一种高特异性等温核酸扩增方法与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种高特异性等温核酸扩增方法。


背景技术：

2.等温核酸扩增技术，例如环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification)在近年来已经取得了一定发展，由于其具有反应条件温和、反应时间短等优点，在生物诊断、食品安全检测等领域具有广阔的应用前景。
3.等温核酸扩增技术具有效率高的优点，在等温条件下扩增15min～1h即可产生足够的扩增产物，以满足后续检测的需求。然而，另一方面，在其具有扩增速度快、效率高等优点的同时，也可能会发生引物-二聚体的扩增，在引物与引物形成二聚体、或引物与待测模板发生错配后仍引发扩增反应，从而导致假阳性结果。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种高特异性等温核酸扩增方法，通过应用该扩增方法，可有效减少假阳性结果，具有准确性高、速度快、应用范围广等优点。
5.为此，本发明的第一方面提供一种扩增体系，所述扩增体系包括作为模板的核酸、引物组合、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的dna聚合酶、核糖核酸酶(ribonuclease，rnase)hii；
6.所述引物组合用于对靶标核酸进行扩增；所述靶标核酸的3’端包括m2’序列和位于所述m2’序列5’侧的m1’序列；所述靶标核酸的5’端包括n2序列和位于所述n2序列3’侧的n1序列；
7.其中，所述引物组合包括扩增引物组，所述扩增引物组包括上游扩增引物(kf)、下游扩增引物(kr)；
8.所述上游扩增引物(kf)从5’到3’方向依次包括m1’序列和m2序列，所述m2序列与所述m2’序列互补，并且所述m2序列中至少有一个核苷酸为核糖核苷酸；所述上游扩增引物(kf)的3’末端具有阻断修饰；
9.所述下游扩增引物(kr)从5’到3’方向依次包括n1’序列和n2序列；所述n1’序列与所述n1序列相互补；所述n2序列与所述n2序列的互补序列相互补，并且所述n2序列中至少有一个核苷酸为核糖核苷酸；所述下游扩增引物(kr)的3’末端具有阻断修饰。
10.在一些实施方式中，所述上游扩增引物(kf)中，所述m1’序列和所述m2序列直接相连；即，5
’‑
m1
’‑
m2-3’。
11.在一些实施方式中，所述下游扩增引物(kr)中，所述n1’序列和所述n2序列直接相连；即，5
’‑
n1
’‑
n2-3’。
12.在一些实施方式中，所述m2序列中，所述核糖核苷酸距所述m2序列的3’末端的距离为3～10个碱基；所述核糖核苷酸的个数为1～3个。
13.在一些实施方式中，所述n2序列中，所述核糖核苷酸距所述n2序列的3’末端的距
离为3～10个碱基；所述核糖核苷酸的个数为1～3个。
14.在一些实施方式中，所述引物组合还包括加速引物组，所述加速引物组包括第一加速引物，和/或第二加速引物；
15.所述上游扩增引物(kf)结合所述靶标核酸后，通过链置换反应合成第一核酸链，所述第一核酸链的5’端具有m1’序列和与m1’序列相互补的m1序列，所述m1’序列与所述m1序列互补形成第一环；所述第一加速引物特异性结合所述第一核酸链的部分区域，并且所述第一加速引物特异性结合的区域位于所述上游扩增引物和下游扩增引物的区域之外；
16.所述下游扩增引物(kr)结合所述第一核酸链后，延伸得到第二核酸链，所述第二核酸链的3’端具有n1’序列和与n1’序列互补的n1序列，所述n1’序列和与所述n1序列互补形成第二环；所述第二加速引物特异性结合所述第二核酸链的部分区域，并且所述第二加速引物特异性结合的区域位于所述上游扩增引物和下游扩增引物的区域之外。
17.在一些实施方式中，所述第一加速引物中至少有一个核苷酸为核糖核苷酸，所述第一加速引物的3’末端具有阻断修饰；和/或，
18.所述第二加速引物中至少有一个核苷酸为核糖核苷酸，所述第二加速引物的3’末端具有阻断修饰。
19.在一些实施方式中，所述第一加速引物中，所述核糖核苷酸距所述第一加速引物的3’末端的距离为3～10个碱基；所述核糖核苷酸的个数为1～3个。
20.在一些实施方式中，所述第二加速引物中，所述核糖核苷酸距所述第二加速引物的3’末端的距离为3～10个碱基；所述核糖核苷酸的个数为1～3个。
21.在一些实施方式中，所述加速引物组还包括第三加速引物、第四加速引物；
22.所述第三加速引物、第四加速引物分别特异性所述靶标核酸或者利用所述扩增体系对靶标核酸进行扩增得到的核酸链；并且，所述第三加速引物、第四加速引物特异性结合的区域位于所述第一扩增引物、第二扩增引物、第一加速引物和第二加速引物的区域之外。
23.根据本发明的技术方案，加速引物组可以增加反应的速度和效率，并且在含有核糖核苷酸与阻断修饰时，还具有减少非特异性扩增和假阳性结果的作用。本发明所述的加速引物组可以选择性的设置，例如：不设置加速引物组，设置加速引物组中的第一加速引物、第二加速引物、第三加速引物和第四加速引物中的一种或两种以上。在具体的实施方式中，可以根据对扩增速度的实际需要对加速引物组进行选择性的设置。
24.在一些实施方式中，所述阻断修饰包括选自双脱氧胞苷(ddc)修饰、反向dt修饰、磷酸基团修饰、间臂(spacer，例如c3间臂(c3 spacer))修饰、与靶标核酸不发生互补的核酸序列中的至少一种或其他可阻断引物延伸的修饰。
25.在一些实施方式中，所述具有链置换活性的dna聚合酶还具有反转录功能。
26.根据本发明的技术方案，作为模板的核酸可以为脱氧核糖核酸(dna)也可以为核糖核酸(rna)，当作为模板的核酸为核糖核酸(rna)时，可相应采用具有链置换活性且具有反转录功能的dna聚合酶。
27.在一些实施方式中，所述dna聚合酶为bst聚合酶。
28.在一些实施方式中，所述bst聚合酶为具有反转录功能的bst聚合酶。
29.在一些实施方式中，所述扩增体系中，rnase hii的酶量为5～10u。
30.在一些实施方式中，所述扩增体系还包括缓冲溶液。
31.在一些实施方式中，所述缓冲溶液包括：tris、kcl、mgso4、nah2po4、tween、甜菜碱。
