用于基因多态性检测的探针设计方法、检测方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种用于基因多态性检测的探针设计方法、检测方法和试剂盒。


背景技术：

2.基因多态性是指在同一物种的某个特定基因座上存在有2个或2个以上等位基因的现象，其本质是等位基因之间在dna序列上存在差异。造成这种dna序列差异的主要原因包括单碱基的置换、缺失、插入，以及短片段dna序列的插入和缺失等。现代医学研究发现，基因组中的多态性现象与不同个体对同一疾病的易感性，以及同一种药物对不同个体的有效性、安全性差异均有密切的关系。因此对于基因多态性的检测具有广泛的应用前景。
3.熔解曲线(melting curve)是指随温度升高dna的双螺旋结构降解程度的曲线。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。基于熔解曲线的特点，在实时荧光pcr之后引入熔解曲线分析步骤，通过熔解温度(tm)的不同来对不同的pcr扩增产物进行区分。常见的有高分辨率熔解曲线分析法(high resolution melting analysis,hrm)，多色探针熔解曲线分析法(multicolor melting curve analysis,mmca)。hrm对于荧光pcr仪器温度控制的分辨率要求很高，且使用荧光染料只能利用到仪器中的一个荧光通道，对于检测通量产生了很大的限制。mmca在面对同一多态性位点上存在多种突变类型的情况时，则缺少对每一种突变类型都进行明确区分的能力，而当面对多个多态性位点在靶序列上的位置十分接近的情况时，这些多态性位点彼此之间的干扰也极大的限制该技术的应用。
4.为此，也有很多人提出了在这两种技术上的改进，例如cn 101871007b公开了一种用标记探针进行检测和熔解曲线分析的方法，但是该技术方案需要不具5’端核酸酶活性的热稳定dna聚合酶，对技术的使用存在限制，同时，该技术的自淬灭寡核苷酸探针设计时均针对敏感型序列进行设计，对既有敏感型又有耐药型结核分支杆菌存在的临床样本进行检测时容易发生漏检，也无法在各种耐药型靶序列之间进行明确的区分。再例如cn 111850154a公开了一种多重荧光pcr熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，该技术针对每个耐药基因的野生型序列设计1条自淬灭寡核苷酸探针，从而存在以下问题：
5.1)gyra基因的野生型存在2种序列，因此其检测探针与不同野生型靶序列杂交时产生的tm不同，从而导致gyra基因野生型的tm值是一个较大的温度区间(43℃～51℃)；2)gyra基因和23s rrna基因的突变型均有多种突变类型，且突变位点十分接近，该方法所使用的探针无法对这些突变类型之间进行区分，因此只能在hex通道熔解峰tm值小于50℃时笼统的判断23s rrna基因有突变，在fam通道熔解峰tm值小于43℃时笼统的判断gyra基因有突变，但无法给出具体突变信息。
6.基于与cn 101871007 b相同的原理，该方法的检测容易发生漏检，在检测混合感染样本时，可能由于野生型靶序列对探针的结合效果更佳而导致对突变型靶序列的漏检，
当在耐药菌株在样本中的占比不足50％时，发生的可能性更高。因此，采用熔解曲线对基因多态性进行检测仍然存在检测结果精确度低等问题。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题在于采用熔解曲线对基因多态性进行检测时检测结果仍然精确度较低，针对现有技术的不足，提供一种用于基因多态性检测的探针设计方法、检测方法和试剂盒。
8.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
9.一种用于基因多态性检测的探针设计方法，所述方法包括：
10.获取具有多态性区域的靶基因序列；
11.将所述靶基因序列中的高度保守区作为引物结合区，将具有多态性位点的区域作为扩增区，设计与所述靶基因序列对应的若干个检测对，其中，每一个所述检测对包括上游引物、下游引物和探针序列，所述探针序列对应的结合区域覆盖至少一个所述多态性位点，且所述探针序列与所述靶基因序列存在非匹配位点；
12.基于预设的筛选规则，对所述探针序列进行筛选，得到与所述多态性区域对应的目标探针。
13.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，所述筛选规则包括针对任意一条所述探针序列，该探针序列与所述靶基因序列中的主要关注基因型序列的结合力强于与次要关注基因型序列的结合力。
