吡格列酮及其盐在制备用于治疗系统性红斑狼疮的产品中的应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及噻唑烷二酮类——选择性pparγ(peroxisome proliferator-activated receptor)激动剂吡格列酮的药物新用途，特别是吡格列酮及其盐在制备用于治疗系统性红斑狼疮的产品中的应用。


背景技术：

2.系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,sle)是一种复杂的自身免疫性疾病，临床表现多样，以i型干扰素(interferon,ifn)和自身抗体的过度产生为特征。sle的发病机制尚不明确，遗传易感性、环境诱因和激素水平三者相互作用，共同促进了疾病的发生发展。近年来世界范围内sle的发病率呈上升趋势，全球患病率为43.7/10万人，严重危害人类健康甚至威胁生命。
3.sle好发于育龄期女性，主要治疗手段为糖皮质激素和免疫抑制剂，大多数患者病情可处于稳定或低活动状态，但是尚不能彻底治愈，同时存在部分对药物低反应性、无应答及长期服用药物副作用大的问题。因此，关于sle的治疗一直是研究的重点与难点。
4.吡格列酮(pioglitazone)作为一种选择性pparγ(peroxisome proliferator-activated receptor)激动剂，能高亲和力的结合到pparγ配体结合域，激活后的pparγ与视黄醇类x受体形成异二聚体，异二聚体结合靶基因启动子dna进而调节靶基因的表达产生生物效应。吡格列酮用于2型糖尿病的临床治疗，并被证实可以缓解非酒精性脂肪肝及恢复湿疹患者皮肤屏障功能。此外，研究和临床试验表明，吡格列酮可以改善sle小鼠和患者的血管和代谢功能障碍，但尚未阐明吡格列酮对sle病情本身的影响。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对传统sle治疗药物副作用大的问题，提供吡格列酮药物在治疗sle上的新用途，为sle的治疗提供实验基础和新的治疗手段。
6.本发明首次提出了吡格列酮及其盐在制备用于治疗系统性红斑狼疮的产品中的应用。具体地，本发明所述的系统性红斑狼疮是以免疫紊乱及大量自身抗体产生为主要特点的自身免疫性疾病，区别于其他类型的红斑狼疮。
7.使用吡格列酮及其盐进行sle模型小鼠外用治疗，发现外用吡格列酮可以显著降低小鼠外周血anti-dsdna、ana及尿蛋白的含量，减少自身抗体的生成。皮肤组织病理染色显示炎症细胞浸润及组织损伤较未用药物组明显减少，肾脏和皮肤免疫荧光显示肾小球和基底膜带igg沉积明显减少。实验结果表明，吡格列酮可减少自身抗体的生成，保护肾脏，发挥sle的治疗效果。
8.其中，在应用时，吡格列酮及其盐作为治疗系统性红斑狼疮的药物的活性成分。
9.具体地，所述产品为药品和保健品。
10.本发明进一步提出了一种药物组合物在制备用于治疗系统性红斑狼疮的产品中
的应用，所述组合物包含吡格列酮或其盐。
11.进一步地，所述药物组合物包含药学上可接受的载体或辅料。
12.其中，所述产品为药品和保健品。
13.优选地，所述药物组合物选自如下的剂型：溶液、凝胶、膏剂、糊剂、粉剂、片剂、注射液、胶囊或口服液，其中，溶液是外用涂抹在皮损处的药物溶液。
14.上述药物组合物可以用已知的方法配置，使用如下途径对受试者施用，包括但不限于：肠胃外、经口、局部、皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、静脉等。
15.优选地，所述药物组合物为盐酸吡格列酮溶液。
16.有益效果：目前sle的主要治疗手段为糖皮质激素和免疫抑制剂，大多数患者病情可处于稳定或低活动状态，但是尚不能彻底治愈，同时存在部分对药物低反应性、无应答及长期服用药物副作用大的问题。吡格列酮作为临床治疗糖尿病的老药，毒副作用小。本发明首次研究表明吡格列酮在治疗sle上具有一定的潜力，且吡格列酮这一老药新用能够大大缩短研发成本和研发风险。本发明首次探究吡格列酮治疗系统性红斑狼疮的效用，为系统性红斑狼疮的治疗提供实验基础。
附图说明
17.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
18.图1为局部外用吡格列酮来治疗小鼠sle，其中，a图所示为吡格列酮可缓解sle小鼠皮损严重程度；b图所示为吡格列酮可降低sle小鼠尿蛋白、外周血anti-dsdna及ana含量；c图所示为吡格列酮可缓解sle小鼠皮肤病理损伤；d图所示为吡格列酮可减少sle小鼠肾脏肾小球和皮肤基底膜带igg免疫复合物沉积。具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主体范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普遍技术知识和惯用方法，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围。
20.实施例局部外用吡格列酮来治疗小鼠sle。
21.1.实验材料
22.1.1实验用药物及试剂：盐酸吡格列酮(medchemexpress)，dmso(sigma-aldrich)，他莫昔芬(sigma-aldrich)，玉米油(beyotime)，蛋白尿检测试纸(优利特)，尿蛋白定量试剂盒(nanjing jiancheng bioengineering institute)，抗核抗体及抗双链dna抗体elisa试剂盒(cusabio)，4％多聚甲醛(biosharp)，oct包埋剂(sakura)，山羊抗鼠igg-fitc(abcam)。
23.1.2实验用动物
24.本实验所用小鼠为krt5-creert2+/-pparγflox/flox-/-sle小鼠。小鼠周龄约6-12周，体重20-30g，由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。
25.具体地，krt5-creert2+/-pparγflox/flox-/-sle小鼠通过如下方法构建得到：
26.(1)krt5-creert2+/-pparγflox/flox-/-小鼠的制备：用krt5-creert2小鼠与含有loxp侧翼序列的pparγflox/flox小鼠交配，生成基因型为krt5-creert2+/-pparγflox/flox+/-及krt5-creert2+/-pparγflox/flox-/-的后代小鼠，保留pparγflox/flox