32.本发明的第二方面，提供一种高特异性等温核酸扩增方法，其包括提供本发明第一方面的扩增体系；温育所述扩增体系以对所述靶标核酸进行扩增。
33.在一些实施方式中，所述温育的温度为60～65℃。
34.在一些实施方式中，所述温育的时间为15～90min。
35.本发明的第三方面，提供一种靶标核酸的检测方法，其包括：以提取自待测样本的核酸作为模板，按照本发明第二方面所述的扩增方法进行扩增并进行检测。
36.根据本发明的技术方案，所述检测方法用于非疾病诊断目的。
37.在一些实施方式中，所述检测与所述扩增同时进行。
38.在一些实施方式中，所述扩增体系中还包括荧光染料；所述检测的方法包括检测荧光值。
39.在一些实施方式中，所述检测的方法包括实时检测荧光值。
40.在一些实施方式中，所述荧光染料可选自下组：sybr green、evagreen、syto(例如syto 9、syto 82、syto 13、syto 16等)、boxto、miami yellow。
41.与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
42.(1)通过采用本发明提供的扩增体系对靶标核酸进行扩增，可以显著降低因引物二聚体、引物与模板错配导致的非特异扩增，从而有效减少扩增的假阳性结果。
43.(2)本发明提供的扩增方法具有良好的特异性和灵敏度。通过应用加速引物，可进一步提高扩增反应的速度，当对加速引物进行rna修饰和3’阻断修饰时，可进一步提高扩增反应的特异性。在实际应用过程中，可根据对反应速度、特异性的实际需求，选择性地设置加速引物。
附图说明
44.通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
45.图1：根据本发明的一个实施例，以提取自结核分枝杆菌菌液的核酸作为模板，进行核酸扩增的检测结果；
46.图2：根据本发明的一个实施例，以提取自结核分枝杆菌pcr检测试剂盒用国家参考品的核酸为模板，进行核酸扩增的检测结果；
47.图3：根据本发明的一个实施例，以提取自腺病毒质控品的核酸作为模板，进行核酸扩增的检测结果；
48.图4：根据本发明的一个实施例，以提取自2019新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品的核酸作为模板，以n基因的相对保守区域作为靶标核酸进行核酸扩增的检测结果；
49.图5：根据本发明的一个实施例，以提取自2019新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品的核酸作为模板，以orf1ab基因的相对保守区域作为靶标核酸进行核酸扩增的检测结果；
50.图6：根据本发明的一个实施例，以包含野生型叶酸代谢酶序列的质粒作为模板，分别用野生型扩增体系(图左)和突变型扩增体系(图右)进行扩增的检测结果；
51.图7：根据本发明的一个实施例，以包含突变型叶酸代谢酶序列的质粒作为模板，分别用野生型扩增体系(图左)和突变型扩增体系(图右)进行扩增的检测结果；
52.图8：根据本发明的一个实施例，以包含野生型叶酸代谢酶序列的质粒和包含突变型叶酸代谢酶序列的质粒的混合物作为模板，分别用野生型扩增体系(图左)和突变型扩增体系(图右)进行扩增的检测结果；
53.图9：根据本发明的一个实施例，当扩增引物采取不同数量的rna修饰时，扩增体系对模板进行扩增的检测结果；
54.图10：根据本发明的一个实施例，以结核分枝杆菌rpob基因的野生型和突变型质粒为模板，用i-4扩增体系进行扩增的检测结果；
55.图11：根据本发明的一个实施例，以结核分枝杆菌rpob基因的野生型和突变型质粒为模板，用i-5扩增体系进行扩增的检测结果；
56.图12：根据本发明的一个实施例，以不同的rnase hii酶量进行扩增的检测结果；
57.图13：以包含结核分枝杆菌is6110基因的质粒为模板，用ii-2扩增体系进行扩增的检测结果；
58.图14：以包含结核分枝杆菌is6110基因的质粒为模板，用ii-3扩增体系进行扩增的检测结果；
59.图15：以包含结核分枝杆菌is6110基因的质粒为模板，用ii-4扩增体系进行扩增的检测结果；
60.图16：采用不同的阻断修饰的情况下，进行扩增的检测结果
具体实施方式
61.下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
62.本文的实施例采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。本文的实施例所用到的试剂可通过常规商购途径获得。
63.本文中，术语“靶标核酸”是指具有特定核苷酸序列的核酸，该靶标核酸被知晓或者被怀疑存在于模板中。当模板中存在靶标核酸时，利用本发明的引物组合可在适于合成的条件下进行特异性扩增，并且得到扩增产物。
64.本文中，术语“引物”是指单链寡核苷酸，它可特异性识别并结合其互补序列，其3’端可以具有或者不具有阻断修饰。当其不具有阻断修饰、或者阻断修饰被去除后，能够在适用于合成的条件下沿着其互补链进行延伸。在本发明的一些实施例中，引物为dna单链或dna与rna的杂交单链(用ra、rt、rc、rg表示rna碱基)，当其为dna与rna的杂交单链时，其符合本发明技术方案的相关限定。例如，在某实施例中，上游扩增引物的m2序列中至少有一个核苷酸碱基为核糖核苷酸碱基，并且上游扩增引物的3’末端具有阻断修饰；下游扩增引物的n2序列中至少有一个核苷酸碱基为核糖核苷酸碱基，并且下游扩增引物的3’末端具有阻断修饰。
65.引物中核糖核苷酸碱基的位置可按照以下原则进行确定：(1)使rnase hii能够对引物与其互补序列所形成的dna-rna杂交链进行切割；(2)在rnase hii切割后，具有阻断修
饰的3’端脱离原核酸序列，以允许后续的引物延伸。因此，在一些实施例中，按照以下标准确定rna碱基的位置：该rna碱基距离3’端至少还有3～10个碱基的距离。
66.本文中，术语“序列”指核酸上的一段连续的特异性序列，其是为了描述核酸之间的互补关系所划分的，并非指分离的寡核苷酸。