14.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，所述筛选规则包括针对任意一条探针序列，该探针序列对应不同基因型的靶基因序列的tm值不完全相等。
15.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，所述筛选规则包括针对任意一条探针序列，如果其对应有多个主要关注基因型序列，则该探针序列对应这些基因型序列的tm值差异小于预设的差值范围。
16.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，所述筛选规则包括针对任意一条探针序列，如果其对应有多个次要关注基因型序列，则该探针序列对应这些基因型序列的tm值差异小于预设的差值范围。
17.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，所述规则包括针对每一个检测对，根据该检测对对应的扩增产物对所述探针序列的干扰，确定探针序列中的目标序列。
18.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，所述基于预设的筛选规则，对所述探针序列进行筛选，得到与所述多态性区域对应的目标探针包括：
19.针对每一个检测对，对所述检测对对应的扩增产物进行结构模拟，得到预测结构；
20.计算该检测对中的探针序列与所述预测结构的结合能力值；
21.根据所述结合能力值，对所述探针序列进行筛选。
22.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，每一个所述探针序列的5’端标记不同的荧光基团，所述探针序列的3’端标记与所述荧光基团对应的淬灭基团。
23.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，所述方法还包括将所述目标探针对应的上游引物和下游引物作为目标引物。
24.一种基因多态性的检测方法，包括：
25.获取待检测样本和待检测基因；
26.基于如上所述的探针设计方法，针对所述待检测基因设计目标探针和目标引物；
27.采用所述目标探针和所述目标引物，对所述待检测样品进行扩增，并进行熔解分析，得到熔解曲线；
28.基于预设的标准熔解曲线，对所述样品熔解曲线进行分析，得到所述待检测样品对应的基因型。
29.所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其中，所述扩增为非对称扩增。
30.一种用于检测基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的目标引物和目标探针，以及pcr反应成分、阴性质控品和阳性质控品。
31.有益效果：本发明提供一种用于基因多态性检测的探针设计方法、检测方法和试剂盒。首先获取具有多态性区域的靶基因序列，然后针对靶基因序列中的高度保守区作为引物结合区，将包含多态性位点的区域作为扩增区进行设计上游引物、下游引物以及探针序列。与常规的完全匹配探针不同，本发明采用并非完全匹配的探针序列，且该探针序列的结合区域覆盖至少一个多态性位点，因此在某一个基因型含量较高时，探针序列对该基因型的结合并非具有排他性，其他的基因型对应的探针序列仍然具有较高的结合能力，故本方案对于混合不同基因型的样本，仍然能够通过熔解曲线检测出，从而提高检测效率，减少漏检的发生。此外，本发明采用非完全匹配的探针序列，使得每一条探针都可以将待检测的多种基因型区分为两大组，再通过多个探针组合使用同时对待测样本进行检测，并根据每条探针检测结果之间的组合方式，对待测样本的基因型进行判断，该方法能够有效提高检测效率、减少探针使用数量、提高单管检测通量。
附图说明
32.图1为本发明提供的用于基因多态性检测的探针设计方法的流程图。
33.图2为本发明提供的基因多态性的检测方法中，采用探针a(左图)和探针b(右图)对幽门螺杆菌23s rrna基因野生型检测得到的标准熔解曲线。
34.图3为本发明提供的基因多态性的检测方法中，采用探针a(左图)和探针b(右图)对幽门螺杆菌23s rrna基因a2142g突变型检测得到的标准熔解曲线。
35.图4为本发明提供的基因多态性的检测方法中，采用探针a(左图)和探针b(右图)对幽门螺杆菌23s rrna基因a2142c突变型检测得到的标准熔解曲线。
36.图5为本发明提供的基因多态性的检测方法中，采用探针a(左图)和探针b(右图)对幽门螺杆菌23s rrna基因a2143g突变型检测得到的标准熔解曲线。