+/-krt5-creert2+/-小鼠，将杂合子小鼠相互交配繁育得到基因型为pparγflox/flox-/-krt5-creert2+/-的小鼠；其中，pparγflox/flox及krt5-creert2小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。krt5-creert2小鼠通过krt5基因座的内源性启动子/增强子元件，能在角质形成细胞内定向表达creert2融合蛋白。creert2融合蛋白由雌激素受体(estrogen receptor，er)的配体结合区突变体(ert)与cre重组酶蛋白组成。pparγflox/flox小鼠即pparγ条件性敲除小鼠，该小鼠pparγ基因特定外显子的两端被插入了loxp位点，而loxp位点可以被活性的cre重组酶切割。
27.(2)特异性敲除角质形成细胞pparγ：将50mg 4-羟基他莫昔芬混于1mldmso中，加入9ml玉米油，使用涡旋器彻底混合悬浮液，并在37℃的超声波浴中超声处理20分钟，配成待用的4-羟基他莫昔芬溶液(5mg/ml)。然后对krt5-creert2+/-pparγflox/flox-/-小鼠双耳涂抹50ul 5mg/ml 4-羟基他莫昔芬的溶液，连续双耳涂抹对应溶液5天，观察小鼠表型，得到krt5-creert2+/-pparγflox/flox-/-sle小鼠。
28.每周观察小鼠皮损，相机拍照留存。定时取小鼠清洁中段尿，使用优利特蛋白尿检测试纸检测尿蛋白。使用cbb法定量小鼠尿蛋白含量。使用elisa试剂盒(cusabio)检测外周血血清抗核抗体及抗双链dna抗体含量。
29.第17天，小鼠麻醉后颈椎脱臼处死。用锋利手术刀和眼科剪取上述三组小鼠同一时间同一部位的双耳皮肤，约0.5厘米
×
0.5厘米，摊平于锡箔纸上，液氮速冻或固定于4％多聚甲醛。固定后进行脱水、浸蜡、包埋。将组织块切片后，进行摊片、烘片、脱蜡、苏木精和伊红染色，封片后用显微镜选取视野拍照，分析小鼠皮损中炎症细胞浸润。
30.将液氮速冻后的皮肤组织或肾脏用oct包埋后，置于冰冻切片模具上，用冰冻切片机切片后，洗去oct，免疫荧光封闭液(beyotime)37℃封闭1小时后加入山羊抗鼠igg-fitc(1:200)4℃过夜孵育，pbs清洗后用dapi工作液室温染细胞核10分钟，pbs清洗后封片，用荧光显微镜成像观察皮肤及肾小球igg沉积。
31.结果表明，上述构建的krt5-creert2+/-pparγflox/flox-/-sle小鼠在激活局部角质形成细胞中的pparγ基因敲除后，会高效、稳定、自发地出现免疫细胞紊乱、炎性皮损及脱毛、蛋白尿、外周血dsdna及ana自身抗体的明显升高，皮肤基底膜带及肾小球igg沉积等sle样表型。
32.饲养条件：室温18-20℃，湿度50-60％，明暗交替(12h)，光度适度，通风洁净良好。所有实验均获得批准，并按照中国医学科学院皮肤病医院(中国医学科学院皮肤病研究所)伦理委员会的指引进行。
33.2.实验方法
34.2.1小鼠给药
35.根据需求对sle小鼠进行分组：对照组(玉米油+dmso)、盐酸吡格列酮组，每组5-8只。将120mg盐酸吡格列酮混于1ml dmso中，加入9ml玉米油，使用涡旋器彻底混合悬浮液，并在37℃的超声波浴中超声处理20分钟，配成待用的盐酸吡格列酮溶液(12mg/ml)。对照组双耳涂抹含有10％dmso的玉米油，盐酸吡格列酮组双耳涂抹50ul 12mg/ml盐酸吡格列酮溶液。两组小鼠每天双耳涂抹对应溶液1次。
36.2.2小鼠皮损、尿蛋白及自身抗体监测
37.每周观察小鼠皮损，相机拍照留存。定时取小鼠清洁中段尿，使用优利特蛋白尿检
测试纸检测尿蛋白。使用cbb法定量小鼠尿蛋白含量。使用elisa试剂盒(cusabio)检测外周血血清抗核抗体及抗双链dna抗体含量。
38.2.3组织病理
39.第18天，小鼠麻醉后颈椎脱臼处死。用锋利手术刀和眼科剪取上述三组小鼠同一时间同一部位的双耳皮肤，约0.5厘米
×
0.5厘米，摊平于锡箔纸上，液氮速冻或固定于4％多聚甲醛。固定后进行脱水、浸蜡、包埋。将组织块切片后，进行摊片、烘片、脱蜡、苏木精和伊红染色，封片后用显微镜选取视野拍照，分析小鼠皮损中炎症细胞浸润。
40.2.4免疫荧光染色
41.将液氮速冻后的皮肤组织或肾脏用oct包埋后，置于冰冻切片模具上，用冰冻切片机切片后，洗去oct，免疫荧光封闭液(beyotime)37℃封闭1小时后加入山羊抗鼠igg-fitc(1:200)4℃过夜孵育，pbs清洗后用dapi工作液室温染细胞核10分钟，pbs清洗后封片，用荧光显微镜成像观察皮肤及肾小球igg沉积。
42.3.实验结果
43.图1a吡格列酮可缓解sle小鼠皮肤损伤严重程度。治疗第18天小鼠照片，对照组小鼠可见明显脱毛及炎性皮损，上覆鳞屑，吡格列酮组小鼠脱毛较少，皮损减轻。说明吡格列酮可缓解sle小鼠的皮肤损伤。
44.图1b吡格列酮可降低sle小鼠尿蛋白、外周血anti-dsdna及ana含量。相较于对照组，吡格列酮组尿蛋白(对照组vs吡格列酮组：67.26
±
20.70mg/dl vs30.30
±
7.73mg/dl，***p《0.001)、外周血自身抗体anti-dsdna(对照组vs吡格列酮组：18.40
±
5.00ng/ml vs 12.66
±
3.74ng/ml，*p《0.05)及ana(对照组vs吡格列酮组：37.58
±
4.46ng/ml vs 23.03
±
7.53ng/ml，***p《0.001)明显下降。以上结果表明吡格列酮能够显著降低sle小鼠尿蛋白及自身抗体。
45.图1c吡格列酮可缓解sle小鼠皮肤病理损伤。对小鼠皮肤进行he组织病理染色，对照组皮肤存在角化过度、棘层增厚、基底细胞液化变性，真皮层免疫细胞浸润。吡格列酮组小鼠同部位皮肤炎性改变明显减轻。以上结果再次证明吡格列酮可缓解sle小鼠皮肤病理损伤。
46.图1d吡格列酮可减少sle小鼠肾脏肾小球和皮肤基底膜带igg免疫复合物沉积。组织冰冻切片表明对照组的皮肤基底膜带及肾小球存在igg沉积。吡格列酮组小鼠同部位皮肤基底膜带及肾小球igg沉积明显减少。说明吡格列酮可减少sle小鼠肾脏肾小球和皮肤基底膜带igg免疫复合物沉积。
47.以上结果表明，外用吡格列酮可以治疗sle小鼠。
48.本发明提供了吡格列酮在制备用于治疗系统性红斑狼疮药物中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