67.对于现有的等温核酸扩增技术，其具有高速扩增的特性，这一方面提高了扩增的速度，然而另一方面也难以避免地会引起假阳性扩增。这种假阳性的扩增情况在lamp扩增中表现尤为明显，由于lamp扩增用到较高浓度的引物，因此难免保证有少量错配和引物二聚体，这些轻微的污染都会导致在lamp高速扩增中造成假阳性。
68.为此，本发明提供了针对靶标核酸的扩增体系、扩增方法及检测方法。
69.在一些实施例中，提供一种扩增体系，其包括作为模板的核酸、引物组合、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的dna聚合酶(或具有链置换活性和反转录功能的dna聚合酶)、核糖核酸酶hii；
70.该引物组合用于对靶标核酸进行扩增；所述靶标核酸的3’端包括m2’序列和位于其5’侧的m1’序列；所述靶标核酸的5’端包括n2序列和位于其3’侧的n1序列；
71.其中，所述引物组合包括扩增引物组，所述扩增引物组包括上游扩增引物kf、下游扩增引物kr；
72.上游扩增引物kf包含m1’序列和与m2’互补的m2序列，这两段序列直接相连，即5
’‑
m1
’‑
m2-3’；
73.下游扩增引物kr包含n1’序列和n2序列，两段序列直接相连，即5
’‑
n1
’‑
n2-3’，其中n1’序列与n1序列互补；n2序列与n2序列的互补序列相互补；
74.其中，m2序列中至少有一个核苷酸碱基为核糖核苷酸碱基，并且上游扩增引物kf的3’末端具有阻断修饰；
75.n2序列中至少有一个核苷酸碱基为核糖核苷酸碱基，并且下游扩增引物kr的3’末端具有阻断修饰。
76.在60～65℃条件下，包含上述引物组合的扩增体系中将主要发生以下反应：首先，上游扩增引物的m2序列特异性结合至靶标核酸的m2’序列形成双链结构，此时由于上游扩增引物3’端的阻断修饰的存在，无法进行引物延伸；然而，由于m2序列中具有核糖核苷酸碱基，在该位置形成了dna-rna杂交链，在rnase hii的作用下，切割5’磷酸和3
’‑
羟基末端，使具有阻断修饰的3’末端游离，从而允许引物延伸，并扩增得到第一核酸。然后，基于相同的原理，下游扩增引物的n2序列与第一核酸特异性结合，并在rnase hii的作用后，允许后续的引物延伸，进而实现了对靶标核酸的扩增。在该过程中，只有引物与模板中的靶标核酸发生特异性结合且rnase hii特异性识别并切割后才能进一步引发引物延伸的反应，从而有效减少了非特异性扩增，消除了引物二聚体的形成，且提高了检测的灵敏度和准确性。
77.在一些实施例中，上游扩增引物kf的m2序列中，核糖核苷酸碱基的个数为1～3个，例如1个、2个、3个。
78.在一些实施例中，下游扩增引物kr的n2序列中，核糖核苷酸碱基的个数为1～3个，例如1个、2个、3个。
79.在m2序列和n2序列中，当核糖核苷酸碱基的个数为1～3时，均可达到有效减少非特异性扩增、提高检测准确性的技术效果。其中，当核糖核苷酸碱基的序列为1个时，将进一
步有利于提高扩增的速度，当用于核酸检测时，将缩短检测所需的时间。
80.在一些实施例中，所述m2序列中，所述核糖核苷酸碱基距所述m2序列的3’末端的距离为3～10个碱基，例如3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基等。
81.在一些实施例中，所述n2序列中，所述核糖核苷酸碱基距所述n2序列的3’末端的距离为3～10个碱基，例如3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基等；所述核糖核苷酸碱基的个数为1～3个，例如1个、2个、3个。
82.在一些实施例中，该引物组合还包括加速引物组，所述加速引物组包括第一加速引物，和/或第二加速引物；
83.当上游扩增引物kf结合所述靶标核酸后，利用聚合酶催化链置换反应置换合成的第一核酸链，所述第一核酸链的5’端具有m1’序列和与m1’序列互补的m1序列，所述m1’序列和与m1序列互补形成第一环，所述第一加速引物特异性结合第一核酸链的区域位于扩增引物的区域之外；
84.当下游扩增引物kr结合所述第一核酸链后，延伸得到第二核酸链，所述第二核酸链的3’端具有n1’序列和与n1’序列互补的n1序列，所述n1’序列和与n1序列互补形成第二环，所述第二加速引物特异性结合第二核酸链的区域位于扩增引物的区域之外。
85.通过应用加速引物组，有利于提高核酸扩增的速度，当用于核酸检测时，将缩短检测所需的时间。
86.在一些实施例中，所述第一加速引物中至少有一个核苷酸碱基为核糖核苷酸碱基，所述第一加速引物的3’末端具有阻断修饰。
87.在一些实施例中，所述第二加速引物中至少有一个核苷酸碱基为核糖核苷酸碱基，所述第二加速引物的3’末端具有阻断修饰。
88.当第一加速引物和/或第二加速引物中含有核糖核苷酸碱基并且引物的3’端具有阻断修饰时，有利于进一步增加扩增反应的特异性。
89.在一些实施例中，所述第一加速引物中，所述核糖核苷酸碱基距所述第一加速引物的3’末端的距离为3～10个碱基，例如2个碱基、3个碱基、4个碱基、5个碱基等；所述核糖核苷酸碱基的个数为1～3个，例如1个、2个、3个。
90.在一些实施例中，所述第二加速引物中，所述核糖核苷酸碱基距所述第二加速引物的3’末端的距离为3～10个碱基，例如3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基等；所述核糖核苷酸碱基的个数为1～3个，例如1个、2个、3个。
91.在一些实施例中，所述引物组合由扩增引物组和加速引物组所组成。
92.在一些实施例中，所述加速引物组还包括第三加速引物、第四加速引物；
93.所述第三加速引物、第四加速引物分别特异性所述靶标核酸或者利用所述扩增体系对靶标核酸进行扩增得到的核酸链；并且，所述第三加速引物、第四加速引物特异性结合的区域位于所述第一扩增引物、第二扩增引物、第一加速引物和第二加速引物的区域之外。
94.通过应用第三加速引物、第四加速引物，有利于进一步提高核酸扩增的速度，当用于核酸检测时，将缩短核酸检测所需的时间。
95.在一些实施例中，所述阻断修饰包括选自双脱氧胞苷(ddc)修饰、反向dt修饰、磷酸基团修饰、间臂(spacer)修饰、与靶标核酸不发生互补的核酸序列中的至少一种或其他可阻断引物延伸的修饰。