37.图6为本发明提供的基因多态性的检测方法中，采用探针a(左图)和探针b(右图)对幽门螺杆菌23s rrna基因野生型和a2142g突变型混合的待检测样品检测得到的样品曲线。
38.图7为本发明提供的基因多态性的检测方法中，采用探针a(左图)和探针b(右图)对幽门螺杆菌23s rrna基因野生型和a2142c突变型混合的待检测样品检测得到的样品曲线。
39.图8为本发明提供的基因多态性的检测方法中，采用探针a(左图)和探针b(右图)对幽门螺杆菌23s rrna基因野生型和a2143g突变型混合的待检测样品检测得到的样品曲
线。
具体实施方式
40.本发明提供一种用于基因多态性检测的探针设计方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
41.本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。
42.本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
43.如图1所示，本实施提供了一种用于基因多态性检测的探针设计方法，该设计方法可以集合为一个程序，由该程序自动完成，也可以为通过多个软件功能实现，用于基因多态性检测的探针设计方法包括以下步骤：
44.s11、获取具有多态性区域的靶基因序列。
45.具体地，先获取具有多态性区域的靶基因序列。自然界存在多个基因在不同个体中存在缺失突变、碱基突变或插入突变，同一种基因在不同个体中的差异为多态性，发生突变的区域称之为多态性区域。以幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori,hp)为例，其具有多态性区域的基因包括23srrna基因、gyra基因、caga基因、vaca基因等。
46.hp为胃部感染最常见的病原体，可在人类胃黏膜上皮细胞和黏液层的长期定植，几乎所有的hp感染者在组织学上均存在活动性炎性反应，可导致慢性胃炎、消化性溃疡等，常见症状包括胃上部不适感以及疼痛、胀气、厌食、恶心、呕吐以及深色或焦油色粪便等，其中约70％以上感染者无明显症状。hp是胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，并与功能性消化不良、胃黏膜相关性淋巴组织(malt)淋巴瘤和胃癌的发生密切相关，1994年世界卫生组织国际癌症研究机构已将其列为i类致癌因子。研究报道显示，幽门螺杆菌对克拉霉素耐药率整体水平为30％～50％，其中主要的耐药突变为23s rrna基因v功能域位点2142和2143碱基发生突变，具体碱基突变为a2142g、a2142c和a2143g。
47.本实施例以23s rrna基因v功能域对应的基因序列作为靶基因序列，将2142和2143两个位点作为多态性检测位点，对本实施例的探针设计方法进行说明。
48.首先获取23s rrna基因v功能域的基因序列作为靶基因序列。该基因序列能够从美国国家生物信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)数据库中获取，针对hp的这一位点，共有512条基因序列。
49.s12、将所述靶基因序列中的高度保守区作为引物结合区，将具有多态性位点的区域作为扩增区，设计与所述靶基因序列对应的若干个检测对。
50.具体地，由于靶基因序列具有多态性，因此靶基因序列中有一些碱基位点在不同的测序结果中存在差异，包括缺失、插入等。相对的，高度保守序列(highly conserved sequence)在不同的测序结果中保持高稳定性的序列，即无论是带有突变基因的序列还是正常的序列都具有的高度保守序列。因此，以高度保守区作为引物的结合位点，能够保证引物与靶基因序列的结合。同时为了检测多态性位点，多态性位点的区域应当作为在检测中扩增的对象，故将该区域作为扩增区。根据引物结合区和扩增区，设计与该靶基因序列对应的上游引物、下游引物以及探针序列。将上游引物、下游引物和对应的探针序列作为一个检测对，通过不同引物和探针的设计，可得到若干个检测对。
51.现将获取的512条基因序列进行比对分许，确定这些基因序列中的高度保守区和具有多态性位点的区域。本实施例中，采用bioedit软件对获取的靶基因序列进行对比分析，得到高度保守区。同时，本实施例是以2142和2143这两个位点作为关注的多态性位点，因此，将这两个位点的上游区域作为上游引物结合区，将下游区域作为下游引物结合区，设计上游引物、下游引物和探针序列。由于探针需要针对多态性位点，故探针序列对应的结合区域应当覆盖至少一个多态性位点。上游引物和下游引物的设计平台或软件已经非常成熟，例如primer premier、ncbi的primer-blast，故不再对如何得到上、下游引物进行描述。但是对于探针序列，与常规的设计不同，本实施例中，探针序列与所述靶基因序列存在非匹配位点。
