一种构建人胰腺星状细胞来源类胰岛的制备方法

1.本发明属于细胞分化技术领域，具体为一种构建人胰腺星状细胞来源类胰岛的制备方法。


背景技术：

2.近年来，糖尿病患病率不断提高，据国际糖尿病联盟(idf)统计数据显示，2021年全球成人糖尿病患病人数已达5.37亿。虽然糖尿病病因学及发病机制错综复杂，但胰岛β细胞功能进行性减退直至衰竭在糖尿病的发生发展中始终占据核心地位。如何恢复功能性β细胞总量是糖尿病防治的关键路径之一，目前研究多集中于多潜能干细胞，对其进行工程化诱导为β细胞或构建内源性β细胞再生。
3.近年来研究表明，多潜能干细胞可衍生分化为胰岛细胞，但是因其诱导效率不高，细胞表型容易丢失，且容易发生额外的基因突变，临床应用依旧受限。在此背景下，内源性β细胞再生成为了新的研究热点。与其他组织来源的干细胞相比，胰腺祖细胞与β细胞在解剖结构和发育生物学上存在紧密联系，可作为构建胰岛β细胞的另一种来源。最近我们的研究结果发现：胰腺星状细胞可表达多种成体干/祖细胞和内分泌前体细胞标记物，具有多向分化能力，或可成为向类胰岛细胞分化的新细胞类型。但是目前胰腺星状细胞是否能向类胰岛细胞进行转分化，目前并无报道。因此，我们提出一种构建人胰腺星状细胞来源类胰岛的制备方法。


技术实现要素：

4.基于背景技术中所提到的问题，本发明的在于提供一种构建人胰腺星状细胞来源类胰岛的制备方法，通过构建人源腺星状细胞3d球体细胞团，采用分步诱导的方法促使人源细胞形成类胰岛，高效诱导胰腺星状细胞向类胰岛(多种细胞)分化。
5.一种构建人胰腺星状细胞来源类胰岛的制备方法，所述方法具体为：
6.使用酶消化法从人体胰腺组织中提取胰腺星状细胞，然后使用msc完全培养液(不含血清)在低粘附培养板对胰腺星状细胞进行培养得到球体细胞团；使用无菌dpbs溶液(杜氏磷酸盐缓冲液)对球体细胞团清洗两次，使用诱导液i对清洗后的球体细胞团培养3天，诱使球体细胞朝胰腺祖细胞方向分化；使用诱导液ii对清洗后的球体细胞团培养3天，诱使球体细胞朝内分泌祖细胞分化；使用诱导液iii对清洗后的球体细胞团培养7天，诱使球体细胞朝内分泌细胞特异性分化；使用诱导液iv对清洗后的球体细胞团培养10天，诱使球体细胞往成熟类胰岛分化。
7.优选地，所述酶消化法提取胰腺星状细胞的具体过程为：使用注射泵将酶溶液反复注至胰腺组织块中，直至胰腺组织肿胀，腺叶分散；注射完成后对胰腺组织进行轻柔吹打，并收集含有胰腺细胞的悬液，然后对含有胰腺细胞的悬液进行多次离心处理，即可获得胰腺星状细胞。
8.优选地，所述酶溶液由胶原酶nb1(serva,heidelberg,germany)和中性蛋白酶nb
(serva,heidelberg,germany)制备而成，所述胶原酶和中性蛋白酶的体积比为15:1。
9.优选地，所述诱导液i(按50ml为标准体系进行配置)的成分为：50ml mcdb131(sigma，st.louis，mo，usa)，3.05mm glucose，0.0615gnahco3；1g bsa，250μl itx-x，500μl glutamax，2.2mg抗坏血酸，500μl青链霉素(gibico)，50ng/ml fgf7(peprotech),0.25μmsant-1(sigma),1μm retinoic acid(sigma),100nm ldn193189(selleck),10μm repsox(peprotech),100nm tpb(adooq)。
10.优选地，所述诱导液ii(按50ml为标准体系进行配置)的成分为:50ml mcdb131(sigma,st.louis，mo,usa),3.05mm glucose,0.0615g nahco3；1g bsa,250μl itx-x,500μl glutamax,2.2mg抗坏血酸,500μl青链霉素(gibico),10μl肝素(50mg/ml),5μl硫酸锌七水(28.6mg/ml),0.25μmsant-1(sigma),1μm retinoic acid(sigma),100nm ldn193189(selleck),10μm repsox(peprotech),1μm 3,3’,5-triiodo-l-thyronine sodium salt(milliopore)。
