2号抗lag-3抗体的全长氨基酸序列如seq id no:30中所示。
[0072]
与人类lag-3结合的其它抗lag-3抗体的vh序列和v
l
序列(或cdr序列)可以与2号抗lag-3抗体的vh序列和v
l
序列(或cdr序列)“混合和匹配”。优选的是，当将vh链和v
l
链(或这些链内的cdr)混合和匹配时，来自特定vh/v
l
配对的vh序列被结构上相似的vh序列置换。同样，优选的是，来自特定vh/v
l
配对的v
l
序列被结构上相似的v
l
序列置换。
[0073]
因此，在一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分包含：
[0074]
(a)包含氨基酸序列seq id no:32的重链可变区(即2号抗lag-3抗体的vh)；和
[0075]
(b)包含氨基酸序列seq id no:34的轻链可变区(即2号抗lag-3抗体的v
l
)或另一
种抗lag3抗体(即不同于2号抗lag-3抗体)的v
l
，其中所述抗体特异性结合人类lag-3。
[0076]
在另一个实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合部分包含：
[0077]
(a)包含氨基酸序列seq id no:32的重链可变区的cdr1区、cdr2区和cdr3区(即2号抗lag-3抗体的cdr序列，分别是seq id no:2、4和6)；和
[0078]
(b)包含氨基酸序列seq id no:34的轻链可变区的cdr1区、cdr2区和cdr3区(即2号抗lag-3抗体的cdr序列，分别是seq id no:8、10和12)或另一种抗lag3抗体(即不同于2号抗lag-3抗体)的cdr，其中所述抗体特异性结合人类lag-3。
[0079]
在又一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包括2号抗lag-3抗体的重链可变cdr2区与结合人类lag-3的其它抗体的cdr，例如来自不同的抗lag-3抗体的重链可变区的cdr1和/或cdr3，和/或来自不同的抗lag-3抗体的轻链可变区的cdr1、cdr2和/或cdr3的组合。
[0080]
此外，在本领域中公知的是，独立于cdr1结构域和/或cdr2结构域，cdr3结构域单独可以决定抗体对同源抗原的结合特异性，并且可以基于共同的cdr3序列可预测地产生具有相同的结合特异性的多种抗体。参见例如klimka等,british j.of cancer 83(2):252-260(2000)；beiboer等,j.mol.biol.296:833-849(2000)；rader等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.95:8910-8915(1998)；barbas等,j.am.chem.soc.116:2161-2162(1994)；barbas等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.92:2529-2533(1995)；ditzel等,j.immunol.157:739-749(1996)；berezov等,biajournal 8:scientific review 8(2001)；igarashi等,j.biochem(东京)117:452-7(1995)；bourgeois等,j.virol 72:807-10(1998)；levi等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:4374-8(1993)；polymenis和stoller,j.immunol.152:5218-5329(1994)；以及xu和davis,immunity 13:37-45(2000)。还参见美国专利号6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献中的每一篇在此以引用的方式整体并入本文。
[0081]
因此，在另一个实施方案中，本发明的抗体包含2号抗lag-3抗体的重链可变区的cdr2(seq id no:4)和至少2号抗lag-3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的cdr3(seq id no:6和/或12)，或另一种lag-3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的cdr3，其中所述抗体能够与人类lag-3特异性结合。这些抗体优选地(a)与2号抗lag-3抗体竞争结合lag-3；(b)保留2号抗lag-3抗体的功能特性；(c)与2号抗lag-3抗体结合相同的表位；和/或(d)与2号抗lag-3抗体具有相似的结合亲和力。在又一个实施方案中，所述抗体还可以包含2号抗lag-3抗体的轻链可变区的cdr2(seq id no:10)，或另一种lag-3抗体的轻链可变区的cdr2，其中所述抗体能够与人类lag-3特异性结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体还可以包括2号抗lag-3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的cdr1(seq id no:2和/或8)，或另一种lag-3抗体的重链可变区和/或轻链可变区的cdr1，其中所述抗体能够与人类lag-3特异性结合。
[0082]
保守修饰
[0083]
在另一个实施方案中，本发明的抗体包含cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列的重链可变区序列和/或轻链可变区序列，它们与2号抗lag-3抗体的那些的不同之处在于一个或多个保守修饰。在本领域中应当了解的是，可以进行某些保守序列修饰，所述修饰不去除抗原结合。参见例如brummell等(1993)biochem 32:1180-8；de wildt等(1997)prot.eng.10:
835-41；komissarov等(1997)j.biol.chem.272:26864-26870；hall等(1992)j.immunol.149:1605-12；kelley和o'connell(1993)biochem.32:6862-35；adib-conquy等(1998)int.immunol.10:341-6；以及beers等(2000)clin.can.res.6:2835-43。
[0084]
因此，在一个实施方案中，所述抗体包含：包含cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列的重链可变区和/或包含cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列的轻链可变区，其中：
[0085]
(a)所述重链可变区cdr1序列包含seq id no:2和/或其保守修饰；和/或
[0086]
(b)所述重链可变区cdr3序列包含seq id no:6和其保守修饰；和/或
[0087]
(c)所述轻链可变区cdr1序列和/或cdr2序列和/或cdr3序列包含seq id no:8和/或seq id no:10和/或seq id no:12和/或其保守修饰；并且
[0088]
(d)所述抗体特异性结合人类lag-3。
[0089]
本发明的抗体具有以下上述功能特性中的一种或多种，如与人类和猴lag-3的高亲和力结合、缺乏与小鼠lag-3的结合、抑制lag-3与mhc ii类或lsectin结合的能力、刺激抗原特异性t细胞应答的能力和/或抑制肿瘤生长的能力。
[0090]
在各种实施方案中，所述抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0091]
如本文所用的术语“保守序列修饰”意图指的是不会显著影响或改变含有所述氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和pcr介导的诱变将修饰引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支化侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的cdr区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自同一侧链家族的其它氨基酸残基置换并且可以使用本文所述的功能测定来测试改变的抗体的保留功能(即上述功能)。
[0092]
工程化和修饰的抗体
[0093]
可以使用具有2号抗lag-3抗体的vh序列/v
l
序列中的一个或多个的抗体作为起始材料来对修饰的抗体进行工程化以制备本发明的抗体。可以通过修饰一个或两个可变区(即vh和/或v
l
)内，例如一个或多个cdr区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来对抗体进行工程化。另外地或可选地，可以通过修饰一个或多个恒定区内的残基来对抗体进行工程化，例如以改变抗体的一种或多种效应功能。
[0094]
在某些实施方案中，可以使用cdr移植来对抗体的可变区进行工程化。抗体主要通过位于六个重链互补决定区和轻链互补决定区(cdr)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于这个原因，在单个抗体之间cdr内的氨基酸序列比cdr之外的序列更具多样性。由于cdr序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此有可能通过构建表达载体来表达模拟特异性的天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上的来自所述特异性的天然存在的抗体的cdr序列(参见例如riechmann等(1998)nature 332:323-327；jones等(1986)nature 321:522-525；queen等(1989)
proc.natl.acad.see.u.s.a.86:10029-10033；美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0095]
因此，本发明的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含分别包含seq id no:2、4、6的cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列；和/或轻链可变区，所述轻链可变区包含分别包含seq id no:8、10、12的cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列。虽然这些抗体含有2号单克隆抗体的vh和v
l cdr序列，但是它们可以含有不同的框架序列。
[0096]
这样的框架序列可以从包括生殖系抗体基因序列的公共dna数据库或公开的参考文献中获得。例如，人类重链和轻链可变区基因的生殖系dna序列可以在“vbase”人类生殖系序列数据库(可在互联网上在www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase处获得)，以及kabat等(1991)(上文所引用)；tomlinson等(1992),“the repertoire of human germline v
h sequences reveals about fifty groups of v
h segments with different hypervariable loops(人类生殖系vh序列的谱库揭示了约五十组具有不同高变环的vh区段)”,j.mol.biol.227:776-798；以及cox等(1994),“a directory of human germ-line v
h segments reveals a strong bias in their usage(人类生殖系vh区段的目录揭示了它们的使用上的强烈偏好性)”,eur.j.immunol.24:827-836中找到，这些文献中的每一篇的内容明确地以引用的方式并入本文。作为另一个实例，人类重链和轻链可变区基因的生殖系dna序列可以在基因库数据库中找到。例如，在hco7 humab小鼠中发现的以下重链生殖系序列可以所附的基因库登录号：1-69(ng__0010109、nt__024637和bc070333)、3-33(ng__0010109和nt__024637)和3-7(ng__0010109和nt__024637)获得。作为另一个实例，在hco12 humab小鼠中发现的以下重链生殖系序列可以所附的基因库登录号：1-69(ng__0010109、nt__024637和bc070333)、5-51(ng__0010109和nt__024637)、4-34(ng__0010109和nt__024637)、3-30.3(caj556644)和3-23(aj406678)获得。
[0097]
使用本领域技术人员公知的被称作gapped blast的序列相似性搜索方法之一，将抗体蛋白质序列与编译的蛋白质序列数据库进行比较(altschul等(1997)(同上))。
[0098]
用于本发明的抗体中的优选的框架序列是与本发明的抗体所使用的框架序列在结构上相似的那些框架序列，例如重链可变区中具有seq id no:14、16、18和20的氨基酸序列的四个框架区和轻链可变区中具有seq id no:22、24、26和28的氨基酸序列的四个框架区。v
h cdr1序列、cdr2序列和cdr3序列可以被移植到具有与作为框架序列的来源的生殖系免疫球蛋白基因中存在的序列相同的序列的框架区上，或cdr序列可以被移植到与生殖系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现在某些情况下，有益的是，使框架区内的残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力(参见例如美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0099]
另一种类型的可变区修饰是使vh和/或v
l cdr1区、cdr2区和/或cdr3区内的氨基酸残基突变，从而改善所关注的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或pcr介导的诱变以引入一个或多个突变并且可以在如本文所述和实施例中所提供的体外或体内测定中评价对抗体结合或所关注的其它功能特性的影响。优选的是，引入保守修饰(如本领域已知)。所述突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但是优选地是取代。此外，通常改变cdr区内不超过1个、2个、3个、4个或5个残基。
[0100]
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗lag-3单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含：(a)包含seq id no:2或与seq id no:2相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的v
h cdr1区；(b)包含seq id no:4或与seq id no:4相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的v
h cdr2区；(c)包含seq id no:6或与seq id no:6相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的v
h cdr3区；(d)包含seq id no:8或与seq id no:8相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的v
l cdr1区；(e)包含seq id no:10或与seq id no:10相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的v
l cdr2区；以及(f)包含seq id no:12或与seq id no:12相比具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的v
l cdr3区。
[0101]