96.在一些实施例中，所述阻断修饰为c3间臂(c3 spacer)修饰。
97.在一些实施例中，所述具有链置换活性的dna聚合酶为bst聚合酶。
98.在一些实施例中，所述bst聚合酶还具有反转录功能。
99.在一些实施例中，所述扩增体系中，rnase h ii的酶量为5～10u，例如5u、6u、7u、8u、9u、10u等。
100.当rnase h ii的酶量为5～10u时，在特异性和扩增速度方面均可取得优良的效果，当酶量高于10u时，容易抑制扩增反应的进行。
101.在一些实施例中，所述扩增体系还包括缓冲溶液。
102.在一些实施例中，所述缓冲溶液包括：tris、kcl、mgso4、nah2po4、tween、甜菜碱。
103.在一些实施例中，所述扩增体系中，所述引物组合的每条引物的浓度为150～250nmol，例如可选自约150nmol、200nmol、250nmol等。
104.在一些实施例中，提供一种高特异性等温核酸扩增方法，其包括提供本发明所述的扩增体系；温育该扩增体系以对所述靶标核酸进行扩增。
105.在一些实施例中，所述温育的温度为60～65℃；例如60℃、61℃、62℃、65℃等。
106.在一些实施例中，所述温育的时间为15～90min；例如15min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min等。
107.在一些实施例中，提供一种靶标核酸的检测方法，其包括：以提取自待测样本的核酸作为模板，按照本发明所述的扩增方法进行扩增，得到扩增产物；对所述扩增产物进行检测。
108.在一些实施例中，该扩增体系中还包括荧光染料；所述对扩增产物进行检测的方法包括检测荧光值。
109.在一些实施方式中，所述荧光染料可选自下组：sybr green、evagreen、syto(例如syto 9、syto 82、syto 13、syto 16等)、boxto、miami yellow。
110.实施例1
111.本实施例提供一种用于结核分枝杆菌的等温扩增体系，其包括扩增引物kf 200nmol、kr 200nmol，加速引物v1f 200nmol、v1r 200nmol、v2f 200nmol、v2r 200nmol，1μl tris(20mm)，1μl kcl(10mm)，1μl mgso4(5mm)，1μl nah2po4(10mm)，1μl tween(0.5mm)，3.5μl dntps(1.5mm)，4μl甜菜碱(1m)，1μl bst酶，0.5μl syto-9，0.5μl rnase hii(5u)，2μl模板，超纯水补齐至25μl。扩增程序设置为65℃，30min。
112.其中，引物kf、kr、v1f、v1r、v2f、v2r是以结核分枝杆菌is6110基因的相对保守区域为靶标核酸分子设计得到的，并对引物进行阻断修饰及rna碱基修饰，具体引物序列及修饰如下：
113.kf(mtb-ddc-kf，seq id no：1)：
[0114]5’‑
ctccgaatcgtgctgaccgggttcatcgagga/rg/gtac-3
’‑
ddc
[0115]
kr(mtb-ddc-kr，seq id no：2)：
[0116]5’‑
ggcagcgatcagtgaggtccacttacgcaccg/rt/ctcc-3
’‑
ddc
[0117]
v1f(mtb-ddc-v1f，seq id no：3)：
[0118]5’‑
ggatctctgcgac/rc/atcc-3
’‑
ddc
[0119]
v1r(mtb-ddc-v1r，seq id no：4)：
[0120]5’‑
gtctacttggtgt/rt/ggct-3
’‑
ddc
[0121]
v2f(mtb-v2f，seq id no：5)：
[0122]5’‑
gaaaggatggggtcatgt-3’[0123]
v2r(mtb-v2r，seq id no：6)：
[0124]5’‑
gattcttcggtcgtggtc-3’[0125]
其中，模板分别为以下浓度的结核分枝杆菌：2.8
×
103cfu/ml、2.8
×
102cfu/ml、2.8
×
101cfu/ml、2.8
×
100cfu/ml，使用热裂解法提取核酸作为模板进行扩增反应，并进行荧光检测，检测结果如图1所示。根据图1，最低检出结核分枝杆菌菌液浓度为2.8
×
102cfu/ml。
[0126]
实施例2
[0127]
本实施例与实施例1不同在于使用结核分枝杆菌pcr检测试剂盒用国家参考品为模板，以热裂解法提取15支参考品核酸，进行扩增反应并进行荧光检测。结果如图2所示，除结核分枝杆菌阳性对照出现扩增外，其他参考品均未出现扩增，表明该扩增体系的特异性良好。
[0128]
实施例3
[0129]
本实施例提供一种用于腺病毒的等温扩增体系，其包括扩增引物kf 200nmol、kr 200nmol，加速引物v1f 200nmol、v1r 200nmol、v2f 200nmol、v2r 200nmol，1μl tris(20mm)，1μl kcl(10mm)，1μl mgso4(5mm)，1μl nah2po4(10mm)，1μl tween(0.5mm)，3.5μl dntps(1.5mm)，4μl甜菜碱(1m)，1μl bst酶，0.5μl syto-9，0.5μl rnase hii(5u)，2μl模板，超纯水补齐至25μl。扩增程序设置为65℃，60min。
[0130]
其中，引物kf、kr、v1f、v1r、v2f、v2r是以腺病毒hexon基因的相对保守区域为靶标核酸分子设计得到的，并对引物进行阻断修饰及rna碱基修饰，具体引物序列及修饰如下：
[0131]
kf(adv-kf，seq id no：7)：
[0132]5’‑
gtaaaccgcgccttgtacgagtgtttgacgctgcg/rg/ttca-3
’‑
c3spacer
[0133]
kr(adv-kr f，seq id no：8)：
[0134]5’‑
tgggtgacaaccgtgtgcttggcttaaaggtggga/rc/cccg-3
’‑
c3spacer
[0135]
v1f(adv-v1f，seq id no：9)：