52.由于探针序列与靶基因序列存在非匹配位点，因此在退火时，探针序列和靶基因序列结果的紧密度与完全匹配的探针序列之间存在差异，从而导致退火温度不同，在熔解曲线上，体现为熔解温度存在差异。
53.s13、基于预设的筛选规则，对所述探针序列进行筛选，得到与所述多态性区域对应的目标探针。
54.具体地，通过上述方式可得到多个检测对，但是每一个检测对基因多态性检测的精确度存在差异。虽然可以采用实验的方式进行检测，但是此方式较为繁琐，因此本实施例预先设定筛选规则，对探针序列进行筛选，以得到较优的用于基因多态性检测的目标探针。
55.筛选规则可包括探针序列的长度、碱基含量等。本实施例提供以下筛选规则，可根据靶基因的类型等进行选用或结合使用。
56.(1)针对任意一条所述探针序列，该探针序列与所述靶基因序列中的主要关注序列的结合力强于与次要关注序列的结合力。
57.具体地，主要关注序列是指某一多态性位点上设计者更加关注的基因型序列，次要关注序列即该多态性位点上除主要关注序列以外的其它基因序列。主要关注序列和次要关注序列由用户自行选择，一般主要关注序列为突变型基因对应的基因序列，而次要关注序列为野生型基因对应的基因序列。以hp的23s rrna基因v功能域对应的基因序列为例，由于突变型产生耐药性，设计探针时，每条探针的主要关注序列将包括具有a2142g突变序列、a2142c突变序列或a2143g突变序列中的2种，次要关注序列为野生型序列及未被选为主要关注序列的1种突变型序列。
58.在确定结合的碱基序列的基础上，可根据配对的碱基中gc含量等参数预测序列的结合能力。一般而言，gc含量越高，结合能力越强。
59.(2)针对任意一条探针序列，该探针序列对应不同基因型的靶基因序列的tm值不
完全相等。
60.具体地，待测样品中常常存在2种或两种以上的基因型，若对于不同的基因型靶基因序列，同一个探针序列都能结合，由于基因型之间存在差异，该探针与不同基因型序列结合的紧密度不同，因此存在不同的熔解温度(melting temperature，tm)。对于不同的基因型，某一个探针序列对应的tm不会完全相等，但是如果不同基因型对应的tm值之间差距较小，在后续的熔解曲线上会难以区分，例如设计的探针序列对应野生型的tm为45℃，对应突变型的tm为46℃，1℃的温差难以区分。
61.在熔解曲线中，两个熔解峰的tm值相差越小，越容易发生互相干扰，因此为了提高区分度，针对任意一条探针序列，该探针序列对应主要关注序列和次要关注序列的tm值之差应当大于或等于5℃。当然，根据基因的类型以及所得到的探针序列的数量，可适当上下调整tm值之间的差值范围。例如在本实施例中，将筛选后的探针序列对应主要关注序列和次要关注序列的tm差值设定为大于或等于6℃，以筛选更易区分的探针序列且提高筛选效率。
62.与此同时，针对任意一条探针序列，如果其对应有多个主要或次要关注基因型序列，则该探针序列对应这些主要或次要关注基因型序列的tm值应尽量接近。预先可设定一用于衡量tm差值的差值范围，例如设定差值范围为3℃，基于该差值范围限定多个主要基因序列之间或多个次要基因序列之间的tm值之间的差距。在本实施例中，将筛选后的探针序列对应2种主要关注序列的tm差值设定为小于或等于3℃，对应2种次要关注序列的tm差值也设定为小于或等于3℃，以筛选更易区分的探针序列且提高筛选效率。
63.本实施例中，根据野生型及3种突变型模板经扩增产生的正链扩增产物dna序列，使用the unafold服务器网站上的two-state hybridization软件(http://www.unafold.org/dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php)进行检测探针组的设计和杂交tm值评估。
64.(3)针对每一个检测对，根据该检测对对应的扩增产物对所述探针序列的干扰，确定探针序列中的目标序列。
65.具体地，pcr扩增后的单链产物是探针需要结合的对象，但是单链产物可能出现发卡、二聚体等自我配对的二级结构，若产生这些结构的区域覆盖了探针结合的区域，则探针难以与单链产物进行结合，造成探针利用率降低，从而使荧光信号偏低，影响检测灵敏度。因此，针对每一个检测对，对所述检测对对应的扩增产物进行结构模拟，得到预测结构。目前多种设计序列服务都可进行结构模拟预测，例如unafold服务器网站上的quickfold软件。