本发明的工程化的抗体包括其中已经对vh和/或v
l
内的框架残基进行修饰，例如以改善抗体的特性的那些抗体。通常，进行这样的框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为相应的生殖系序列。更具体地，已经经历了体细胞突变的抗体可以含有与作为所述抗体的来源的生殖系序列不同的框架残基。这样的残基可以通过将抗体框架序列与作为抗体的来源的生殖系序列进行比较来鉴定。
[0102]
另一种类型的框架修饰涉及使框架区内或甚至一个或多个cdr区内的一个或多个残基突变以去除t细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也被称为“去免疫化”并且更详细地描述于美国专利公布号20030153043中。
[0103]
除了在框架区或cdr区内进行修饰之外或作为在框架区或cdr区内进行修饰的替代方案，可以对本发明的抗体进行工程化以在fc区内包括修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可以对本发明的抗体进行化学修饰(例如可以将一个或多个化学部分连接到所述抗体上)，或对其进行修饰以改变它的糖基化，从而再次改变所述抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案中的每一个更详细地描述于下文中。fc区中残基的编号是kabat的eu索引的编号。
[0104]
在一个优选的实施方案中，所述抗体是igg4同种型抗体，其在重链恒定区的铰链区中对应于如angal等(1993)mol.immunol.30:105-108中所述的位置241的位置处包含丝氨酸
→
脯氨酸突变。据报道，该突变消除了铰链区中重链间二硫桥的异质性(angal等(同上)；位置241是基于kabat编号系统)。
[0105]
在一个实施方案中，对ch1的铰链区进行修饰以使得铰链区中半胱氨酸残基的数量改变，例如增加或减少。这种方法进一步描述于美国专利号5,677,425中。改变ch1的铰链区中半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
[0106]
在另一个实施方案中，使抗体的fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到fc铰链片段的ch2-ch3结构域界面区中以使得相对于天然fc铰链结构域spa结合，所述抗体具有受损的葡萄球菌蛋白a(spa)结合。这种方法更详细地描述于美国专利号6,165,745中。
[0107]
在又一个实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个
氨基酸取代，其引起一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点处的糖基化。这样的无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
[0108]
另外地或可选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少的岩藻糖基残基量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的平分型glcnac结构的抗体。已经证实这样的改变的糖基化谱增加了抗体的adcc能力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如使抗体在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中描述并且可以用作用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系ms704、ms705和ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因fut8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，因此在ms704、ms705和ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺乏岩藻糖。ms704、ms705和ms709 fut8-/-细胞系是通过使用两种置换型载体靶向破坏cho/dg44细胞中的fut8基因而产生的(参见美国专利公布号20040110704和yamane-ohnuki等(2004)biotechnol bioeng 87:614-22)。作为另一个实例，ep 1,176,195描述了一种细胞系，其具有功能性破坏的fut8基因(所述基因编码岩藻糖基转移酶)，因此通过减少或消除α-1,6键相关的酶，在这样的细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。ep 1,176,195还描述了这样的细胞系，所述细胞系具有低的将岩藻糖添加到与抗体的fc区结合的n-乙酰葡糖胺的酶活性或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系yb2/0(atcc crl 1662)。pct公布wo 03/035835描述了一种变体cho细胞系lec13细胞，其具有降低的将岩藻糖连接到asn(297)连接的碳水化合物的能力，从而也引起在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见shields等(2002)j.biol.chem.277:26733-26740)。也可以在鸡蛋中产生具有修饰的糖基化谱的抗体，如pct公布wo 06/089231中所述。可选地，可以在植物细胞，如浮萍中产生具有修饰的糖基化谱的抗体。用于在植物系统中产生抗体的方法公开于2006年8月11日提交的对应于alston&bird llp代理人案卷号040989/314911的美国专利申请中。pct公布wo 99/54342描述了被工程化以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如β(1,4)-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶iii(gntiii))的细胞系，因此在所述工程化的细胞系中表达的抗体表现出增加的平分型glcnac结构，这使得抗体的adcc活性增加(还参见umana等(1999)nat.biotech.17:176-180)。可选地，可以使用岩藻糖苷酶切割掉抗体的岩藻糖残基；例如，岩藻糖苷酶α-l-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基(tarentino等(1975)biochem.14:5516-23)。
[0109]
本公开考虑的对本文中的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体进行聚乙二醇化以例如延长抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体进行聚乙二醇化，通常在其中使一个或多个peg基团连接到抗体或抗体片段上的条件下，使抗体或其片段与聚乙二醇(peg)，如peg的反应性酯或醛衍生物反应。优选的是，经由与反应性peg分子(或类似的反应性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用的术语“聚乙二醇”意图涵盖已经用于衍生化其它蛋白质的peg的形式中的任一种，如单(c1-c10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。用于将蛋白质进行聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的抗体。参见例如epo 154 316和ep 0 401 384。
[0110]
抗体物理特性
[0111]
本发明的抗体可以通过它们的各种物理特性来表征，以检测和/或区分其不同的
类别。
[0112]
例如，抗体可以在轻链可变区或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。这样的糖基化位点由于改变的抗原结合而可能导致抗体的免疫原性增加或抗体的pk改变(marshall等(1972)annu rev biochem 41:673-702；gala和morrison(2004)j immunol 172:5489-94；wallick等(1988)j exp med 168:1099-109；spiro(2002)glycobiology 12:43r-56r；parekh等(1985)nature 316:452-7；mimura等(2000)mol immunol 37:697-706)。已知糖基化在含有n-x-s/t序列的基序处发生。在一些情况下，优选具有不含可变区糖基化的抗lag-3抗体。这可以通过选择在可变区中不含所述糖基化基序的抗体或通过使糖基化区内的残基突变来实现。
[0113]
在一个优选的实施方案中，所述抗体不含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能在n-g或d-g序列上发生并且引起异天冬氨酸残基的产生，这将弯结引入到多肽链中并且降低了它的稳定性(异天冬氨酸作用)。
[0114]
每一种抗体将具有独特的等电点(pi)，其一般落入6至9.5的ph值范围内。igg1抗体的pi值通常落入7-9.5的ph值范围内并且igg4抗体的pi值通常落入6-8的ph值范围内。据推测，具有在正常范围之外的pi值的抗体在体内条件下可能具有一些解折叠和不稳定性。因此，优选具有含有落入正常范围内的pi值的抗lag-3抗体。这可以通过选择具有在正常范围内的pi值的抗体或通过使带电荷的表面残基突变来实现。
[0115]
编码本发明的抗体的核酸分子
[0116]
在另一个方面，本发明提供了编码本发明的抗体的重链和/或轻链可变区或cdr的核酸分子。所述核酸可以全细胞、细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术纯化去除其它细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质时，核酸是“分离的”或“变成基本上纯的”。本发明的核酸可以是例如dna或rna并且可以含有或可以不含内含子序列。在一个优选的实施方案中，所述核酸是cdna分子。
[0117]
本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如如下文进一步描述，从携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cdna可以通过标准的pcr扩增或cdna克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从所述基因文库中回收编码这样的抗体的核酸。
[0118]
本发明的优选的核酸分子包括编码lag-3单克隆抗体的vh和v
l
(分别是seq id no:31和33)或cdr(分别是seq id no:1、3、5、7、9和11)序列的核酸分子。一旦获得了编码vh区段和v
l
区段的dna片段，就可以通过标准重组dna技术进一步操纵这些dna片段，例如以将可变区基因转化成全长抗体链基因、fab片段基因或scfv基因。在这些操纵中，将编码v
l
或vh的dna片段与编码另一种蛋白质，如抗体恒定区或柔性接头的另一个dna片段可操作地连接。如本文中所用的术语“可操作地连接”意图意指将两个dna片段连接以使得由这两个dna片段编码的氨基酸序列保持在框内。
[0119]
可以通过将编码vh的dna与编码重链恒定区(c
h1
、c
h2
和c
h3
)的另一个dna分子可操作地连接来将编码vh区的分离的dna转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat等(1991)(同上))并且涵盖这些区域的dna片段可以通过标准的pcr扩增来获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，
但是最优选地是igg1或igg4恒定区。对于fab片段重链基因，可以将编码vh的dna与仅编码重链ch1恒定区的另一个dna分子可操作地连接。
[0120]
可以通过将编码v
l
的dna与编码轻链恒定区cl的另一个dna分子可操作地连接来将编码v
l
区的分离的dna转化成全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat等(同上))并且涵盖这些区域的dna片段可以通过标准的pcr扩增来获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
[0121]
为了产生scfv基因，将编码vh和v
l
的dna片段与编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(gly
4-ser)3的另一个片段可操作地连接，以使得vh序列和v
l
序列可以被表达为连续的单链蛋白，其中v
l
区和vh区由柔性接头连接(参见例如bird等(1988)science 242:423-426；huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；mccafferty等(1990)nature348:552-554)。
[0122]
本发明的单克隆抗体的制备
[0123]
本发明的单克隆抗体(mab)可以使用kohler和milstein(1975)nature 256:495的公知的体细胞杂交(杂交瘤)技术产生。嵌合抗体或人源化抗体也是本领域公知的。参见例如美国专利号4,816,567；5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370，这些文献的内容具体地以引用的方式整体并入本文。
[0124]
在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是人类单克隆抗体。针对人类lag-3的这样的人类单克隆抗体可以使用携带一部分人类免疫系统而不携带小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称为humab mouse
tm
和km mouse
tm
的小鼠，并且在本文中统称为“人类ig小鼠”。
[0125]
humab mouse
tm
(medarex
tm
公司)含有编码未重排的人类重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)以及使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如lonberg等(1994)nature 368(6474):856-859)。因此，所述小鼠表现出降低的小鼠igm或κ表达，并且响应于免疫接种，引入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人类iggκ单克隆抗体(lonberg等(1994)(同上)；在lonberg(1994)handbook of experimental pharmacology(《实验药理学手册》),113:49-101；lonberg,n.和huszar,d.(1995)intern.rev.immunol.13:65-93；以及harding和lonberg(1995)ann.n.y.acad.sci.764:536-546中综述)。humab mouse
tm
的制备和使用以及这样的小鼠携带的基因组修饰进一步描述于taylor等(1992)nucleic acids research20:6287-6295；chen等(1993)international immunology 5:647-656；tuaillon等(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:3720-3724；choi等(1993)nature genetics 4:117-123；chen等(1993)embo j.12:821-830；tuaillon等(1994)j.immunol.152:2912-2920；taylor等(1994)international immunology 6:579-591；以及fishwild等(1996)nature biotechnology 14:845-851中，所有这些文献的内容在此具体地以引用的方式整体并入本文。还参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,770,429；和5,545,807；pct公布号wo 92/03918；wo 93/12227；wo 94/25585；wo 97/13852；wo 98/24884；wo 99/45962和wo 01/14424，这些文献的内容以引用的方式整体并入本文。