11.优选地，所述诱导液iii(按50ml为标准体系进行配置)的成分为:50ml mcdb131(sigma,st.louis，mo,usa),3.05mm glucose,0.0615g nahco3；1g bsa,250μl itx-x,500μl glutamax,2.2mg抗坏血酸,500μl青链霉素(gibico),10μl肝素(50mg/ml),5μl硫酸锌七水(28.6mg/ml),100nm ldn193189(selleck)，10μm repsox(peprotech，1μm3,3’,5-triiodo-l-thyronine sodium salt(milliopore)，100nmγ-secretase inhibitor xx(gsixx,millipore)。
12.优选地，所述诱导液iv(按50ml为标准体系进行配置)的成分为：50ml mcdb131(sigma,st.louis,mo,usa),14.76mm glucose,0.0615gnahco3；1g bsa,250μl itx-x,500μl glutamax,2.2mg抗坏血酸,500μl青链霉素(gibico),10μl肝素(50mg/ml),5μl硫酸锌七水(28.6mg/ml),10μm repsox(peprotech)，1μm 3,3’,5-triiodo-l-thyronine sodium salt(milliopore)，10μm trolox(calbiochem),2μm r428(selleckchem),1mm n-acetyl cysteine，100ng/ml wnt4(r&d systems)。
13.优选地，使用诱导液i或诱导液ii或诱导液iii或诱导液iv对球体细胞团进行培养时，需要每天对使用的诱导液进行更换，以保证细胞分化所需的营养成分。
14.优选地，使用上述方法培养出的多种类胰岛细胞能够应用于糖尿病的研究。
15.有益效果：本发明通过构建人源腺星状细胞3d球体，采用分步诱导方法促使人源细胞形成类胰岛，能够高效诱导胰腺星状细胞向类胰岛(多种细胞)分化。
附图说明
16.图1为本发明测定类胰岛双硫腙染色表达情况
17.图2为本发明通过pcr、免疫荧光检测类胰岛细胞组成及采用elisa免疫定量测定类胰岛糖刺激下胰岛素分泌功能
具体实施方式
18.下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
19.实施例1测定类胰岛双硫腙染色表达情况
20.实验过程：
21.1)称取50mg dtz溶解于5ml dmso和50μl浓氨水，在超净台中利用滤器无菌过滤，避光保存于-20℃，为母液。实验时用缓冲液以1:20体积稀释，为工作液。
22.2)将工作液加入处理后的细胞球，37℃放置20min，去除工作液，重新加入dpbs液体。
23.3)镜下观察染色呈猩红色的区域。
24.结果1：经dtz染色测定，分化成功后球体细胞聚集成类胰岛形态且dtz染色阳性(图1)
25.图1，人源胰腺星状细胞体外成功构成3d球体细胞，并成功诱导分化其聚集成类胰岛形态及dtz染色呈现阳性。放大倍率分别为：10
×
，10
×
,4
×
,10
×
。
26.实施例2通过pcr、免疫荧光检测类胰岛细胞组成及采用elisa免疫定量测定类胰岛糖刺激下胰岛素分泌功能
27.pcr凝胶电泳实验过程:
28.1.细胞内总rna的提取
29.由于空气及物体表面含有rna酶，rna易被rna酶降解，所以rna在外界环境中极不稳定，本实验过程中，涉及的全部一次性耗材如不同规格的移液枪枪头、ep管以及8连排ep管等均购买去rna酶化特殊处理过的器材。
30.弃去六孔板中原有的培养液，用预冷的pbs缓冲液清洗3次，置于水平摇床上，每次5min。
31.每孔添加1mltrizol，晃动培养板使trizol充分接触细胞后，置于冰上15min。
32.将全部裂解液用移液枪转移至新的无rna酶的1.5ml ep管中。
33.向每组ep管加入200μl氯仿(体积为总体积的1/5)，涡旋振荡器震荡20s，并静置15min，期间每隔5min上下颠倒从而充分混匀，以避免出现分层。
34.将ep管置于低温高速离心机中，4℃，12000g离心15min，离心后小心取出，细胞样本可自上而下分成3层，依次为：无色水样的为rna、白色的为dna、黄色的为蛋白质。
35.缓慢小心吸取上层约500μl的rna至新的ep管中，避免碰触下层液体，并留意吸取液体的体积。
36.每组ep管加入与上层rna体积相仿的预冷的异丙醇，充分混匀后冰上静置15min。
37.将ep管置于低温高速离心机中，4℃，12000g离心10min，离心后小心取出，弃去上清液。