[0136]5’‑
gccttgtacgagtat/rg/cggt-3
’‑
c3 spacer
[0137]
v1r(adv-v1r，seq id no：10)：
[0138]5’‑
tactttgacattcgcgg/rc/gtgc-3
’‑
c3 spacer
[0139]
v2f(adv-v2f，seq id no：11)：
[0140]5’‑
acgacgtgaccacagacc-3’[0141]
v2r(adv-v2r，seq id no：12)：
[0142]5’‑
aggcagtgccggagtagg-3’[0143]
其中，使用快速提取法提取腺病毒质控品(质控品浓度分别为1
×
104copies/ml、1
×
103copies/ml、5
×
102copies/ml、1
×
102copies/ml)的核酸作为模板进行扩增反应和荧光检测，其结果如图3所示。根据图3，该体系最低检出腺病毒质控品浓度为5
×
102copies/ml。
[0144]
实施例4
[0145]
本实施例提供一种用于新型冠状病毒sars-cov-2的等温扩增体系，其包括扩增引物kf 200nmol、kr 200nmol，加速引物v1f 200nmol、v1r 200nmol、v2f 200nmol、v2r 200nmol，1μl tris(20mm)，1μl kcl(10mm)，1μl mgso4(5mm)，1μl nah2po4(10mm)，1μl tween(0.5mm)，3.5μl dntps(1.5mm)，4μl甜菜碱(1m)，1μl具反转录功能的bst酶，0.5μl syto-9，0.5μl rnase hii(5u)，2μl模板，超纯水补齐至25μl。扩增程序设置为65℃，60min。
[0146]
其中，引物kf、kr、v1f、v1r、v2f、v2r是以新型冠状病毒n基因的相对保守区域为靶标核酸分子设计得到的，并对引物进行阻断修饰及rna碱基修饰，具体引物序列及修饰如下：
[0147]
kf(cov-n-kf，seq id no：13)：
[0148]5’‑
ttggccttgttgttgttggcttgctgctgcttgac/ra/gatt-3
’‑
ddc
[0149]
kr(cov-n-kr，seq id no：14)：
[0150]5’‑
ctgctgctgaggcttctaagaagttctggaccacg/rt/ctgc-3
’‑
ddc
[0151]
v1f(cov-n-v1f，seq id no：15)：
[0152]5’‑
ttgctctcaagct/rg/gttc-3
’‑
ddc
[0153]
v1r(cov-n-v1r，seq id no：16)：
[0154]5’‑
aagcatacaatgtaaca/rc/aagc-3
’‑
ddc
[0155]
v2f(cov-n-v2f，seq id no：17)：
[0156]5’‑
tcaactccaggcagcagta-3’[0157]
v2r(cov-n-v2r，seq id no：18)：
[0158]5’‑
ttccgaagaacgctgaagc-3’[0159]
其中，使用快速提取法提取2019新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品(质控品浓度分别为1.4
×
104copies/ml、1.4
×
103copies/ml、5.1
×
102copies/ml、2.5
×
102copies/ml)的核酸作为模板进行扩增反应和荧光检测，检测结果如图4所示，根据检测结果，最低检出2019新型冠状病毒核糖核酸质控品浓度为5.1
×
102copies/ml。
[0160]
实施例5
[0161]
本实施例提供一种用于新型冠状病毒sars-cov-2的等温扩增体系，其包括扩增引物kf 200nmol、kr 200nmol，加速引物v1f 200nmol、v1r 200nmol、v2f 200nmol、v2r 200nmol，1μl tris(20mm)，1μl kcl(10mm)，1μl mgso4(5mm)，1μl nah2po4(10mm)，1μl tween(0.5mm)，3.5μl dntps(1.5mm)，4μl甜菜碱(1m)，1μl具反转录功能的bst酶，0.5μl syto-9，0.5μl rnase hii(5u)，2μl模板，超纯水补齐至25μl。扩增程序设置为65℃，60min。
[0162]
其中，引物kf、kr、v1f、v1r、v2f、v2r是以新型冠状病毒orf1ab基因的相对保守区域为靶标核酸分子设计得到的，并对引物进行阻断修饰及rna碱基修饰，具体引物序列及修饰如下：
[0163]
kf(cov-ofr-kf，seq id no：19)：
[0164]5’‑
tgttgtgccaaccaccatagaaaatagccgccactag/ra/ggag-3
’‑
ddc
[0165]
kr(cov-ofr-kr，seq id no：20)：
[0166]5’‑
cctcaccttatgggttgggatttgcgagcaagaacaa/rg/tgag-3
’‑
ddc
[0167]
v1f(cov-ofr-v1f，seq id no：21)：
[0168]5’‑
tgcttgttccaattact/ra/cagt-3
’‑
ddc
[0169]
v1r(cov-ofr-v1r，seq id no：22)：
[0170]5’‑
agccatgcctaacatg/rc/ttag-3
’‑
ddc
[0171]
v2f(cov-ofr-v2f，seq id no：23)：
[0172]5’‑
agaatagagctcgcaccgta-3’[0173]
v2r(cov-ofr-v2r，seq id no：24)：
[0174]5’‑
acggtgtgacaagctacaac-3’[0175]
其中，使用快速提取法提取2019新型冠状病毒核糖核酸液体室内质控品(质控品浓度分别为1.4
×
104copies/ml、1.4
×
103copies/ml、5.1
×
102copies/ml、2.5
×