[0126]
在另一个实施方案中，本发明的人类抗体可以使用在转基因和转染色体上携带人
类免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人类重链转基因和人类轻链转染色体的小鼠产生。这种小鼠在本文中被称为“km mouse
tm”，并且详细描述于pct公布wo 02/43478中。还包含内源性fcγriib受体基因的纯合破坏的这种小鼠的修饰形式也在pct公布wo 02/43478中描述并且在本文中被称为“km/fcgr2d小鼠”。此外，可以使用带有hco7或hco12重链转基因或这两者的小鼠。
[0127]
另外的转基因动物实施方案包括xenomouse(abgenix公司，美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963)。另外的实施方案包括“tc小鼠”(tomizuka等(2000)proc.natl.acad.sci.usa 97:722-727)和携带人类重链和轻链转染色体的牛(kuroiwa等(2002)nature biotechnology 20:889-894；pct公布wo 02/092812)。这些专利和出版物的内容具体地以引用的方式整体并入本文。
[0128]
在一个实施方案中，本发明的人类单克隆抗体是使用噬菌体展示方法筛选人类免疫球蛋白基因的文库来制备的。参见例如美国专利号5,223,409；5,403,484；5,571,698；5,427,908；5,580,717；5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；和6,593,081，这些文献的内容以引用的方式整体并入本文。
[0129]
本发明的人类单克隆抗体也可以使用scid小鼠来制备，已经在所述scid小鼠中重建了人类免疫细胞以使得在免疫接种后可以产生人类抗体应答。参见例如美国专利号5,476,996和5,698,767，这些文献的内容以引用的方式整体并入本文。
[0130]
在另一个实施方案中，使用噬菌体展示来制备人类抗lag-3抗体，其中所述噬菌体包含编码在先前接受lag-3免疫接种的转基因动物中产生的抗体的核酸。在一个优选的实施方案中，所述转基因动物是humab、km或kirin小鼠。参见例如美国专利号6,794,132，该文献的内容以引用的方式整体并入本文。
[0131]
人类ig小鼠的免疫接种
[0132]
在本发明的一个实施方案中，用lag-3抗原、重组lag-3蛋白或表达lag-3蛋白的细胞的纯化或富集制剂对人类ig小鼠进行免疫接种。参见例如lonberg等(1994)(同上)；fishwild等(1996)(同上)；pct公布wo 98/24884或wo 01/14424，这些文献的内容以引用的方式整体并入本文。在一个优选的实施方案中，用5μg-50μg的lag-3蛋白对6周-16周大的小鼠进行免疫接种。可选地，使用与非lag-3多肽融合的lag-3的一部分。
[0133]
在一个实施方案中，用于完全弗氏佐剂(freund's adjuvant)中的lag-3抗原对转基因小鼠进行腹膜内(ip)或静脉内(iv)免疫接种，继而用于不完全弗氏佐剂中的抗原进行后续的ip或iv免疫接种。在其它实施方案中，使用除弗氏佐剂以外的佐剂或不存在佐剂的全细胞。可以通过elisa筛选血浆并且可以使用来自具有足够滴度的抗lag-3人类免疫球蛋白的小鼠的细胞进行融合。
[0134]
产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤的产生
[0135]
为了产生会产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自接受免疫接种的小鼠的脾细胞和/或淋巴结细胞并且使其与适当的永生化细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞系融合。可以针对抗原特异性抗体的产生来筛选所得的杂交瘤。杂交瘤的产生是本领域公知的。参见例如harlow和lane(1988)antibodies,a laboratory manual(《抗体：实验室手册》),纽约的冷泉港出版社(cold spring harbor publications,new york)。
[0136]
产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的产生
[0137]
本发明的抗体也可以使用例如本领域公知的重组dna技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(例如morrison,s.(1985)science 229:1202)。在一个实施方案中，将通过标准的分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的dna插入一种或多种表达载体中以使得所述基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在本文中，术语“可操作地连接”意图意指将抗体基因连接到载体中以使得所述载体内的转录和翻译控制序列发挥它们的预期的调控抗体基因的转录和翻译的功能。
[0138]
术语“调控序列”意图包括控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这样的调控序列描述于例如goeddel(gene expression technology(《基因表达技术》)：methods in enzymology(酶学方法)185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(academic press,san diego,calif.)(1990))中。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括引导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，如源自于巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(admlp))和多瘤的启动子和/或增强子。可选地，可以使用非病毒调控序列，如泛素启动子或β-球蛋白启动子。更进一步，调控元件由来自不同来源的序列构成，如srα启动子系统，所述srα启动子系统含有来自sv40早期启动子和1型人类t细胞白血病病毒的长末端重复序列的序列(takebe等(1988)mol.cell.biol.8:466-472)。选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。
[0139]
可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入相同的或单独的表达载体中。在优选的实施方案中，使用可变区以通过将它们插入已经编码所期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使得vh区段与所述载体内的一个或多个ch区段可操作地连接并且v
l
区段与所述载体内的c
l
区段可操作地连接来产生任何抗体同种型的全长抗体基因。另外地或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中以使得信号肽与抗体链基因的氨基末端在框内连接。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0140]
除了抗体链基因和调控序列之外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，如调控载体在宿主细胞中的复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择其中已经引入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216；4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因向其中已经引入了载体的宿主细胞赋予对药物，如g418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(在甲氨蝶呤选择/扩增的情况下用于dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于g418选择)。
[0141]
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的一种或多种表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意图涵盖通常用于将外源性dna引入到原核或真核宿主细胞中的多种技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、deae-葡聚糖转染等。尽管在理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在真核细胞中，并且最优选地在哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，这是因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞比原核细胞更有可能组装和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。
[0142]
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho细胞)(包括dhfr-cho细胞，描述于urlaub和chasin,(1980)proc.natl.acad.sci.usa 77:4216-4220中，与dhfr选择标记一起使用，例如，如r.j.kaufman和p.a.sharp(1982)
j.mol.biol.159:601-621中所述)、nso骨髓瘤细胞、cos细胞和sp2细胞。特别是，对于与nso骨髓瘤细胞一起使用，另一种优选的表达系统是wo 87/04462、wo 89/01036和ep 338,841中所公开的gs基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将所述宿主细胞培养足以允许所述抗体在所述宿主细胞中表达或更优选地，将所述抗体分泌到其中生长了所述宿主细胞的培养基中的时间段来产生所述抗体。可以使用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
[0143]
免疫缀合物
[0144]
本发明的抗体可以与治疗剂缀合以形成免疫缀合物，如抗体-药物缀合物(adc)。合适的治疗剂包括抗代谢物、烷基化剂、dna小沟结合剂、dna嵌入剂、dna交联剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶i或ii抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在adc中，抗体和治疗剂优选地经由可切割的接头，如肽基、二硫化物或腙接头缀合。更优选的是，所述接头是肽基接头，如val-cit、ala-val、val-ala-val、lys-lys、pro-val-gly-val-val、ala-asn-val、val-leu-lys、ala-ala-asn、cit-cit、val-lys、lys、cit、ser或glu。adc可以如以下文献中所述来制备：美国专利号7,087,600；6,989,452；和7,129,261；pct公布wo 02/096910；wo 07/038,658；wo 07/051,081；wo 07/059,404；wo 08/083,312；和wo 08/103,693；美国专利公布20060024317；20060004081；和20060247295，这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。
[0145]
双特异性分子
[0146]
在另一个方面，本公开的特征在于双特异性分子，所述双特异性分子包含与至少一种其它功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(例如另一种抗体或受体的配体)连接的本发明的一种或多种抗体，以产生与至少两个不同的结合位点或靶分子结合的双特异性分子，如与lag-3和tim3，或可选地lag-3和pd1，或lag-3和pd-l1结合的双特异性分子。因此，如本文所用的“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
[0147]
在一个实施方案中，除了抗fc结合特异性和抗lag-3结合特异性之外，双特异性分子还具有第三特异性。所述第三特异性可以针对抗增强因子(ef)，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合，从而增加针对靶细胞的免疫应答的分子。例如，抗增强因子可以结合细胞毒性t细胞(例如经由cd2、cd3、cd8、cd28、cd4、cd40或icam-1)或其它免疫细胞，从而引起针对靶细胞的免疫应答增加。
[0148]
双特异性分子可以具有许多不同的形式和尺寸。在尺寸谱的一端处，双特异性分子保留了传统的抗体形式，不同的是，它不具有具相同特异性的两个结合臂，而是具有各自具有不同特异性的两个结合臂。在另一个极端处是由通过肽链连接的两个单链抗体片段(scfv)组成的双特异性分子，即所谓的bs(scfv)2构建体。中等尺寸的双特异性分子包括通过肽基接头连接的两个不同的f(ab)片段。这些和其它形式的双特异性分子可以通过遗传工程化、体细胞杂交或化学方法来制备。参见例如kufer等(上文引用)；cao和suresh,bioconjugate chemistry,9(6),635-644(1998)；和van spriel等,immunology today,21(8),391-397(2000)以及其中引用的参考文献。
[0149]
药物组合物
[0150]
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的一种或多种抗体。所述组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活
性成分，如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物也可以在与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗的组合疗法中施用，以使抗lag-3抗体增强针对疫苗的免疫应答。
[0151]
所述药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、分散或悬浮助剂、增溶剂、着色剂、调味剂、包衣剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂和其组合。合适的赋形剂的选择和使用在gennaro编著，remington:the science and practice of pharmacy(《雷明顿：药学科学与实践》)，第20版(lippincott williams&wilkins 2003)中教导，其公开内容以引用的方式并入本文。
[0152]
优选的是，所述药物组合物适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据施用途径，活性化合物可以被包被在材料中以保护它防止酸和可能使它失活的其它自然条件的作用。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。可选地，本发明的抗体可以经由非肠胃外途径，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部施用。