38.加入1ml预冷的75％酒精，上下颠倒并充分混匀。
39.将ep管置于低温高速离心机中，4℃，7500g离心5min。
40.重复上述步骤(9)、(10)2次。
41.离心后小心取出，弃去上清液，在超净台内静置干燥rna沉淀5min；加入20μl rnase-free水(depc水)溶解rna沉淀，充分震荡、混匀至完全溶解，置于-80℃超低温冰箱中冻存。
42.2.rna浓度测定
43.使用紫外分光光度计检测,公式为crna＝od260
×
稀释倍数
×
40μg/μl/1000。注意，a260/a280在1.8-2.2之间，说明rna纯度较好，若比值小于1.8，则表示存在蛋白质污染，
若比值大于2.2，则表明存在酚类污染。
44.3.cdna的合成
45.使用逆转录试剂盒进行cdna的合成。反应体系和反应条件如下：
46.(1)将测过浓度的rna样品，4℃下溶解，按下表中所列试剂配比，配置反应溶液,去除基因组dna。
[0047][0048][0049]
在轻轻吹打混匀后，放置于逆转录仪中，反应条件为42℃，2min。
[0050]
(2)逆转录反应体系(20μl体系)所需试剂及配比如下表所示:
[0051]
在上一部分的反应管中直接加入5
×
qrt supermix ii
[0052][0053]
轻轻吹打混匀上述样品，放置于逆转录仪中，反应条件为：50℃下反应15min，最后85℃下反应5min。
[0054]
4.凝胶电泳
[0055]
(1)pcr：将人gapdh作为内参，引物设计来自参考文献，见下表
[0056][0057]
按照takara公司的sybr premix ex taqtm试剂盒说明书，取2μl逆转录产物20μl体系中，应用abi real-time pcr system扩增目的基因。扩增程序为95℃30s，56℃-58℃30s，72℃40s，循环次数40次。
[0058]
跑胶：产物2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像扫描图像并进行条带光密度分析，计算目的基因与gapdh基因的光密度之比。
[0059]
免疫荧光实验过程：
[0060]
准备类胰岛，将其放置于共聚焦皿中，并以dpbs清洗细胞球体三遍以去除细胞碎片。
[0061]
将类胰岛固定在不含甲醇4％的甲醛pbs溶液中，在室温下固定15分钟后，以dpbs清洗三遍。
[0062]
将类胰岛在0.1％tritonx-100中室温渗透30分钟后，以dpbs清洗三遍。
[0063]
使用200μl的10％山羊血清封闭液覆盖类胰岛，使其在室温环境中封闭1h。
[0064]
(3)封闭结束后，以dpbs清洗三遍，配制一抗孵育液，放置于湿盒中，4℃避光过夜。
[0065]
(6)第二天，回收抗体，标记，以dpbs清洗类胰岛三遍。
[0066]
(7)弃去dpbs，加入荧光标记的二抗孵育液，在室温孵育下1h，以dpbs清洗类胰岛三遍。
[0067]
(8)弃去dpbs，使用即用型dapi染色液对类胰岛的细胞核染色，室温下染色10min，以dpbs清洗类胰岛三遍。
[0068]
(9)使用抗荧光淬灭封片剂覆盖类胰岛。
[0069]
(10)奥林巴斯fv 1000共聚焦荧光显微镜下，调整好pinhole、曝光时间等参数后观察拍照。
[0070]
insulin elisa浓度检测
[0071]
本实验采用双抗体夹心elisa法。抗insulin单抗包被于96孔板上，样品与标准品中含有的insulin会与微孔板上的抗体相结合，游离的部分会被洗去，从而被固定于孔板上。加入hrp标记的抗人insulin多抗，洗去未结合的抗体。加入底物显色剂，溶液颜色与结合的insulin蛋白成正比，随后加入终止液，可在酶标仪上检测吸光度。
[0072]
(1)上清样品准备：将类胰岛放置于培养板中，吸弃诱导液，加入适量k-r缓冲液轻轻换液，彻底去除培养基。每孔类胰岛中加入含2mm葡萄糖的k-r缓冲液，在37℃5％co2的细胞培养箱中孵育2h。收集每组细胞培养上清保存待测。之后，在每孔类胰岛胰岛加入含30mm葡萄糖的k-r缓冲液，在37℃5％co2的细胞培养箱中孵育2h。继续收集每组细胞培养上清保存待测。收集好的上清中胰岛素含量通过elisa法检测。
[0073]
(2)从板框上取下待用的微孔板条，每孔加入1x洗涤缓冲液350μl，静置40秒后弃去液体，该步骤共洗涤3次。
[0074]