66.然后计算该检测对中的探针序列对所述预测结构的结合能力值。结合能力值是指探针序列与扩增产物形成的二级结构或三级结构结合能力的强弱值。以二级结构为例，结合能力值可根据扩增的单链中与探针序列结合的区域是否发生成发卡结构和二聚体等结构、出现这些结构的数量、dg或dc的浓度平衡常数等参数计算。例如，当探针序列结合的区域不产生发卡结构或二聚体结构时，探针容易与该序列结合，因此结合能力值大；当探针序列结合的区域产生发卡结构或二聚体结构时，探针与该序列结合难度大，因此结合能力值小。当出现的发卡结构或二聚体结构的数量越多，结合能力值越小；发卡结构或二级结构的数量越少，结合能力越强。
67.最后，根据所述结合能力值，对所述探针序列进行筛选。例如预先设定结合能力阈值，将大于结合能力阈值的结合能力值对应的探针序列可确定为目标探针。
68.预测结构主要是对二级结构进行，本实施例使用the unafold服务器网站上的quickfold软件(http://www.unafold.org/dinamelt/applications/quickfold.php)对扩增后正负两条dna单链产物的二级结构进行分析，确定结合能力值大的探针序列。
69.通过上述筛选规则中的一种或多种，筛选得到的探针序列作为目标探针，并将该探针序列对应的上游引物和下游引物作为目标引物。
70.在设计过程中，并非所有基因都能得到满足上述筛选条件的目标探针和目标引物，因此在实际设计过程中，可根据检测对的数量，对目标探针和目标引物的筛选规则进行调整，例如对于tm值差值的大小、对于结合能力值设定的阈值大小，以得到能够精确检测的目标探针和目标引物。
71.基于上述筛选规则，针对hp的23s rrna基因v功能域对应的基因序列，设计的上游引物包括cla-f，下游引物序列包括cla-r，其中，cla-f的具体序列如seq id no.:1所示，cla-r的具体序列如seq idno.:2所示。这对引物所扩增产生的野生型产物序列如seq id no.:3所示，扩增产生的a2142g突变型产物序列如seq id no.:4所示，扩增产生的a2142c突变型产物序列如seq id no.:5所示，扩增产生的a2143g突变型产物序列如seq id no.:6所示。对于目标探针，本实施例筛选得到两条目标探针，分别为序列如seq id no.:7所示的探针a，以及序列如seq id no.:8所示的探针b。
72.此外，为了对不同的基因型进行检测，每一个所述探针序列的5’端标记不同的荧光基团，所述探针序列的3’端标记与所述荧光基团对应的淬灭基团。
73.本发明采用的探针序列并非完全匹配，并且覆盖至少一个多态性位点因此，当某一个基因型的含量较高时，探针序列对该基因型的结合可能不具有排他性，但是其他的基因型对应的探针序列仍然可以具有较高的结合能力，因此，本方案可以解决混合不同基因型的样本检测的问题，通过熔解曲线检测可以提高检测效率，减少漏检的发生。此外，本发明还利用多态性位点来更加准确地检测混合样本中各个基因型的比例，从而提升检测精度。
74.此外，在相同的检测要求下，本发明可以大幅降低对探针的要求，显著提高单次检测的吞吐量，并减少工作量。以相邻2个多态性位点(位点a和位点b)上各有2种碱基序列(a1/a2和b1/b2)的情况为例，该段序列将有4种基因型(a1b1、a1b2、a2b1、a2b2)，如果要对这四种基因型实现完全区分，按照常规的探针设计方法，至少需要设计3条探针(如分别与a1b2、a2b1和a2b2基因型序列完全匹配)，分别标记不同的荧光基团，占用荧光pcr仪的3个荧光通道，才能够实现。使用本发明所提供的探针设计方法，则可以设计探针p1，以a2b1和a2b2为主要关注基因型序列，以a1b1和a1b2为次要关注基因型序列，其序列在a位点与a2序列完全匹配，与a1序列不匹配，而在b位点则与b1、b2均不匹配，从而使得p1对应a2b1和a2b2基因型序列时tm值十分接近并更高(tm1)，而对应a1b1和a1b2基因型序列时tm值十分接近并更低(tm2)。同样的，再设计探针p2，以a1b2和a2b2为主要关注基因型序列，以a1b1和a2b1为次要关注基因型序列，其序列在b位点与b2序列完全匹配，与b1序列不匹配，而在a位点则与a1、a2均不匹配，从而使得p2对应a1b2和a2b2基因型序列时tm值十分接近并更高(tm3)，而对应a1b1和a2b1基因型序列时tm值十分接近并更低(tm4)。这样，当使用探针p1和p2同时
对靶序列进行检测时，就可以通过2条探针检测tm值结果的组合方式，实现对4种基因型的完全区分(见下表)，仅需要占用荧光pcr仪的2个荧光通道即可。