[0153]
药物组合物可以呈无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以被配制成微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。
[0154]
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的受试者和特定施用方式而变化，并且一般将是产生治疗作用的组合物的量。一般，在百分之一百中，与药学上可接受的载体组合，该量将在约0.01％至约99％的活性成分，优选地约0.1％至约70％，最优选地约1％至约30％的活性成分的范围内。
[0155]
调整给药方案以提供最佳的所期望的响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间推移施用几次分次剂量或可以按比例减少或增加剂量，如由治疗情况的紧急程度所指示。特别有利的是，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式以易于施用和保持剂量均匀。如本文所用的剂量单位形式指的是适合作为单位剂量用于待治疗的受试者的物理上离散的单位；每一个单位含有被计算以与所需的药物载体联合产生所期望的治疗作用的预定量的活性化合物。可选地，抗体可以作为持续释放制剂施用，在这种情况下，需要不太频繁的施用。
[0156]
对于抗体的施用，剂量在每公斤宿主体重约0.0001mg至100mg，并且更通常每公斤宿主体重0.01mg至5mg的范围内。例如，剂量可以是每公斤体重0.3mg、每公斤体重1mg、每公斤体重3mg、每公斤体重5mg或每公斤体重10mg或在1mg/kg-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月施用一次、每3个月施用一次或每3个月至6个月施用一次。本发明的抗lag-3抗体的优选的给药方案包括每公斤体重1mg或每公斤体重3mg，经由静脉内施用，其中使用以下给药时间表之一给予所述抗体：(i)每四周一次，持续六次剂量，然后每三个月一次；(ii)每三周一次；(iii)以每公斤体重3mg施用一次，继而以每公斤体重1mg每三周施用一次。在一些方法中，调整剂量以达到约1μg/ml-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中，达到约25μg/ml-300μg/ml的血浆抗体浓度。
[0157]“治疗有效剂量”的本发明的抗lag-3抗体优选地引起疾病症状的严重程度降低、
无疾病症状期的频率和持续时间增加或预防由于疾病困扰引起的障碍或残疾。例如，对于治疗携带肿瘤的受试者，相对于未经治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地将肿瘤生长抑制至少约20％，更优选地至少约40％，甚至更优选地至少约60％，并且还更优选地至少约80％。治疗有效量的治疗性化合物可以在受试者中减小肿瘤尺寸或以其它方式改善症状，所述受试者通常是人类或可以是另外的哺乳动物。
[0158]
所述药物组合物可以是受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微封装的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。参见例如sustained and controlled release drug delivery systems(《持续和受控释放药物递送系统》),j.r.robinson编著,纽约的marcel dekker公司(marcel dekker,inc.,new york),1978。
[0159]
治疗组合物可以经由医疗装置施用，如(1)无针皮下注射装置(例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微型输注泵(美国专利号4,487,603)；(3)透皮装置(美国专利号4,486,194)；(4)输注设备(美国专利号4,447,233和4,447,224)；以及(5)渗透装置(美国专利号4,439,196和4,475,196)；这些文献的公开内容以引用的方式并入本文。
[0160]
在某些实施方案中，可以配制本发明的人类单克隆抗体以确保在体内的适当分布。例如，为了确保本发明的治疗性抗体穿过血脑屏障，可以将它们在脂质体中配制，所述脂质体可以另外包含靶向部分以增强向特定细胞或器官的选择性转运。参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29:685；umezawa等,(1988)biochem.biophys.res.commun.153:1038；bloeman等(1995)febs lett.357:140；m.owais等(1995)antimicrob.agents chemother.39:180；briscoe等(1995)am.j.physiol.1233:134；schreier等(1994)j.biol.chem.269:9090；keinanen和laukkanen(1994)febs lett.346:123；以及killion和fidler(1994)immunomethods 4:273。
[0161]
本发明的用途和方法
[0162]
本发明的抗体(组合物、双特异性分子和免疫缀合物)具有许多体外和体内效用，包括例如检测lag-3或通过阻断lag-3来增强免疫应答。在一个优选的实施方案中，所述抗体是人类抗体。这样的抗体可以在体外或离体向培养中的细胞施用，或例如在体内向人类受试者施用，以在多种情况下增强免疫力。因此，在一个方面，本发明提供了一种在受试者中调节免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，以使得调节所述受试者中的免疫应答。优选的是，增强、刺激或上调所述应答。
[0163]
优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。所述方法特别适用于治疗患有可以通过增强免疫应答(例如t细胞介导的免疫应答)来治疗的病症的人类患者。在一个特定的实施方案中，所述方法特别适用于体内治疗癌症。为了实现抗原特异性免疫力增强，可以将抗lag-3抗体与所关注的抗原一起施用或所述抗原可能已经存在于待治疗的受试者(例如携带肿瘤或携带病毒的受试者)体内。当将针对lag-3的抗体与另一种药剂一起施用时，这两者可以按任何一种顺序或同时施用。
[0164]
本发明还提供了用于检测样品中人类lag-3抗原的存在或测量人类lag-3抗原的量的方法，所述方法包括使所述样品和对照样品与特异性结合人类lag-3的人类单克隆抗
体或其抗原结合部分在允许所述抗体或其部分与人类lag-3之间形成复合物的条件下接触。然后检测复合物的形成，其中在所述样品与对照样品之间复合物形成的差异表明在所述样品中存在人类lag-3抗原。此外，本发明的抗lag-3抗体可以用于经由免疫亲和纯化来纯化人类lag-3。
[0165]
鉴于本发明的抗lag-3抗体抑制lag-3与mhc ii类/lsectin结合和刺激抗原特异性t细胞应答的能力，本发明还提供了使用所述抗体刺激、增强或上调抗原特异性t细胞应答的体外和体内方法。例如，本发明提供了一种刺激抗原特异性t细胞应答的方法，所述方法包括使所述t细胞与本发明的抗体接触，从而刺激抗原特异性t细胞应答。可以使用抗原特异性t细胞应答的任何合适的指标来测量抗原特异性t细胞应答。
[0166]
这样的合适的指标的非限制性实例包括在所述抗体存在下t细胞增殖增加和/或在所述抗体存在下细胞因子的产生增加。在一个优选的实施方案中，刺激了抗原特异性t细胞产生白细胞介素-2。
[0167]
本发明还提供了用于在受试者中刺激免疫应答(例如抗原特异性t细胞应答)的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体，从而刺激所述受试者中的免疫应答(例如抗原特异性t细胞应答)。在一个优选的实施方案中，所述受试者是携带肿瘤的受试者并且刺激了针对所述肿瘤的免疫应答。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是携带病毒的受试者并且刺激了针对所述病毒的免疫应答。
[0168]
在另一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体，从而在所述受试者中抑制所述肿瘤的生长。在又一个实施方案中，本发明提供了用于在受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的抗体，从而在所述受试者中治疗所述病毒感染。
[0169]
本发明的这些和其它方法更详细地论述于下文中。
[0170]
癌症
[0171]
抗体对lag-3的阻断可以增强患者对癌细胞的免疫应答。在一个方面，本发明涉及使用抗lag-3抗体在体内治疗受试者，从而抑制癌性肿瘤的生长。抗lag-3抗体可以单独用于抑制癌性肿瘤的生长。可选地，抗lag-3抗体可以与其它免疫原性剂、标准癌症治疗或其它抗体结合使用，如下文所述。
[0172]
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种在受试者中抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的抗lag-3抗体或其抗原结合部分。优选的是，所述抗体是人类抗lag-3抗体(如本文所述的人类抗人类lag-3抗体中的任一种)。另外地或可选地，所述抗体可以是嵌合或人源化的抗lag-3抗体。
[0173]
可以使用本发明的抗体抑制其生长的优选癌症包括通常对免疫治疗有响应的癌症。用于治疗的优选癌症的非限制性实例包括黑色素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。另外，本发明包括可以使用本发明的抗体抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。
[0174]
可以使用本发明的方法治疗的其它癌症的实例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病(hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋
巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病；儿童实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，特别是表达pd-l1的转移性癌症(iwai等(2005)int.immunol.17:133-144)。
[0175]
任选地，针对lag-3的抗体可以与免疫原性剂组合，如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和被编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(he等(2004)j.immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽，如gp100、mage抗原、trp-2、mart1和/或酪氨酸酶的肽，或被转染以表达细胞因子gm-csf的肿瘤细胞(进一步论述于下文中)。
[0176]
在人类中，一些肿瘤已经被证实为具有免疫原性，如黑色素瘤。通过lag-3阻断提高t细胞激活的阈值，可以激活宿主中的肿瘤应答。
[0177]
lag-3阻断在与疫苗接种方案组合时可能更有效。已经设计了针对肿瘤进行疫苗接种的许多实验策略(参见rosenberg,s.,2000,development of cancer vaccines(癌症疫苗的开发),asco educational book spring(《asco教育文集春季版》):60-62；logothetis,c.,2000,asco educational book spring(《asco教育文集春季版》):300-302；khayat,d.2000,asco educational book spring(《asco教育文集春季版》):414-428；foon,k.2000,asco educational book spring(《asco教育文集春季版》):730-738；还参见restifo,n.和sznol,m.,cancer vaccines(癌症疫苗),第61章,第3023-3043页,devita等(编著),1997,cancer:principles and practice of oncology(《癌症：肿瘤学原理与实践》),第五版)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已经证实当将肿瘤细胞进行转导以表达gm-csf时，这些细胞疫苗是最有效的。已经证实gm-csf是用于肿瘤疫苗接种的抗原提呈的有效激活因子(dranoff等(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:3539-43)。
[0178]
对各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达谱的研究已经引起了对所谓的肿瘤特异性抗原的定义(rosenberg,sa(1999)immunity 10:281-7)。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是在肿瘤和产生肿瘤的细胞中表达的分化抗原，例如黑色素细胞抗原gp100、mage抗原和trp-2。更重要的是，这些抗原中有许多可以被证实是在宿主中发现的肿瘤特异性t细胞的靶标。lag-3阻断可以与在肿瘤中表达的重组蛋白和/或肽的集合结合使用以产生针对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白通常被免疫系统视为自身抗原并且因此对它们具有耐受性。肿瘤抗原可以包括蛋白质端粒酶，其为染色体的端粒合成所需并且在超过85％的人类癌症中表达而仅在有限数量的体细胞组织中表达(kim等(1994)science 266:2011-2013)。可以通过各种手段保护这些体细胞组织免受免疫攻击。肿瘤抗原也可以是由于改变蛋白质序列或在两个无关序列之间产生融合蛋白的体细胞突变(即费城染色体中的bcr-abl)而在癌细胞中表达的“新抗原”或来自b细胞肿瘤的独特型。
[0179]
其它肿瘤疫苗可以包括来自牵涉到人类癌症的病毒的蛋白质，如人类乳头瘤病毒(hpv)、肝炎病毒(hbv和hcv)以及卡波西疱疹肉瘤病毒(khsv)。可以与lag-3阻断结合使用
的另一种形式的肿瘤特异性抗原是从肿瘤组织本身中分离的纯化的热激蛋白(hsp)。这些热激蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白质的片段并且这些hsp在向抗原提呈细胞递送以引发肿瘤免疫方面是非常有效的(suot和srivastava(1995)science 269:1585-1588；tamura等(1997)science 278:117-120)。
[0180]
树突状细胞(dc)是可以用于引发抗原特异性应答的有效的抗原提呈细胞。dc可以离体产生并且负载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(nestle等(1998)nature medicine4:328-332)。也可以通过遗传手段将dc进行转导以使其也表达这些肿瘤抗原。为了免疫接种的目的，也已经将dc与肿瘤细胞直接融合(kugler等(2000)nature medicine 6:332-336)。作为疫苗接种的方法，dc免疫接种可以与lag-3阻断有效组合以激活更有效的抗肿瘤应答。
[0181]
lag-3阻断也可以与标准癌症治疗组合。lag-3阻断可以与化疗方案有效组合。在这些情况下，有可能减少所施用的化疗试剂的剂量(mokyr等(1998)cancer research 58:5301-5304)。这样的组合的实例是抗lag-3抗体与氨烯咪胺(decarbazine)组合用于治疗黑色素瘤。这样的组合的另一个实例是抗lag-3抗体与白细胞介素-2(il-2)组合用于治疗黑色素瘤。lag-3阻断和化疗的组合使用的科学依据是，作为大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果的细胞死亡应当引起抗原提呈途径中肿瘤抗原的水平升高。可以通过细胞死亡与lag-3阻断产生协同效应的其它组合治疗是放疗、手术和激素剥夺。这些方案中的每一个都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与lag-3阻断组合。抑制血管生成会引起肿瘤细胞死亡，这可以将肿瘤抗原供给到宿主抗原提呈途径中。