技术特征：
1.吡格列酮及其盐在制备用于治疗系统性红斑狼疮的产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，吡格列酮及其盐降低小鼠外周血anti-dsdna、ana及尿蛋白的含量，减少自身抗体的生成。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，吡格列酮及其盐作为治疗系统性红斑狼疮的药物的活性成分。4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述盐为盐酸盐。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为药品和保健品。6.一种药物组合物在制备用于治疗系统性红斑狼疮的产品中的应用，其特征在于，所述组合物包含吡格列酮或其盐。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包含药学上可接受的载体或辅料。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为药品和保健品。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物选自如下的剂型：溶液、凝胶、膏剂、糊剂、粉剂、片剂、注射液、胶囊或口服液。10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为盐酸吡格列酮溶液。

技术总结
本发明公开了吡格列酮及其盐在制备用于治疗系统性红斑狼疮的产品中的应用，吡格列酮作为临床治疗糖尿病的老药，毒副作用小。本发明首次研究表明吡格列酮在治疗系统性红斑狼疮上具有一定的潜力，且吡格列酮这一老药新用能够大大缩短研发成本和研发风险。本发明首次探究吡格列酮治疗系统性红斑狼疮的效用，为系统性红斑狼疮的治疗提供实验基础。统性红斑狼疮的治疗提供实验基础。统性红斑狼疮的治疗提供实验基础。


技术研发人员：陆前进 田婧汝 史丽晴
受保护的技术使用者：中国医学科学院皮肤病医院（中国医学科学院皮肤病研究所）
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/8/5