(3)在空白孔中添加100μl标准品/样本稀释液。
[0075]
(4)在其他孔中分别加入100μl不同浓度的样品，37℃孵育2小时。
[0076]
(5)弃去孔中液体，重复步骤2中的洗涤步骤。
[0077]
(6)每孔加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)，37℃孵育1小时。
[0078]
(7)用弃去孔中液体，重复步骤2中的洗涤步骤。
[0079]
(8)每孔加入链霉亲和素—hrp工作液100μl，37℃孵育30分钟。
[0080]
(9)弃去孔中液体，重复步骤2中的洗涤步骤。
[0081]
(10)每孔加入tmb底物(100μl/孔)，37℃避光孵育15分钟。
[0082]
(11)每孔加入50μl终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值，设定570nm或630nm作为校正波长。
[0083]
(12)计算结果：将每个标准品与样品的校正吸光度值(od450-od570/od630)、复孔
读数取平均值，然后减去平均零标准品od值。使用计算机软件做四参数逻辑(4-pl)曲线拟合创建标准曲线。最后得出各样本的数值。
[0084]
结果2：经pcr检测，诱导成功的类胰岛可表达维持内分泌细胞特征的多种关键分子，如ngn3，pdx1，nkx6.1，mafa，表达胰岛素ins、胰高血糖素gcg、生长抑素sst及胰多肽pyy等基因(图d)；免疫荧光染色鉴定，球体类胰岛可表达胰岛素ins，胰高血糖素gcg,生长抑素sst及c肽(c-peptide)(图a-c)。elisa免疫定量测定分化成功后细胞在高糖刺激下，分泌胰岛素含量显著增加(图e)。
[0085]
图2，人胰腺星状细胞可在体外构建成球体细胞——类胰岛，并对其进行诱导分化。(a)-(c)类胰岛中胰岛素与胰高血糖素、生长抑素sst及c肽免疫荧光共染图。(d)类胰岛可表达维持内分泌细胞特征的多种关键分子，如ngn3，pdx1，nkx6.1，mafa，并表达胰岛素ins、胰高血糖素gcg、生长抑素sst及胰多肽pyy等基因。(e)在高糖刺激下，类胰岛的分泌胰岛素含量显著增加。标尺：100μm；****＝p《0.0001。
[0086]
经dtz染色测定分化成功细胞胰岛双硫腙染色(图1)。
[0087]
pcr结果显示，类胰岛可表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素及胰多肽等基因；免疫荧光染色鉴定，球体类胰岛可表达胰岛素，胰高血糖素,生长抑素及c肽。elisa免疫定量测定分化成功后细胞在高糖刺激下，分泌胰岛素含量显著增加(图2)。

技术特征：
1.一种构建人胰腺星状细胞来源类胰岛的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：使用酶消化法从人体胰腺组织中提取胰腺星状细胞，然后使用msc完全培养液(不含血清)在低粘附培养板对胰腺星状细胞进行培养得到球体细胞团；使用无菌dpbs溶液(杜氏磷酸盐缓冲液)对球体细胞团清洗两次，以去除破碎细胞，使用诱导液i对清洗后的球体细胞团培养3天，诱使球体细胞朝胰腺祖细胞方向分化；使用诱导液ii对清洗后的球体细胞团培养3天，诱使球体细胞朝内分泌祖细胞分化；使用诱导液iii对清洗后的球体细胞团培养7天，诱使球体细胞朝内分泌细胞特异性分化；使用诱导液iv对清洗后的球体细胞团培养10天，诱使球体细胞往成熟类胰岛分化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶消化法提取胰腺星状细胞的具体过程为：使用注射泵将酶溶液反复注至胰腺组织块中，直至胰腺组织肿胀，腺叶分散；注射完成后对胰腺组织进行轻柔吹打，并收集含有胰腺细胞的悬液，然后对含有胰腺细胞的悬液进行多次离心处理，即可获得胰腺星状细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酶溶液由胶原酶nb1(serva,heidelberg,germany)和中性蛋白酶nb(serva,heidelberg,germany)制备而成，所述胶原酶和中性蛋白酶的体积比为15:1。