[0182]
lag-3阻断抗体也可以与将表达fcα或fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可以用于靶向两种不同的抗原。例如，抗fc受体/抗肿瘤抗原(例如her-2/neu)双特异性抗体已经被用于将巨噬细胞靶向肿瘤部位。这种靶向可以更有效地激活肿瘤特异性应答。这些应答的t细胞臂将通过使用lag-3阻断来增强。可选地，可以通过使用与肿瘤抗原和树突状细胞特异性细胞表面标志物结合的双特异性抗体来将抗原直接递送到dc。
[0183]
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。这些机制中有许多可以通过使由肿瘤表达并且具有免疫抑制性的蛋白质失活来克服。这些尤其包括tgf-β(kehrl等(1986)j.exp.med.163:1037-1050)、il-10(howard和o'garra(1992)immunology today 13:198-200)和fas配体(hahne等(1996)science 274:1363-1365)。针对这些实体中的每一种的抗体可以与抗lag-3组合使用以抵消免疫抑制因子的作用并且促进宿主的肿瘤免疫应答。
[0184]
激活宿主免疫应答的其它抗体可以与抗lag-3组合使用。这些包括树突状细胞的表面上的激活dc功能和抗原提呈的分子。抗cd40抗体能够有效地替代辅助t细胞活性(ridge等(1998)nature 393:474-478)并且可以与lag-3抗体结合使用(ito等(2000)immunobiology 201(5)527-40)。针对t细胞共刺激分子的激活抗体也可以提供升高水平的t细胞激活，所述t细胞共刺激分子诸如ctla-4(例如美国专利号5,811,097)、ox-40(weinberg等(2000)immunol 164:2160-2169)、4-1bb(melero等(1997)nature medicine 3:682-685(1997))和icos(hutloff等(1999)nature 397:262-266)。
[0185]
骨髓移植目前被用于治疗造血系统起源的多种肿瘤。虽然移植物抗宿主病是这种治疗的后果，但是可以从移植物抗肿瘤应答中获得治疗益处。lag-3阻断可以用于增加供体
植入的肿瘤特异性t细胞的有效性。
[0186]
还有几种实验性治疗方案，其涉及抗原特异性t细胞的离体激活和扩增以及将这些细胞过继转移到受者体内以刺激针对肿瘤的抗原特异性t细胞(greenberg和riddell(1999)science 285:546-51)。这些方法也可以用于激活针对感染因子，如cmv的t细胞应答。在抗lag-3抗体存在下离体激活可以增加过继转移的t细胞的出现率和活性。
[0187]
感染性疾病
[0188]
本发明的其它方法用于治疗已经暴露于特定毒素或病原体的患者。因此，本发明的另一个方面提供了一种在受试者中治疗感染性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗lag-3抗体或其抗原结合部分，从而针对所述感染性疾病对所述受试者进行治疗。优选的是，所述抗体是人类抗人类lag-3抗体(如本文所述的人类抗lag-3抗体中的任一种)。另外地或可选地，所述抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。
[0189]
类似于如上文所述的它对于肿瘤的应用，抗体介导的lag-3阻断可以单独使用，或作为佐剂与疫苗组合使用，以刺激对病原体、毒素和自身抗原的免疫应答。这种治疗方法可以特别有用的病原体的实例包括目前尚无有效疫苗的病原体或常规疫苗不够完全有效对抗的病原体。这些包括但不限于hiv、肝炎(甲型、乙型和丙型)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫(giardia)、疟疾、利什曼虫(leishmania)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)。lag-3阻断对于在感染过程中呈现改变的抗原的诸如hiv的因子的既定感染是特别有用的。在施用抗人类lag-3时，这些新型表位被认为是外来的，从而激发了强烈的t细胞应答，而不会被通过lag-3的负信号所阻抑。
[0190]
引起可由本发明的方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括hiv、肝炎(甲型、乙型或丙型)、疱疹病毒(例如vzv、hsv-1、hav-6、hsv-ii和cmv、爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(epstein barr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、htlv病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、jc病毒和虫媒病毒性脑炎病毒。
[0191]
引起可由本发明的方法治疗的感染的病原性细菌的一些实例包括衣原体(chlamydia)、立克次氏体细菌、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏杆菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉、沙门氏菌(salmonella)、芽孢杆菌(bacilli)、霍乱、破伤风、肉毒杆菌中毒、炭疽、瘟疫、钩端螺旋体病和莱姆病(lymes disease)细菌。
[0192]
引起可由本发明的方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括假丝酵母属(candida)(白色念珠菌(candida albicans)、克鲁斯假丝酵母(candida krusei)、光滑假丝酵母(candida glabrata)、热带假丝酵母(candida tropicalis)等)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、曲霉属(aspergillus)(烟曲霉(aspergillus fumigatus)、黑曲霉(aspergillus niger)等)、毛霉目(mucorales)菌属(毛霉属(mucor)、犁头霉属(absidia)、根霉属(rhizopus))、申克氏孢子丝菌(sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(blastomyces dermatitidis)、巴西副球霉菌(paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢
子菌(coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)。
[0193]
引起可由本发明的方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括溶组织内阿米巴(entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(balantidium coli)、福氏纳格里阿米巴(naegleria fowleri)、棘阿米巴属物种(acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第鞭毛虫(giardia lambia)、隐孢子虫属物种(cryptosporidium sp.)、肺炎肺囊虫(pneumocystis carinii)、间日疟原虫(plasmodium vivax)、田鼠巴贝虫(babesia microti)、布氏锥虫(trypanosoma brucei)、克氏锥虫(trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼虫(leishmania donovani)、刚地弓形虫(toxoplasma gondii)、巴西日圆线虫(nippostrongylus brasiliensis)。
[0194]
在上述所有方法中，lag-3阻断可以与其它形式的免疫治疗组合，如细胞因子治疗(例如干扰素、gm-csf、g-csf、il-2)或双特异性抗体治疗，所述治疗提供了增强的肿瘤抗原提呈(参见例如holliger(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448；poljak(1994)structure 2:1121-1123)。
[0195]
自身免疫反应
[0196]
抗lag-3抗体可以激发并且增强自身免疫应答。确实，使用肿瘤细胞和肽疫苗诱导抗肿瘤应答揭示了许多抗肿瘤应答涉及抗自身反应性(van elsas等(2001)j.exp.med.194:481-489；overwijk等(1999)proc.natl.acad.sci.u.s.a.96:2982-2987；hurwitz,(2000)(同上)；rosenberg和white(1996)j.immunother emphasis tumor immunol 19(1):81-4)。因此，有可能考虑将抗lag-3阻断与各种自身蛋白结合使用以设计疫苗接种方案来有效地产生针对这些自身蛋白的免疫应答以进行疾病治疗。例如，阿尔茨海默氏病(alzheimer'sdisease)涉及脑中淀粉样蛋白沉积物中a
β
肽的不适当积累；针对淀粉样蛋白的抗体应答能够清除这些淀粉样蛋白沉积物(schenk等,(1999)nature 400:173-177)。
[0197]
其它自身蛋白也可以用作靶标，如用于治疗过敏和哮喘的ige和用于类风湿性关节炎的tnfα。最终，可以通过使用抗lag-3抗体来诱导针对各种激素的抗体应答。针对生殖激素的中和抗体应答可以用于避孕。针对为特定肿瘤生长所需的激素和其它可溶性因子的中和抗体应答也可以被认为是可能的疫苗接种靶标。
[0198]
如上文所述的使用抗lag-3抗体的类似方法可以用于诱导治疗性自身免疫应答来治疗具有其它自身抗原的不适当积累的患者，如淀粉样蛋白沉积物，包括阿尔茨海默氏病中的aβ、细胞因子(如tnfα)和ige。
[0199]
疫苗
[0200]
通过将抗lag-3抗体与所关注的抗原(例如疫苗)共同施用，抗lag-3抗体可以用于刺激抗原特异性免疫应答。因此，在另一个方面，本发明提供了一种在受试者中增强对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(i)所述抗原；和(ii)抗lag-3抗体或其抗原结合部分，从而增强所述受试者中对所述抗原的免疫应答。优选的是，所述抗体是人类抗人类lag-3抗体(如本文所述的人类抗lag-3抗体中的任一种)。另外地或可选地，所述抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。所述抗原可以是例如肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。这样的抗原的非限制性实例包括在以上部分中论述的那些，如上述肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)，或来自上述病毒、细菌或其它病原体的抗原。
[0201]
在体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如人类单克隆抗体、多特异性和双特
异性分子以及免疫缀合物)的合适的途径是本领域公知的并且可以由本领域普通技术人员选择。例如，可以通过注射(例如静脉内或皮下)施用抗体组合物。所用的分子的合适剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。
[0202]
如先前所述，本发明的人类抗lag-3抗体可以与一种或多种其它治疗剂共同施用，例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂。所述抗体可以与所述药剂连接(作为免疫复合物)或可以与所述药剂分开施用。在后一种情况(分开施用)下，所述抗体可以在所述药剂之前、之后或同时施用，或可以与其它已知的治疗共同施用，例如抗癌治疗，例如放疗。这样的治疗剂尤其包括抗肿瘤剂，如多柔比星(doxorubicin)(阿霉素(adriamycin))、顺铂(cisplatin)、硫酸博来霉素(bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达卡巴嗪(dacarbazine)和环磷酰胺(cyclophosphamide)、羟基脲(hydroxyurea)，它们本身仅在对患者具有毒性或亚毒性的水平上有效。顺铂以100mg/ml剂量每四周一次静脉内施用并且阿霉素以60mg/ml-75mg/ml剂量每21天一次静脉内施用。将本发明的人类抗lag-3抗体或其抗原结合片段与化疗剂共同施用提供了两种抗癌剂，它们经由不同的机制起作用，从而对人类肿瘤细胞产生细胞毒性作用。这样的共同施用可以解决由于肿瘤细胞对药物产生抗性或抗原性改变而导致它们与抗体无反应所引起的问题。
[0203]
包括本发明的抗体组合物(例如人类抗体、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物)和使用说明书的药盒也在本发明的范围内。所述药盒还可以含有至少一种另外的试剂或本发明的一种或多种另外的人类抗体(例如与lag-3抗原中不同于第一人类抗体的表位结合的具有互补活性的人类抗体)。药盒通常包括标明药盒的内容物的预期用途的标签。术语标签包括在药盒上或与药盒一起提供或以其它方式伴随药盒的任何书面材料或记录材料。
[0204]
组合治疗
[0205]
在另一个方面，本发明提供了组合治疗方法，其中将本发明的抗lag-3抗体(或其抗原结合部分)与有效刺激免疫应答的一种或多种另外的抗体共同施用，从而进一步增强、刺激或上调受试者中的免疫应答。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗lag-3抗体和一种或多种另外的免疫刺激抗体，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗ctla-4抗体，从而在所述受试者中刺激免疫应答，例如以抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。在另一个实施方案中，向所述受试者施用抗lag-3抗体和抗pd-1抗体。在又一个实施方案中，向所述受试者施用抗lag-3抗体和抗pd-l1抗体。在又一个实施方案中，向所述受试者施用抗lag-3抗体和抗ctla-4抗体。在一个实施方案中，所述抗lag-3抗体是人类抗体，如本公开的抗体。可选地，所述抗lag-3抗体可以是例如嵌合抗体或人源化抗体(例如由小鼠抗lag-3mab制备)。在另一个实施方案中，所述至少一种另外的免疫刺激抗体(例如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗ctla-4抗体)是人类抗体。可选地，所述至少一种另外的免疫刺激抗体可以是例如嵌合抗体或人源化抗体(例如由小鼠抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗ctla-4抗体制备)。
[0206]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用lag-3抗体和ctla-4抗体。在另外的实施方案中，以亚治疗剂量施用抗lag-3抗体，以亚治疗剂量施用抗ctla-4抗体，或以亚治疗剂量施用这两者。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相