102copies/ml)的核酸作为模板进行扩增反应和荧光检测，检测结果如图5所示，根据检测结果，最低检出2019新型冠状病毒核糖核酸质控品浓度为5.1
×
102copies/ml。
[0176]
实施例6
[0177]
本实施例提供一种用于检测叶酸代谢酶mthfr c677t突变位点的等温扩增体系，其包括野生型扩增体系和突变型扩增体系，二者除突变位点处的具体引物序列不同以外，具有相同的组成，野生型扩增体系和突变型扩增体系均包括扩增引物kf 200nmol、kr 200nmol，加速引物v1f 200nmol、v1r 200nmol、v2f 200nmol、v2r 200nmol，1μl tris(20mm)，1μl kcl(10mm)，1μl mgso4(5mm)，1μl nah2po4(10mm)，1μl tween(0.5mm)，3.5μl dntps(1.5mm)，4μl甜菜碱(1m)，1μl bst酶，0.5μl syto-9，1μl rnase hii(5u)，2μl模板，超纯水补齐至25μl。扩增程序设置为65℃，60min。
[0178]
其中，野生型扩增体系中，引物是以叶酸代谢酶mthfr第677位的上下游区域作为靶标核酸设计得到的，具体引物序列如下(用斜体标出了与野生型叶酸代谢酶第677位互补的核苷酸碱基)：
[0179]
kf(mthfr-w-kf，seq id no：25)：
[0180]5’‑
ctgcttcggggtggcctttg-ccagcctctcctg/ra/ctgt-3
’‑
ddc
[0181]
kr(mthfr-w-kr，seq id no：26)：
[0182]5’‑
ctgaagcacttgaaggagaag-gaagaatctgtcag/rc/ctca-3
’‑
ddc
[0183]
v1f(mthfr-w-v1f，seq id no：27)：
[0184]5’‑
gggtaacctgccaat/ra/gggatg-3
’‑
ddc
[0185]
v1r(mthfr-w-v1r，seq id no：28)：
[0186]5’‑
gtgatgatgaaatcg/rg/ctcccg-3
’‑
ddc
[0187]
v2f(mthfr-w-v2f，seq id no：29)：
[0188]5’‑
cgccttgaacaggtggag-3’[0189]
v2r(mthfr-w-v2r，seq id no：30)：
[0190]5’‑
gtgatgcccatgtcggtg-3’[0191]
突变型扩增体系中，引物是以叶酸代谢酶mthfr c677t(c677t表示相对于野生型，该突变型在677位由c突变为t)第677位的上下游区域作为靶标核酸设计得到的，具体引物序列如下(用斜体标出了与突变型叶酸代谢酶第677位互补的核苷酸碱基)：
[0192]
kf(mthfr-m-kf，seq id no：25)：
[0193]5’‑
ctgcttcggggtggcctttg-ccagcctctcctg/ra/ctgt-3
’‑
ddc
[0194]
kr(mthfr-m-kr，seq id no：26)：
[0195]5’‑
ctgaagcacttgaaggagaag-gaagaatctgtcag/rc/ctca-3
’‑
ddc
[0196]
v1f(mthfr-m-v1f，seq id no：27)：
[0197]5’‑
gggtaacctgccaat/ra/gggatg-3
’‑
ddc
[0198]
v1r(mthfr-m-v1r，seq id no：31)：
[0199]5’‑
gtgatgatgaaatcg/ra/ctcccg-3
’‑
ddc
[0200]
v2f(mthfr-m-v2f，seq id no：29)：
[0201]5’‑
cgccttgaacaggtggag-3’[0202]
v2r(mthfr-m-v2r，seq id no：30)：
[0203]5’‑
gtgatgcccatgtcggtg-3’[0204]
分别合成野生型质粒(含有野生型扩增体系的靶标核酸序列)、突变型质粒(含有突变型扩增体系的靶标核酸序列)。分别以野生型质粒、突变型质粒和二者的混合物作为模板(质粒浓度均为10ng/μl)进行扩增反应和荧光检测。
[0205]
以野生型质粒作为模板时，检测结果如图6所示，反应时间30min前，野生型扩增体系出现扩增，突变型扩增体系未出现扩增。以突变型质粒作为模板时，检测结果如图7所示，反应时间30min前，突变型扩增体系出现扩增，野生型扩增体系未出现扩增。以混合质粒作为模板时，检测结果如图8所示，反应时间30min前，野生型扩增体系出现扩增，突变型扩增体系也出现扩增。因此，通过综合分析野生型扩增体系和突变型扩增体系的结果，可区分叶酸代谢酶mthfr是否发生c677t突变并判断其基因型(c/c型、c/t型和t/t型)。
[0206]
实施例7
[0207]
本实施例提供用于结核分枝杆菌的等温扩增体系，除模板不同、不含有加速引物、且各扩增体系的扩增引物具有如下的序列以外，与实施例1相同。扩增程序与实施例1相同。
[0208]
本实施例的各扩增体系的引物序列如下：
[0209]
(1)i-1扩增体系(单个rna碱基修饰)
[0210]
kf、kr同实施例1。
[0211]
(2)i-2扩增体系(2个rna碱基修饰)
[0212]
kf(mtb-ddc-2r-kf，seq id no：32)：
[0213]5’‑
ctccgaatcgtgctgaccgggttcatcgagg/ra//rg/gtac-3
’‑
ddc
[0214]
kr(mtb-ddc-2r-kr，seq id no：33)：
[0215]5’‑
ggcagcgatcagtgaggtccacttacgcacc/rg//rt/ctcc-3
’‑
ddc
[0216]
(3)i-3扩增体系(3个rna碱基修饰)
[0217]
kf(mtb-ddc-3r-kf，seq id no：34)：
[0218]5’‑
ctccgaatcgtgctgaccgggttcatcgag/rg//ra//rg/gtac-3
’‑
ddc
[0219]
kr(mtb-ddc-3r-kr，seq id no：35)：
[0220]5’‑