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导液i(按50ml为标准体系进行配置)的成分为：50mlmcdb131(sigma，st.louis，mo，usa)，3.05mmglucose，0.0615gnahco3；1gbsa，250μlitx-x，500μlglutamax，2.2mg抗坏血酸，500μl青链霉素(gibico)，50ng/mlfgf7(peprotech),0.25μmsant-1(sigma),1μmretinoicacid(sigma),100nmldn193189(selleck),10μmrepsox(peprotech),100nmtpb(adooq)。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导液ii(按50ml为标准体系进行配置)的成分为:50mlmcdb131(sigma,st.louis，mo,usa),3.05mmglucose,0.0615gnahco3；1gbsa,250μlitx-x,500μlglutamax,2.2mg抗坏血酸,500μl青链霉素(gibico),10μl肝素(50mg/ml),5μl硫酸锌七水(28.6mg/ml),0.25μmsant-1(sigma),1μmretinoicacid(sigma),100nmldn193189(selleck),10μmrepsox(peprotech),1μm3,3’,5-triiodo-l-thyroninesodiumsalt(milliopore)。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导液iii(按50ml为标准体系进行配置)的成分为:50mlmcdb131(sigma,st.louis，mo,usa),3.05mmglucose,0.0615gnahco3；1gbsa,250μlitx-x,500μlglutamax,2.2mg抗坏血酸,500μl青链霉素(gibico),10μl肝素(50mg/ml),5μl硫酸锌七水(28.6mg/ml),100nmldn193189(selleck)，10μmrepsox(peprotech，1μm3,3’,5-triiodo-l-thyroninesodiumsalt(milliopore)，100nmγ-secretaseinhibitorxx(gsixx,millipore)。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导液iv(按50ml为标准体系进行配置)的成分为：50mlmcdb131(sigma,st.louis,mo,usa),14.76mmglucose,0.0615gnahco3；1gbsa,250μlitx-x,500μlglutamax,2.2mg抗坏血酸,500μl青链霉素(gibico),10μl肝素(50mg/ml),5μl硫酸锌七水(28.6mg/ml),10μmrepsox(peprotech)，1μm3,3’,5-triiodo-l-thyroninesodiumsalt(milliopore)，10μmtrolox wnt4(r&dsystems)。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用诱导液i或诱导液ii或诱导液iii或诱导液iv对球体细胞团进行培养时，需要每天对使用的诱导液进行更换，以保证细胞分化所
需的营养成分。9.使用如权利要求1-8的方法培养的多种类胰岛细胞能够应用于糖尿病的研究。

技术总结
本发明属于细胞分化技术领域，具体为一种构建人胰腺星状细胞来源类胰岛的制备方法，具体为：使用酶消化法从人体胰腺组织中提取胰腺星状细胞，使用MSC完全培养液(不含血清)对胰腺星状细胞培养得到球体细胞团；使用无菌DPBS溶液对球体细胞团清洗两次，使用诱导液I对球体细胞团培养3天，诱使球体细胞朝胰腺祖细胞方向分化；使用诱导液II对球体细胞团培养3天，诱使球体细胞朝内分泌祖细胞分化；使用诱导液III对球体细胞团培养7天，诱使球体细胞朝内分泌细胞特异性分化；使用诱导液IV对球体细胞团培养10天，诱使球体细胞往成熟类胰岛分化。本发明采用分步诱导方法，能够高效的诱导胰腺星状细胞向类胰岛(多种细胞)分化。状细胞向类胰岛(多种细胞)分化。状细胞向类胰岛(多种细胞)分化。


技术研发人员：倪成铭 孙子林 孙博 周云婷 陈扬
受保护的技术使用者：东南大学
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/8/5