关的不良事件的方法，所述方法包括向受试者施用抗lag-3抗体和亚治疗剂量的抗ctla-4抗体。在某些实施方案中，所述受试者是人类。在其它实施方案中，所述抗ctla-4抗体是人类序列单克隆抗体10d1(描述于pct公布wo 01/14424中)并且所述抗lag-3抗体是人类序列单克隆抗体，如本文所述的2号抗lag-3抗体。本发明的方法所涵盖的其它抗ctla-4抗体包括例如以下文献中所公开的那些：wo 98/42752；wo 00/37504；美国专利号6,207,156；hurwitz等(1998)proc.natl.acad.sci.usa 95(17):10067-10071；camacho等(2004)j.clin.oncology 22(145):摘要编号2505(抗体cp-675206)；和mokyr等(1998)cancer res.58:5301-5304。在某些实施方案中，所述抗ctla-4抗体以5
×
10-8
m或更小的kd与人类ctla-4结合，以1
×
10-8
m或更小的kd与人类ctla-4结合，以5
×
10-9
m或更小的kd与人类ctla-4结合，或以1
×
10-8
m至1
×
10-10
m或更小的kd与人类ctla-4结合。
[0207]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用lag-3抗体和pd-1抗体。在另外的实施方案中，以亚治疗剂量施用抗lag-3抗体，以亚治疗剂量施用抗pd-1抗体，或以亚治疗剂量施用这两者。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，所述方法包括向受试者施用抗lag-3抗体和亚治疗剂量的抗pd-1抗体。在某些实施方案中，所述受试者是人类。在某些实施方案中，所述抗pd-1抗体是人类序列单克隆抗体并且所述抗lag-3抗体是人类序列单克隆抗体。人类序列抗pd-1抗体的实例包括17d8、2d3、4h1、5c4和4a11，它们描述于pct公布wo 06/121168中。其它抗pd-1抗体包括例如派姆单抗(lambrolizumab)(wo2008/156712)和amp514(wo2010/027423、wo2010/027827、wo2010/027828、wo2010/098788)。在某些实施方案中，所述抗pd-1抗体以5
×
10-8
m或更小的kd与人类pd-1结合，以1
×
10-8
m或更小的kd与人类pd-1结合，以5
×
10-8
m或更小的kd与人类pd-1结合，或以1
×
10-8
m至1
×
10-10
m或更小的kd与人类pd-1结合。
[0208]
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗过度增殖性疾病(例如癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用lag-3抗体和pd-l1抗体。在另外的实施方案中，以亚治疗剂量施用抗lag-3抗体，以亚治疗剂量施用抗pd-l1抗体，或以亚治疗剂量施用这两者。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，所述方法包括向受试者施用抗lag-3抗体和亚治疗剂量的抗pd-l1抗体。在某些实施方案中，所述受试者是人类。在其它实施方案中，所述抗pd-l1抗体是人类序列单克隆抗体并且所述抗lag-3抗体是人类序列单克隆抗体。人类序列抗pd-l1抗体的实例包括3g10、12a4、10a5、5f8、10h10、1b12、7h1、11e6、12b7和13g4，它们描述于pct公布wo 07/005,874中。其它抗pd-l1抗体包括例如mpdl3280a(rg7446)(wo2010/077634)、medi4736(wo2011/066389)和mdx1105(wo2007/005874)。在某些实施方案中，所述抗pd-l1抗体以5
×
10-8
m或更小的kd与人类pd-l1结合，以1
×
10-8
m或更小的kd与人类pd-l1结合，以5
×
10-9
m或更小的kd与人类pd-l1结合，或以1
×
10-8
m至1
×
10-10
m或更小的kd与人类pd-l1结合。
[0209]
通过抗体阻断lag-3和一种或多种第二靶抗原，如ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1可以增强患者对癌细胞的免疫应答。可以使用本公开的抗体抑制其生长的癌症包括通常对免疫治疗有响应的癌症。用本公开的组合治疗进行治疗的癌症的代表性实例包括上文在使用抗lag-3抗体的单一治疗的论述中具体列出的那些癌症。
[0210]
在某些实施方案中，本文论述的治疗性抗体的组合可以作为在药学上可接受的载
体中的单一组合物同时施用，或作为每一种抗体于药学上可接受的载体中的单独的组合物同时施用。在另一个实施方案中，治疗性抗体的组合可以依次施用。例如，可以依次施用抗ctla-4抗体和抗lag-3抗体，如首先施用抗ctla-4抗体，其次施用抗lag-3抗体，或首先施用抗lag-3抗体，其次施用抗ctla-4抗体。另外地或可选地，可以依次施用抗pd-1抗体和抗lag-3抗体，如首先施用抗pd-1抗体，其次施用抗lag-3抗体，或首先施用抗lag-3抗体，其次施用抗pd-1抗体。另外地或可选地，可以依次施用抗pd-l1抗体和抗lag-3抗体，如首先施用抗pd-l1抗体，其次施用抗lag-3抗体，或首先施用抗lag-3抗体，其次施用抗pd-l1抗体。
[0211]
此外，如果依次施用不止一次剂量的组合治疗，那么在每一个施用时间点，依次施用的顺序可以被颠倒或保持相同的顺序，依次施用可以与同时施用组合，或其任何组合。例如，抗ctla-4抗体和抗lag-3抗体的组合的第一次施用可以是同时的，第二次施用可以是依次的，其中首先施用抗ctla-4，其次施用抗lag-3，并且第三次施用可以是依次的，其中首先施用抗lag-3，其次施用抗ctla-4，依此类推。另外地或可选地，抗pd-1抗体和抗lag-3抗体的组合的第一次施用可以是同时的，第二次施用可以是依次的，其中首先施用抗pd-1，其次施用抗lag-3，并且第三次施用可以是依次的，其中首先施用抗lag-3，其次施用抗pd-1，依此类推。另外地或可选地，抗pd-l1抗体和抗lag-3抗体的组合的第一次施用可以是同时的，第二次施用可以是依次的，其中首先施用抗pd-l1，其次施用抗lag-3，并且第三次施用可以是依次的，其中首先施用抗lag-3，其次施用抗pd-l1，依此类推。另一种代表性给药方案可以包括第一次施用，所述第一次施用是依次的，其中首先施用抗lag-3，其次施用抗ctla-4(和/或抗pd-1和/或抗pd-l1)，并且后续的施用可以是同时的。
[0212]
任选地，抗lag-3和一种或多种另外的抗体(例如抗ctla-4抗体和/或抗pd-1抗体和/或抗pd-l1抗体)的组合可以进一步与免疫原性剂组合，如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和被编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(he等(2004)j.immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑色素瘤抗原的肽，如gp100、mage抗原、trp-2、mart1和/或酪氨酸酶的肽，或被转染以表达细胞因子gm-csf的肿瘤细胞(进一步论述于下文中)。组合的lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断可以进一步与疫苗接种方案组合，如上文关于使用抗lag-3抗体的单一治疗详细论述的疫苗接种方案中的任一种。
[0213]
组合的lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断也可以进一步与标准癌症治疗组合。例如，组合的lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断可以与化疗方案有效组合。在这些情况下，有可能减少与本公开的组合一起施用的其它化疗试剂的剂量(mokyr等(1998)cancer research 58:5301-5304)。这样的组合的实例是抗lag-3和抗ctla-4抗体和/或抗pd-1抗体和/或抗pd-l1抗体的组合进一步与氨烯咪胺组合用于治疗黑色素瘤。另一个实例是抗lag-3和抗ctla-4抗体和/或抗pd-1抗体和/或抗pd-l1抗体的组合进一步与白细胞介素-2(il-2)组合用于治疗黑色素瘤。lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断与化疗的组合使用的科学依据是，作为大多数化疗化合物的细胞毒性作用的结果的细胞死亡应当引起抗原提呈途径中肿瘤抗原的水平升高。可以通过细胞死亡与组合的lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断产生协同效应的其它组合治疗包括放疗、手术或激素剥夺。这些方案中的每一个都在宿主中产生肿瘤抗原的来源。血管生成抑制剂也可以与组合的lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断组合。抑制血管生成会引起肿瘤细胞死亡，这可以是向宿
主抗原提呈途径中供给的肿瘤抗原的来源。
[0214]
lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断抗体的组合也可以与将表达fcα或fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可以用于靶向两种不同的抗原。将通过使用组合的lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断来增强这些应答的t细胞臂。
[0215]
在另一个实例中，抗lag-3和抗ctla-4抗体和/或抗pd-1抗体和/或抗pd-l1抗体的组合可以与抗肿瘤抗体结合使用，如rituxan
tm
(利妥昔单抗(rituximab))、herceptin
tm
(曲妥珠单抗(trastuzumab))、bexxar
tm
(托西莫单抗(tositumomab))、zevalin
tm
(异贝莫单抗(ibritumomab))、campath
tm
(阿仑单抗(alemtuzumab))、lymphocide
tm
(依帕妥珠单抗(eprtuzumab))、avastin
tm
(贝伐单抗(bevacizumab))和tarceva
tm
(埃罗替尼(erlotinib))等。举例来说并且不希望受理论所束缚，使用抗癌抗体或与毒素缀合的抗癌抗体进行治疗可以引起癌细胞死亡(例如肿瘤细胞)，这将增强由ctla-4、pd-1、pd-l1或lag-3介导的免疫应答。在一个示例性实施方案中，过度增殖性疾病(例如癌性肿瘤)的治疗可以包括抗癌抗体与抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体的组合，它们同时施用或依次施用或以其任何组合施用，这可以增强宿主的抗肿瘤免疫应答。
[0216]
肿瘤通过多种机制逃避宿主免疫监视。这些机制中有许多可以通过使由肿瘤表达并且具有免疫抑制性的蛋白质失活来克服。这些尤其包括tgf-β(kehrl等(1986)j.exp.med.163:1037-1050)、il-10(howard和o'garra(1992)immunology today 13:198-200)和fas配体(hahne等(1996)science 274:1363-1365)。在另一个实例中，针对这些实体中的每一种的抗体可以进一步与抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体组合结合以抵消免疫抑制因子的作用并且促进宿主的抗肿瘤免疫应答。
[0217]
可以用于激活宿主免疫应答的其它抗体可以进一步与抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体组合结合使用。这些包括树突状细胞的表面上的激活dc功能和抗原提呈的分子。抗cd40抗体(ridge等(同上))可以与抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1组合结合使用(ito等(同上))。针对t细胞共刺激分子的其它激活抗体(weinberg等(同上)；melero等(同上)；hutloff等(同上))也可以提供升高水平的t细胞激活。
[0218]
如上文所述，骨髓移植目前被用于治疗造血系统起源的多种肿瘤。组合的lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断可以用于增加供体植入的肿瘤特异性t细胞的有效性。
[0219]
几种实验性治疗方案涉及抗原特异性t细胞的离体激活和扩增以及将这些细胞过继转移到受者体内以刺激针对肿瘤的抗原特异性t细胞(greenberg和riddell(同上))。这些方法也可以用于激活针对感染因子，如cmv的t细胞应答。在抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体存在下离体激活预期可以增加过继转移的t细胞的出现率和活性。
[0220]
在某些实施方案中，本发明提供了一种用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病(例如癌症)相关的不良事件的方法，所述方法包括向受试者施用抗lag-3抗体和亚治疗剂量的抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体。例如，本发明的方法提供了一种通过向患者施用不可吸收的类固醇来降低免疫刺激治疗性抗体诱发的结肠炎或腹泻的发病率的方法。由于将接受免疫刺激治疗性抗体的任何患者都有发生由这样的抗体诱发的结肠炎或腹泻的风险，因此该整个患者群体适合于根据本发明的方法进行治疗。尽管类固醇已经被施用来治疗炎症性肠病(ibd)并且预防ibd的恶化，但是它们尚未被用于在没有被诊断为患
有ibd的患者中预防ibd(降低ibd的发病率)。与类固醇，甚至是不可吸收的类固醇相关的显著副作用已经阻碍了预防性使用。
[0221]
在另外的实施方案中，lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断(即免疫刺激治疗性抗体抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1抗体和/或抗pd-l1抗体)的组合可以进一步与任何不可吸收的类固醇的使用组合。如本文所用的“不可吸收的类固醇”是糖皮质激素，其表现出广泛的首过代谢，以使得在肝脏中代谢之后，类固醇的生物利用度低，即小于约20％。在本发明的一个实施方案中，所述不可吸收的类固醇是布地奈德(budesonide)。布地奈德是一种局部作用的糖皮质类固醇，其在口服施用后主要由肝脏广泛代谢。entocort ec
tm
(阿斯利康公司(astra-zeneca))是被开发用于优化向回肠和整个结肠的药物递送的布地奈德的ph值和时间依赖性口服制剂。entocort ec
tm
在美国被批准用于治疗累及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩氏病(crohn's disease)。entocort ec
tm
用于治疗克罗恩氏病的常用口服剂量是6毫克/天至9毫克/天。entocort ec
tm
在肠中释放，之后被吸收并且保留在肠粘膜中。一旦它通过肠粘膜靶组织，entocort ec
tm
就会被肝脏中的细胞色素p450系统广泛代谢成具有可忽略不计的糖皮质激素活性的代谢产物。因此，生物利用度低(约10％)。与具有不太广泛的首过代谢的其它糖皮质激素相比，布地奈德的低生物利用度引起了改善的治疗比。与全身作用的皮质类固醇相比，布地奈德引起更少的不良作用，包括更小的下丘脑-垂体抑制。然而，entocort ec
tm
的长期施用可能导致全身性糖皮质激素作用，如肾上腺皮质功能亢进和肾上腺抑制。参见pdr第58版2004；608-610。
[0222]
在另外的实施方案中，与不可吸收的类固醇结合的lag-3和ctla-4和/或pd-1和/或pd-l1阻断(即免疫刺激治疗性抗体抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体)的组合可以进一步与水杨酸盐组合。水杨酸盐包括5-asa剂，例如像：柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)(azulfidine
tm
，法玛西亚普强公司(pharmacia&upjohn))；奥沙拉嗪(olsalazine)(dipentum