ggcagcgatcagtgaggtccacttacgcac/rc//rg//rt/ctcc-3
’‑
ddc
[0221]
以包含结核分枝杆菌is6110基因的质粒作为模板(质粒浓度为100pg/μl)，分别用上述扩增体系进行扩增和荧光检测，检测结果如图9所示。根据图9可知，采用单个rna碱基修饰时的出峰时间优于2个或3个rna碱基修饰时的出峰时间。
[0222]
实施例8
[0223]
本实施例提供用于结核分枝杆菌的等温扩增体系，其包括扩增引物kf 200nmol、
kr 200nmol，加速引物v1f 200nmol、v1r 200nmol、v2f 200nmol、v2r 200nmol，1μl tris(20mm)，1μl kcl(10mm)，1μl mgso4(5mm)，1μl nah2po4(10mm)，1μl tween(0.5mm)，3.5μl dntps(1.5mm)，4μl甜菜碱(1m)，1μl bst酶，1μl rnase hii(5u)，0.5μl syto-9，2μl模板，超纯水补齐至25μl。扩增程序设置为65℃，60min。
[0224]
其中，引物kf、kr、v1f、v1r、v2f、v2r是以结核分枝杆菌rpob基因的相对保守区域为靶标核酸设计得到的。为区分第516位氨基酸密码子gac》gtc，于耐药突变位点处(在引物序列中以下划线标出)设计加速引物并进行rna碱基修饰。两种扩增体系的具体引物序列如下：
[0225]
(1)i-4扩增体系(仅对扩增引物kf、kr进行rna修饰与阻断)
[0226]
kf(rpob-ddc-kf，seq id no：36)：
[0227]5’‑
cttgatcgcggcgaccaccg-gacgtggaggcga/rt/caca-3
’‑
ddc
[0228]
kr(rpob-ddc-kr，seq id no：37)：
[0229]5’‑
gttcttcggcaccagccagct-gacagtcggcgc/rt/tgtg-3
’‑
ddc
[0230]
v1f(rpob-v1f，seq id no：38)：5
’‑
ggatgttgatcaacgtctgcg-3’[0231]
v1r(rpob-v1r，seq id no：39)：5
’‑
gagccaattcatggaccagaa-3’[0232]
v2f(rpob-v2f，seq id no：40)：5
’‑
agcggatgaccacccag-3’[0233]
v2r(rpob-v2r，seq id no：41)：5
’‑
cgctcacgtgacagaccg-3’[0234]
(2)i-5扩增体系(对扩增引物kf、kr和加速引物v1f、v1r进行rna修饰与阻断)
[0235]
kf、kr同i-4扩增体系；
[0236]
v1f(rpob-ddc-v1f，seq id no：42)：
[0237]5’‑
ggatgttgatcaac/rg/tctgcg-3
’‑
ddc
[0238]
v1r(rpob-ddc-v1r，seq id no：43)：
[0239]5’‑
gagccaattcatgg/ra/ccagaa-3
’‑
ddc
[0240]
v2f、v2r同i-4扩增体系。
[0241]
分别以结核分枝杆菌rpob基因野生型质粒(516氨基酸密码子gac)和突变型质粒(516氨基酸密码子gtc)为模板(质粒浓度均为10pg/μl)，用上述两个扩增体系分别进行扩增及荧光检测，结果如图10(i-4扩增体系)和图11(i-5扩增体系)所示。检测结果表明，仅阻断扩增引物条件下，野生型质粒和突变型质粒均能正常扩增，出峰时间较早；同时阻断扩增引物和加速引物条件下，野生型质粒正常扩增，出峰时间在13min，突变型质粒出峰时间在46min。表明，同时对扩增引物和加速引物进行rna修饰和3’端阻断修饰能够区分靶标基因是否发生突变，增强反应特异性。
[0242]
实施例9
[0243]
本实施例提供用于结核分枝杆菌的等温扩增体系，除rnase hii具有以下酶量以外，与实施例1相同，其模板采用浓度为2.8
×
103cfu/ml的结核分枝杆菌的核酸提取液。扩增程序与实施例1相同。
[0244]
本实施例的各扩增体系分别具有以下rnase hii酶量：12.5mu、25mu、250mu、2.5u、5u、10u、15u。用上述扩增体系分别进行扩增和荧光检测，结果如图12所示。根据检测结果，当rnase hii酶量为5u时出峰时间最早，具有最优的检测效果。
[0245]
对比例1
[0246]
本对比例提供用于结核分枝杆菌的等温扩增体系，除模板不同、不含rnase hii，且各扩增体系具有如下的引物序列以外，与实施例1相同。扩增程序与实施例1相同。
[0247]
本对比例的各扩增体系具有以下引物序列：
[0248]
(1)ii-1扩增体系(作为对照组)
[0249]
kf(mtb-kf，seq id no：44)：
[0250]5’‑
ctccgaatcgtgctgaccgggttcatcgaggaggtac-3’[0251]
kr(mtb-kr，seq id no：45)：
[0252]5’‑
ggcagcgatcagtgaggtccacttacgcaccgtctcc-3’[0253]
v1f(mtb-v1f，seq id no：46)：
[0254]5’‑
ggatctctgcgaccatcc-3’[0255]
v1r(mtb-v1r，seq id no：47)：
[0256]5’‑
gtctacttggtgttggct-3’[0257]
v2f、v2r同实施例1。
[0258]
(2)ii-2扩增体系(仅对加速引物v1f、v1r进行rna修饰与阻断)
[0259]
kf、kr、v2f、v2r同对照组；
[0260]
v1f、v1r同实施例1。
[0261]
(3)ii-3扩增体系(仅对加速引物v2f、f2r进行rna修饰与阻断)
[0262]
kf、kr、v1f、v1r同对照组；
[0263]
v2f(mtb-ddc-v2f，seq id no：48)：
[0264]5’‑
gaaaggatggggt/rc/atgt-3
’‑
ddc
[0265]
v2r(mtb-ddc-v2r，seq id no：49)：