tm
，法玛西亚普强公司)；巴柳氮(balsalazide)(colazal
tm
，萨利克斯制药公司(salix pharmaceuticals,inc.))；以及美沙拉嗪(mesalamine)(asacol
tm
，宝洁制药公司(procter&gamble pharmaceuticals)；pentasa
tm
，美国夏尔公司(shire us)；canasa
tm
，axcan scandipharm公司；rowasa
tm
，索尔维公司(solvay))。
[0223]
根据本发明的方法，与抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体和不可吸收的类固醇组合施用的水杨酸盐可以包括水杨酸盐和不可吸收的类固醇的任何重叠或依次施用以实现降低由免疫刺激抗体诱发的结肠炎的发病率的目的。因此，例如，根据本发明的用于降低由免疫刺激抗体诱发的结肠炎的发病率的方法包括同时或依次(例如在不可吸收的类固醇之后6小时施用水杨酸盐)或以其任何组合施用水杨酸盐和不可吸收的类固醇。此外，根据本发明，水杨酸盐和不可吸收的类固醇可以通过相同的途径施用(例如这两者都是口服施用)或通过不同的途径施用(例如口服施用水杨酸盐并且经直肠施用不可吸收的类固醇)，所述途径可以不同于用于施用抗lag-3和抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体的途径。
[0224]
具体实施方案
[0225]
本发明涉及以下具体实施方案：
[0226]
1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，其中所述重链可变区包含：包含seq id no:2的氨基酸序列的cdr1区；包含seq id no:4的氨基酸序列的
cdr2区；和包含seq id no:6的氨基酸序列的cdr3区。
[0227]
2.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:32的氨基酸序列。
[0228]
3.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合部分，其还包含轻链可变区，其中所述轻链可变区包含：包含seq id no:8的氨基酸序列的cdr1区；包含seq id no:10的氨基酸序列的cdr2区；和包含seq id no:12的氨基酸序列的cdr3区。
[0229]
4.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合部分，其还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:34的氨基酸序列。
[0230]
5.根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：包含seq id no:36的氨基酸序列的重链和包含seq id no:38的氨基酸序列的轻链。
[0231]
6.根据实施方案1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含seq id no:30的氨基酸序列。
[0232]
7.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合部分，其表现出以下特性中的一种或组合：(a)与人类lag-3结合；(b)与猴lag-3结合；(c)缺乏与小鼠lag-3的结合；(d)在与组织相容性(mhc)ii类结合的结构域处与lag-3结合；(e)抑制lag-3与主要组织相容性(mhc)ii类分子结合；(f)抑制lag-3与lsectin结合；(g)刺激免疫应答；以及(h)刺激抗原特异性t细胞应答。
[0233]
8.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合部分，其是igg1、igg2或igg4同种型。
[0234]
9.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合部分，其是人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0235]
10.一种组合物，其包含根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
[0236]
11.根据实施方案10所述的组合物，其还包含抗癌剂。
[0237]
12.一种在受试者中治疗肿瘤或病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合部分。
[0238]
13.根据实施方案12所述的方法，其中向所述受试者进一步施用至少一种另外的免疫刺激抗体。
[0239]
14.根据实施方案13所述的方法，其中所述免疫刺激抗体是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体或抗ctla-4抗体。
[0240]
15.根据实施方案12所述的方法，其中向所述受试者进一步施用细胞因子。
[0241]
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述细胞因子是il-2或il-21。
[0242]
17.根据实施方案12所述的方法，其中向所述受试者进一步施用共刺激抗体。
[0243]
18.根据实施方案17所述的方法，其中所述共刺激抗体是抗cd137抗体或抗gitr抗体。
[0244]
通过以下实施例进一步说明本公开，所述实施例不应当被解释为构成进一步的限制。在整个本技术中所引用的所有附图和所有参考文献、基因库序列、专利和公开的专利申请的内容明确地以引用的方式并入本文。特别是，pct公布wo 09/045,957、wo 09/073,533、wo 09/073,546和wo 09/054,863的公开内容明确地以引用的方式并入本文。
[0245]
实施例
[0246]
实施例1：噬菌体淘选和筛选
[0247]
通过克隆轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)的谱库产生了抗体单链噬菌体展示文库，如图1中所示。通过从主要从外周血和新生儿脐带血中收集的人类淋巴细胞进行pcr扩增而产生所述重链谱库和轻链谱库。将vl谱库和vh谱库混合并且使用重叠引物进行pcr。抗体的最终形式是单链fv(scfv)，其中vh片段和vl片段由柔性接头肽(sggstitsynvyytklsssgt(seq id no:40))连接。通过loxp-cre系统进一步扩大主文库。
[0248]
在immuno 96microwell
tm
板(丹麦的nunc公司)上进行对展示特异性scfv片段的噬菌体粒子的选择。首先，在4℃将于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中50μg/ml的lag3重组蛋白(目录号：la3-5222，acrobiosystems公司)包被在板上过夜。在用于pbs(2％ mpbs)中2％(w/v)的奶粉封闭之后，添加含有约10
11
个噬菌体粒子的文库并且将板在室温(rt；25℃-28℃)下孵育2小时。通过用含有0.1％ tween 20的pbs(pbs-t)洗涤10次-20次，继而用pbs洗涤10次-20次来消除未结合的噬菌体。通过与50μl的1μg/μl胰蛋白酶一起孵育10分钟，继而与50μl的50mm盐酸甘氨酸(ph 2.0)一起孵育(在10分钟之后立即用50μl的200mm na2hpo4(ph 7.5)中和)来洗脱结合的噬菌体。使用洗脱的噬菌体，通过在37℃孵育30分钟来感染指数生长的大肠杆菌tg1细胞。将受感染的细胞铺在含有氨苄西林(ampicillin)(100μg/ml)和葡萄糖(1％w/v)的tye板上，然后将该板在37℃孵育过夜。挑选单个噬菌体感染的菌落并且使其在96孔板中生长以产生噬菌粒粒子。使用m13ko7或km13辅助噬菌体拯救培养物。使用拯救的噬菌体粒子以使用相似的条件引发后续轮次的选择。对于lag3蛋白进行了三轮选择。
[0249]
为了在酶联免疫吸附测定(elisa)中测试lag3结合，挑选来自最后一次淘选的单个克隆并且使其在37℃生长并且用m13k07辅助噬菌体拯救。在37℃用于pbs中5％的脱脂乳将扩增的噬菌体制品封闭1小时并且添加到包被有lag3(目录号：la3-5222，acrobiosystems公司)(0.5μg/ml)的96孔微孔板(nunc公司)中。在37℃再孵育1小时之后，将板用pbst洗涤3次并且与小鼠辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗m13噬菌体抗体(阿默舍姆公司(amersham))一起孵育。在仔细洗涤之后，添加3,30,5,50-四甲基联苯胺(tmb，西格玛公司(sigma))作为底物。用thermo multiskan elisa读数器(美国的马萨诸塞州(ma,usa))在450nm测量显色反应。
[0250]
从第三轮筛选中，挑取300个噬菌体并且测试其与人类lag-3的结合，并且发现29个克隆能够与人类lag-3(目录号：la3-5222，acrobiosystems公司)特异性结合。
[0251]
在进一步的测试中确认了，在这29个克隆中16个克隆与人类lag-3特异性结合。将这16个克隆重新编号为克隆1-16并且测序，其中鉴定出5个独特序列，包括2号、6号、8号、13号和14号克隆(即2号、6号、8号、13号和14号抗lag-3抗体)。
[0252]
6号、8号、13号和14号抗lag3抗体的氨基酸序列分别如seq id no.:42、44、46和48所示，其可以分别由seq id no.:41、43、45和47的核酸序列编码。
[0253]
克隆6的氨基酸序列(seq id no:42)
[0254]
qvqlvqsgggvvqpgrslrlpcaasgftfssygmhwvrqapgkglewvaaisyd gsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaregsyylegidywgq gtlvtvss(重链可变区)
[0255]
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskak
gqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(重链恒定区)
[0256]
qsvltqppsvseaprqrvtiscsgsssnigdnavnwyqqlpgkaptlliyyddllpsg vpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeaeyycaawddslkgyvfgtgtkltvlg(轻链可变区)
[0257]
qpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttp skqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs(轻链恒定区)克隆8的氨基酸序列(seq id no:44)
[0258]
qvqlqesgggvvrpggslrlscaasgftfddygmswvrqapgkglewvsginwsggstyyadsvkgrstisrdnskntlylqmnslraedtavyycatggywgqgtlvtvss(重链可变区)
[0259]
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(重链恒定区)
[0260]
syeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkytswyqqkpgqspllviyqstkrpsgiperfsgsnsgdtatltisgtqpmdeadyycqawdsstavfgggtkltvlg(轻链可变区)
[0261]
qpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs(轻链恒定区)克隆13的氨基酸序列(seq id no:46)
[0262]
qvqlqesgggvvrpggslrlscaasgftfddygmswvrqapgkglewvsginwsggstyyadsvkgrstisrdnskntlylqmnslraedtavyycatggywgqgtlvtvss(重链可变区)
[0263]
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(重链恒定区)
[0264]
qsvltqppsvsgapgqrvtisctgsssnigagydvhwyqqlpgtapklliygnsnrpsgvpdrfsgsksgtsaslaitglqaedeadyycqsydsslsvvfgggtkltvlg(轻链可变区)
[0265]
qpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs(轻链恒定区)克隆14的氨基酸序列(seq id no:48)
[0266]
evqlvqsggglvqpgrslrlsctasgftfgdyamhwvrqapgkglewvsgiswnsgsigyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycakfrssswydyfdswgqgtlvtvss(重链可变区)
[0267]
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(重链恒定区)
[0268]
qsvltqppsasgtpgqrvtiscsgsssnigsntvnwyqqlpgtapklliysnnqrpsgvpdrfsgsks
gtsaslaisglqsedeadyycaawddslngwvfgggtkltvlg(轻链可变区)
[0269]
qpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs(轻链恒定区)
[0270]
实施例2：全长抗体的表达和纯化
[0271]
建立了从scfv产生全长人类igg1抗体的方法。将编码抗lag3抗体的vh区和vl区的基因依次插入含有higg1重链恒定区和κ轻链恒定区的基因的表达载体pigg中。为了在哺乳动物细胞中表达可溶性抗体，使用脂质转染胺将重组pigg瞬时转染到人类293t细胞中。将转染的细胞在37℃在293sfm中维持8天。在此期间，更换培养基2次并且收集培养上清液。使用蛋白a亲和色谱法(法玛西亚公司(pharmacia))纯化分泌到培养基中的全长抗体。将纯化的抗体浓缩到1mg/ml，无菌过滤，并且通过sds-page、elisa和等温滴定量热法(itc)进行表征。
[0272]
实施例3：物理和化学分析
[0273]
对于这5个克隆，分别通过还原型sds-page和非还原型sds-page确认了重链和轻链的完整性以及抗体的完整性。
[0274]
在尺寸排阻色谱中进一步测试了2号克隆。具体而言，使用100mm磷酸钠+100mm na2so4(ph 7.0)作为运行缓冲液，将20μg样品注入到tsk g3000swxl柱上。运行时间是30分钟。在agilent 1220hplc上进行所有测量。使用openlab软件分析数据。2号抗lag3抗体的主峰在sec中高于95％，这表明了纯化的抗体具有高纯度和完整性。
[0275]
实施例4：抗lag-3抗体与人类lag-3特异性结合
[0276]
使用elisa测定来确定抗体对重组人类lag-3的相对结合活性。
[0277]
通过在4℃孵育过夜将人类lag-3蛋白(目录号：la3-5222，acrobiosystems公司)固定到96孔板上。然后将所述板通过在37℃与于pbs中1％的bsa一起孵育1小时来封闭。在封闭之后，将所述板用pbst(含有0.05％ tween20的pbs)洗涤3次。在结合缓冲液(含有0.05％ tween20和0.5％ bsa的pbs)中制备连续稀释的抗lag-3抗体(2号、8号、13号克隆和lag3.5(bms-986016，由百时美施贵宝公司开发))并且在37℃将其与固定的蛋白质一起孵育1小时。在结合之后，将所述板用pbst洗涤3次，在37℃与在结合缓冲液中1/15,000稀释的过氧化物酶标记的驴抗人类igg(杰克逊免疫研究公司(jackson immuno research))一起孵育1小时，再次洗涤，用tmb显影并且使用1m h2so4停止。
[0278]
所述克隆与人类lag-3结合的ec
50
和代表性结合曲线示于图2中。
[0279]
结果表明，所有抗体都与人类lag-3特异性结合，其中2号克隆显示出最高的结合能力。
[0280]
实施例5：抗lag-3抗体与人类lag-3的结构域1-2结合
[0281]
使用elisa测定来确定抗体对人类lag-3的结构域1-2的相对结合活性。
[0282]
使重组lag-3结构域1-2(氨基酸1-262，seq id no.:49)与人类igg1 fc结构域融合并且在expicho系统(赛默飞世尔科技公司(thermofisher))中瞬时表达，收获上清液并且通过蛋白a(通用电气医疗公司(ge healthcare))纯化。通过在4℃孵育过夜将重组lag-3结构域1-2固定到96孔板上。然后将所述板通过在37℃与于pbs中1％的bsa一起孵育1小时来封闭。在封闭之后，将所述板用pbst(含有0.05％ tween20的pbs)洗涤3次。在结合缓冲液(含有0.05％ tween20和0.5％ bsa的pbs)中制备连续稀释的抗lag-3抗体(2号、8号、13号
c52a0，acrobiosystems公司)和重组恒河猴lag-3蛋白的动力学结合活性。重组恒河猴lag-3蛋白是通过使xm_001108923.3(seq id no.:50)的氨基酸1-450与人类igg1 fc结构域融合，使所述蛋白质在expicho系统(赛默飞世尔科技公司)中瞬时表达，收集上清液并且通过蛋白a(通用电气医疗公司)纯化所述蛋白质而制备的。
[0298]
使生物素标记的2号抗lag-3抗体和lag3.5与预平衡的链霉亲和素(sa)生物传感器结合。使3.125nm至100nm范围内不同浓度的人类lag-3、食蟹猴lag-3和恒河猴lag-3蛋白与抗体结合。使用octet软件将数据集与1:1结合模型拟合。
[0299]
表2：抗lag-3抗体对重组人类lag-3的亲和力
[0300]
表2汇总了2号抗人类lag3抗体和lag3.5对人类、食蟹猴和恒河猴lag-3蛋白的亲和力。
[0301]
与lag3.5相比，2号抗lag-3抗体具有更低的与人类lag-3结合的kd值。
[0302]
实施例9：抗lag-3抗体不与小鼠lag-3交叉反应
[0303]
使用elisa测定来确定抗体对小鼠lag-3的相对结合活性。
[0304]
通过在4℃孵育过夜将小鼠lag-3(acrobiosystems公司)固定到96孔板上。通过在37℃与于pbs中1％的bsa一起孵育1小时来封闭非特异性结合位点。在封闭之后，将所述板用pbst(含有0.05％ tween20的pbs)洗涤3次。在结合缓冲液(含有0.05％ tween20和0.5％ bsa的pbs)中制备连续稀释的抗lag-3抗体(2号、6号、8号、13号和14号克隆)并且在37℃将其与固定的蛋白质一起孵育1小时。在结合之后，将所述板用pbst洗涤3次，在37℃与在结合缓冲液中1/15,000稀释的过氧化物酶标记的驴抗人类igg(杰克逊免疫研究公司)一起孵育1小时，再次洗涤，用tmb显影并且使用1m h2so4停止。
[0305]
这些克隆结合小鼠lag-3的代表性结合曲线示于图5中。
[0306]
结果表明，没有克隆与小鼠lag-3发生交叉反应。
[0307]
实施例10：抗lag-3抗体不与人类cd4交叉反应
[0308]
由于cd4与mhc ii类分子结合，因此使用elisa测定来确定抗lag-3抗体对人类cd4的相对结合活性。
[0309]
通过在4℃孵育过夜将cd4(义翘神州生物技术有限公司(sino biological))固定到96孔板上。通过在37℃与于pbs中1％的bsa一起孵育1小时来封闭非特异性结合位点。在封闭之后，将所述板用pbst(含有0.05％ tween20的pbs)洗涤3次。在结合缓冲液(含有0.05％ tween20和0.5％ bsa的pbs)中制备连续稀释的抗lag-3抗体(2号、6号、8号、13号和14号克隆)并且在37℃将其与固定的蛋白质一起孵育1小时。在结合之后，将所述板用pbst洗涤3次，在37℃与在结合缓冲液中1/15,000稀释的过氧化物酶标记的驴抗人类igg(杰克
逊免疫研究公司)一起孵育1小时，再次洗涤，并且用tmb显影并且使用1mh2so4停止。
[0310]
克隆结合人类cd4的代表性结合曲线示于图6中。
[0311]
结果表明，这些克隆不与人类cd4结合。
[0312]
实施例11：抗lag-3抗体阻断mhc ii类与lag-3的相互作用
[0313]
为了评估抗lag-3抗体抑制人类lag-3与mhc ii类分子结合的能力，进行了体外结合测定，其中使包含与小鼠fc融合的人类lag-3细胞外结构域的lag-3融合蛋白(义翘神州生物技术有限公司，hlag-3-mfc)与表达人类mhc ii类分子的daudi细胞反应。
[0314]
为了在该测定中测试抗体抑制，将抗lag3抗体(2号和8号克隆)在含有0.5％ bsa的pbs缓冲液中连续稀释并且向这些连续稀释液中分别添加hlag-3-mfc融合蛋白。将该混合物在室温下孵育20分钟，然后施加到2
×
105个daudi细胞中。将所得的混合物在4℃孵育30分钟。使细胞沉淀(3分钟，400
×
g)，使用含有0.5％ bsa的pbs缓冲液洗涤一次并且重新沉淀。使用r-pe缀合的affinipure山羊抗人类igg(fcγ片段特异性)(杰克逊免疫研究公司)二级试剂检测hlag-3-mfc与daudi细胞的结合。之后，如上文所述将细胞洗涤两次，并且重悬在pbs缓冲液中。使用bd accuri c5流式细胞仪(碧迪生物科技公司)进行lag-3-mfc结合的分析。
[0315]
阻断mhc ii类和lag-3的相互作用的ic
50
值和代表性曲线示于图7中。
[0316]
可以看出的是，这些克隆阻断了mhc ii类分子与lag-3之间的相互作用，其中2号克隆显示出更好的作用。
[0317]
实施例12：抗lag-3抗体阻断lag-3与lsectin的相互作用
[0318]
为了评估抗lag-3抗体抑制人类lag-3与人类lsectin结合的能力，进行了elisa阻断测定。
[0319]
通过在4℃孵育过夜将人类lag-3(acrobiosystems公司)固定到96孔板上。通过在37℃与于pbs中1％的bsa一起孵育1小时来封闭非特异性结合位点。在封闭之后，将所述板用pbst(含有0.05％ tween20的pbs)洗涤3次。在结合缓冲液(含有0.05％ tween20和0.5％ bsa的pbs)中制备连续稀释的抗lag-3抗体和人类igg对照并且将其与生物素标记的lsectin(acrobiosystems公司)混合，在37℃添加到板中，持续1小时。在结合之后，将所述板用pbst洗涤3次，在室温下与链霉亲和素-hrp(r&d系统公司(r&dsystems))一起孵育30分钟。之后，将所述板再次洗涤，用tmb显影并且用1m h2so4停止。
[0320]
测定了在450nm-620nm的吸光度。这些抗体的代表性结合曲线示于图8中。
[0321]
结果表明，2号抗lag-3抗体阻断了人类lag-3与lsectin之间的相互作用。
[0322]
实施例13：抗lag-3抗体与人类t细胞表达的细胞表面lag-3结合
[0323]
测试了抗lag3抗体(2号、8号、13号克隆)与激活的人类t细胞上表达的人类lag-3结合的能力。
[0324]
使用磁珠从外周血单核细胞中分离原代t细胞并且将其培养在包被有抗cd3抗体(okt3，biolegend公司)的组织培养板中。将抗lag-3抗体(2号、8号、13号克隆)和阴性对照igg4添加到细胞中并且将混合物在4℃孵育30分钟。将细胞洗涤两次。使用r-pe缀合的affinipure山羊抗人类igg(fcγ片段特异性)(杰克逊免疫研究公司)二级试剂，通过将混合物在4℃孵育30分钟，继而洗涤两次来检测抗lag-3抗体对t细胞上表达的lag-3的结合活性。然后，将细胞重悬在pbs缓冲液中。使用bd accuri c5流式细胞仪(碧迪生物科技公司)
进行lag-3结合的分析。
[0325]
这些克隆与人类t细胞表达的lag-3结合的代表性曲线示于图9中。
[0326]
实施例14：抗lag-3抗体诱导人类t细胞释放il-2
[0327]
使用由超抗原seb刺激的人类pbmc培养物，与抗pd1抗体(纳武单抗(nivolumab)，百时美施贵宝公司)和igg4(biolegend公司)相比，评估了抗lag3抗体(2号克隆)对原代t细胞的功能活性。
[0328]
使用seb将来自健康供体的人类pbmc刺激24小时。将2号抗lag3抗体、抗pd1抗体和igg4分别添加到培养基中。在3天之后通过elisa检测上清液中的il2水平。
[0329]
il2水平示于图10中。
[0330]
实施例15：抗lag-3抗体以剂量依赖性方式诱导人类t细胞释放ifng
[0331]
使用人类pbmc评估了2号抗lag3抗体对原代t细胞的功能活性。将来自健康供体的人类pbmc在包被有抗cd3抗体(okt3，biolegend公司)的组织培养板中培养24小时。将2号抗lag3抗体连续稀释并且添加到培养基中。在3天之后通过elisa检测上清液中的ifng。
[0332]
pbmc释放的ifng水平示于图11中。
[0333]
实施例16：抗lag-3抗体在食蟹猴中的药物代谢动力学
[0334]
评价了2号抗lag3抗体在食蟹猴中的药物代谢动力学特征。在该研究中涉及动物的护理和使用的程序获得了审核和批准。使用了中国起源的四只首次接受实验的食蟹猴。在该研究中，以3mg/kg或10mg/kg的剂量向动物静脉内注射2号抗lag3抗体。在0小时至672小时(0天-28天)之间的各个时间点获得血液样品。将所有样品处理成血浆，在-70℃至-86℃冷冻储存直到分析为止。测定血清中存在的2号抗lag3抗体的浓度。
[0335]
表3示出了如上确定的药物代谢动力学特性。
[0336]
表3：2号抗lag3抗体的药物代谢动力学特性的汇总
[0337][0338]
auc
最后
(从t＝0到时间t时最后可测量血浆药物浓度的血浆水平时间曲线下面积)；auc
inf_obs
(0-∞的浓度-时间曲线下面积)；vz_
obs
(分布容积)；cl_
obs
(清除率)。
[0339]
实施例17：抗lag3抗体针对mc38-ova肿瘤的体内功效
[0340]
在mc38-ova肿瘤模型中研究了单独的抗lag3抗体或抗lag3抗体与抗小鼠pd-1抗体的组合的体内功效。
[0341]
对于本文的实验，表达人类lag3的细胞外部分的人源化小鼠b6.129-lag3
tm1(hlag3)smoc
购自上海模式生物公司(shanghai model organism)。
[0342]
在第0天向50只b6.129-lag3
tm1(hlag3)smoc
小鼠皮下植入5
×
105个mc38-ova细胞并且将其随机分为五个处理组，即pbs组(n＝8)以及igg4同种型对照处理组、2号lag3处理组、抗mpd1(大鼠igg2a抗小鼠pd-1抗体，克隆rpmi-14，bioxcell公司，目录号：be0089)处理组和2号lag3+抗mpd1组合处理组(各自n＝10)。在第3天、第7天、第10天、第14天和第17天，通过腹膜内注射向小鼠施用2号lag3(10mg/kg)、抗mpd1(10mg/kg)、同种型对照抗体(20mg/kg)或2号lag3(10mg/kg)+抗mpd1(10mg/kg)。在实验期间(20天)每周两次通过卡尺测量来监测肿瘤体积。
[0343]
与pbs或igg4同种型对照组相比，2号抗lag3抗体和抗mpd1单一治疗产生了肿瘤生长抑制作用，并且2号抗lag3抗体和抗mpd1的组合产生了提高的功效，包括肿瘤生长减少，如图12中所示。

技术特征：
1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗肿瘤或病毒感染的药物中的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含cdr1区、cdr2区和cdr3区，其中所述cdr1区由seq id no:2所示的氨基酸序列组成，cdr2区由seq id no:4所示的氨基酸序列组成，且cdr3区由seq id no:6所示的氨基酸序列组成；所述轻链可变区包含cdr1区、cdr2区和cdr3区，其中所述cdr1区由seq id no:8所示的氨基酸序列组成，cdr2区由seq id no:10所示的氨基酸序列组成且cdr3区由seq id no:12所示的氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述重链可变区包含seq id no:32的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述轻链可变区包含seq id no:34的氨基酸序列。4.根据权利要求2所述的用途，其中所述轻链可变区包含seq id no:34的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的用途，其包含重链，所述重链含有所述重链可变区，所述重链包含seq id no:36的氨基酸序列。6.根据权利要求1所述的用途，其包含轻链，所述轻链含有所述轻链可变区，所述轻链包含seq id no:38的氨基酸序列。7.根据权利要求5所述的用途，其包含轻链，所述轻链含有所述轻链可变区，所述轻链包含seq id no:38的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的用途，其表现出以下特性中的一种或组合：(a)与人类lag-3结合；(b)与猴lag-3结合；(c)不与小鼠lag-3结合；(d)在lag-3的与组织相容性(mhc)ii类结合的结构域处与lag-3结合；(e)抑制lag-3与主要组织相容性(mhc)ii类分子结合；(f)抑制lag-3与lsectin结合；(g)刺激免疫应答；以及(h)刺激抗原特异性t细胞应答。9.根据权利要求1所述的用途，其是igg1、igg2或igg4型。10.根据权利要求1所述的用途，其是人抗体或嵌合抗体。11.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述肿瘤选自黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌。12.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述药物还包含抗癌剂。13.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述药物与抗癌剂在组合疗法中施用。14.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述药物还包含至少一种另外的免疫刺激抗体。15.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述药物与另一种免疫刺激抗体在组合疗法中施用。16.根据权利要求14或15所述的用途，其中所述免疫刺激抗体是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体或抗ctla-4抗体。17.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述药物还包含细胞因子。18.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述药物与细胞因子在组合疗法中施用。19.根据权利要求17或18所述的用途，其中所述细胞因子是il-2或il-21。20.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述药物还包含共刺激抗体。21.根据权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述药物与共刺激抗体在组合疗法
中施用。22.根据权利要求20或21所述的用途，其中所述共刺激抗体是抗cd137抗体或抗gitr抗体。

技术总结
本发明提供了一种特异性结合LAG-3的分离的单克隆抗体。还提供了编码所述抗体的核酸分子、用于表达所述抗体的表达载体、宿主细胞和方法。本发明还提供了包含所述抗体的免疫缀合物、双特异性分子和药物组合物，以及使用本发明的抗LAG-3抗体的诊断和治疗方法。3抗体的诊断和治疗方法。


技术研发人员：康小强 赖寿鹏 黄潇
受保护的技术使用者：南京维立志博生物科技有限公司
技术研发日：2018.07.12
技术公布日：2023/8/6