[0266]5’‑
gattcttcggtcg/rt/ggtc-3
’‑
ddc
[0267]
(4)ii-4扩增体系(仅对扩增引物kf、kr进行阻断修饰)
[0268]
kf、kr同实施例1；
[0269]
v1f、v1r、v2f、v2r同对照组。
[0270]
以包含结核分枝杆菌is6110基因的质粒作为模板(质粒浓度为100pg/μl)，分别用上述扩增体系进行扩增和荧光检测，对照组与ii-2、ii-3、ii-4扩增体系分别进行比较的结果依次如图13、14、15所示。
[0271]
根据比较结果可知，相对于对照组，如仅阻断加速引物v1f、v1r将使出峰时间延迟至35min，未阻断反应；仅阻断加速引物v2f、v2r将使出峰时间延迟至17min，未阻断反应；只有阻断扩增引物kf、kr时，反应不出现扩增，表明可以有效阻断反应。
[0272]
对比例2
[0273]
本对比例提供用于结核分枝杆菌的等温扩增体系，除扩增引物具有如下的阻断修饰方式以外，与对比例1中的ii-4扩增体系相同。扩增程序与实施例1相同。
[0274]
本对比例设有三个扩增体系，各扩增体系分别对扩增引物kf、kr的3’端采取了以下阻断修饰：c3 spacer、ddc、5bp错配碱基修饰。
[0275]
分别用对比例1的ii-1扩增体系(作为对照组)、本对比例的多个扩增体系对模板进行扩增和荧光检测，检测结果如图16所示。根据检测结果可知，对扩增引物3’端进行不同的阻断修饰均可有效阻断反应。
[0276]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

技术特征：
1.一种扩增体系，其特征在于，包括作为模板的核酸、引物组合、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的dna聚合酶、核糖核酸酶hii；所述引物组合用于对靶标核酸进行扩增；所述靶标核酸的3’端包括m2’序列和位于所述m2’序列5’侧的m1’序列，所述靶标核酸的5’端包括n2序列和位于所述n2序列3’侧的n1序列；其中，所述引物组合包括扩增引物组，所述扩增引物组包括上游扩增引物、下游扩增引物；所述上游扩增引物从5’到3’方向依次包括m1’序列和m2序列；所述m2序列与所述m2’序列互补，并且所述m2序列中至少有一个核苷酸为核糖核苷酸；所述上游扩增引物的3’末端具有阻断修饰；所述下游扩增引物从5’到3’方向依次包括n1’序列和n2序列；所述n1’序列与所述n1序列相互补；所述n2序列与所述n2序列的互补序列相互补，并且所述n2序列中至少有一个核苷酸为核糖核苷酸；所述下游扩增引物的3’末端具有阻断修饰。2.如权利要求1所述的扩增体系，其特征在于，所述引物组合还包括加速引物组，所述加速引物组包括第一加速引物，和/或第二加速引物；所述上游扩增引物结合所述靶标核酸后，通过链置换反应合成第一核酸链，所述第一核酸链的5’端具有m1’序列和与m1’序列相互补的m1序列，所述m1’序列与所述m1序列互补形成第一环；所述第一加速引物特异性结合所述第一核酸链的部分区域，并且所述第一加速引物特异性结合的区域位于所述上游扩增引物和下游扩增引物的区域之外；所述下游扩增引物结合所述第一核酸链后，延伸得到第二核酸链，所述第二核酸链的5’端具有n1’序列和与n1’序列互补的n1序列，所述n1’序列与所述n1序列互补形成第二环；所述第二加速引物特异性结合所述第二核酸链的部分区域，并且所述第二加速引物特异性结合的区域位于所述上游扩增引物和下游扩增引物的区域之外。3.如权利要求2所述的扩增体系，其特征在于，所述第一加速引物中至少有一个核苷酸为核糖核苷酸，所述第一加速引物的3’末端具有阻断修饰；和/或，所述第二加速引物中至少有一个核苷酸为核糖核苷酸，所述第二加速引物的3’末端具有阻断修饰。4.如权利要求1～3任一项所述的扩增体系，其特征在于，所述加速引物组还包括可选的第三加速引物、第四加速引物；所述第三加速引物、第四加速引物分别特异性所述靶标核酸或者利用所述扩增体系对靶标核酸进行扩增得到的核酸链；并且，所述第三加速引物、第四加速引物特异性结合的区域位于所述第一扩增引物、第二扩增引物、第一加速引物和第二加速引物的区域之外。5.如权利要求1～4任一项所述的扩增体系，其特征在于，所述阻断修饰包括选自双脱氧胞苷修饰、反向dt修饰、磷酸基团修饰、间臂修饰、与靶标核酸不发生互补的核酸序列中的至少一种或其他可阻断引物延伸的修饰。6.如权利要求1～4任一项所述的扩增体系，其特征在于，所述具有链置换活性的dna聚合酶还具有反转录功能；优选地，所述dna聚合酶为bst聚合酶；优选地，所述bst聚合酶具有反转录功能；
优选地，所述扩增体系中，rnase hii的酶量为5～10u；优选地，所述扩增体系还包括缓冲溶液；所述缓冲溶液包括：tris、kcl、mgso4、nah2po4、tween、甜菜碱。7.一种高特异性等温核酸扩增方法，其包括提供权利要求1～6任一项所述的扩增体系；温育所述扩增体系对所述靶标核酸进行扩增。8.如权利要求7所述的扩增方法，其特征在于，所述温育的温度为60～65℃；优选地，所述温育的时间为15～90min。9.一种靶标核酸的检测方法，其特征在于，包括：以提取自待测样本的核酸作为模板，按照权利要求7或8所述的扩增方法进行扩增并进行检测。10.如权利要求10所述的检测方法，其特征在于，所述扩增体系中还包括荧光染料；所述检测的方法包括检测荧光值；优选地，所述荧光染料选自下组：sybr green、evagreen、syto、boxto、miami yellow。

技术总结
本发明涉及一种高特异性等温核酸扩增方法，包括以下成分的扩增体系：模板、引物组合、dNTPs、具有链置换活性的DNA聚合酶、核糖核酸酶H II。靶标核酸中，M2’和N2是位于靶序列两端的特异性序列，M1’和N1为分别位于M2’序列和N2序列内侧的特异性序列。引物组合含扩增引物组和可选的加速引物组；扩增引物中，上游扩增引物KF包含M1’序列和与M2’互补的m2序列，即5


技术研发人员：申洪杰
受保护的技术使用者：广州迪澳基因科技有限公司
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/8/5