[0075][0076][0077]
类似的，相邻3个多态性位点(位点a、位点b和位点c)上各有2种碱基序列(a1/a2、b1/b2和c1/c2)的情况下，该段序列将有8种基因型(
[0078]
a1b1c1、a1b1c2、a1b2c1、a1b2c2、a2b1c1、a2b1c2、a2b2c1、a2b2c2)，常规的探针设计方法需要设计7条探针才能实现对所用基因型的完全区分，由于常用的荧光pcr仪一般拥有4-5个荧光通道，因此这一检测无法在1管pcr反应体系中实现，需要至少使用2管pcr反应体系。而使用本发明所提供的探针设计方法，则可以设计探针p1，以a2b1c1、a2b1c2、a2b2c1、a2b2c2为主要关注基因型序列，其序列在a位点与a2序列完全匹配，与a1序列不匹配，而在b位点和c位点则与b1、b2、c1、c2均不匹配，从而使得p1对应a2b1c1、a2b1c2、a2b2c1、a2b2c2基因型序列时tm值十分接近并更高(tm1)，而对应a1b1c1、a1b1c2、a1b2c1、a1b2c2基因型序列时tm值十分接近并更低(tm2)。再设计探针p2，以a1b2c1、a1b2c2、a2b2c1、a2b2c2为主要关注基因型序列，其序列在b位点与b2序列完全匹配，与b1序列不匹配，而在a位点和c位点则与a1、a2、c1、c2均不匹配，从而使得p2对应a1b2c1、a1b2c2、a2b2c1、a2b2c2基因型序列时tm值十分接近并更高(tm3)，而对应a1b1c1、a1b1c2、a2b1c1、a2b1c2基因型序列时tm值十分接近并更低(tm4)。最后，设计探针p3，以a1b1c2、a1b2c2、a2b1c2、a2b2c2为主要关注基因型序列，其序列在c位点与c2序列完全匹配，与c1序列不匹配，而在a位点和b位点则与a1、a2、b1、b2均不匹配，从而使得p3对应a1b1c2、a1b2c2、a2b1c2、a2b2c2基因型序列时tm值十分接近并更高(tm5)，而对应a1b1c1、a1b2c1、a2b1c1、a2b2c1基因型序列时tm值十分接近并更低(tm6)。这样，当使用探针p1、p2和p3同时对靶序列进行检测时，就可以通过3条探针检测tm值结果的组合方式，实现对8种基因型的完全区分(见下表)，仅需要占用荧光pcr仪的3个荧光通道即可，仍然可以在1管pcr反应体系中实现。
[0079][0080]
同样的，当面对相邻2个多态性位点(位点a和位点b)上各有3种碱基序列(a1/a2/a3和b1/b2/b3)的情况，该段序列将有9种基因型(a1b1、a1b2、a1b3、a2b1、a2b2、a2b3、a3b1、a3b2和a3b3)，常规的探针设计方法需要设计8条探针才能实现对所用基因型的完全区分，需要至少使用2管pcr反应体系。而使用本发明所提供的探针设计方法，则只需要设计4条探针，其中p1探针以a2b1、a2b2、a2b3为主要关注基因型序列(在a位点与a2序列完全匹配，在b位点与3种基因型均不匹配)，p2探针以a3b1、a3b2、a3b3为主要关注基因型序列(在a位点与a3序列完全匹配，在b位点与3种基因型均不匹配)，p3探针以a1b2、a2b2、a3b2为主要关注基因型序列(在b位点与b2序列完全匹配，在a位点与3种基因型均不匹配)，p4探针以a1b3、a2b3、a3b3为主要关注基因型序列(在b位点与b3序列完全匹配，在a位点与3种基因型均不匹配)，便可以通过4条探针检测tm值结果的组合方式，实现对9种基因型的完全区分，仍然可以在1管pcr反应体系中实现。
[0081]
综合上述分析可知，对于相邻n个多态性位点各有m种碱基序列的情况，要实现基因型全区分，常规探针设计方法需要使用m
n-1条探针，其数量呈几何级数增长，而使用本发明所提供的探针设计方法，则只需要使用n
×
(m-1)条探针。因此，本发明所提供的探针设计方法在面对相邻多个多态性位点的全分型问题时，可以明显减少探针的使用量，进而提高单管检测的通量。
[0082]
本发明提供一种基因多态性的检测方法，所述方法包括：
[0083]
s21、获取待检测样本和待检测基因。
[0084]
具体地，首先获取待检测的样本，本实施例仍以hp为例，hp可以从患者的胃黏膜组织或粪便样本中分离，然后提取分离后的hp中的dna样品，得到待检测样本。
[0085]
待检测基因是用户所需要检测的基因，本实施例待检测基因即23srrna基因v功能域对应的基因序列。
[0086]
s22、利用上述的探针设计方法，针对所述待检测基因设计目标探针和目标引物。
[0087]
具体地，由于上一实施例已经具体描述了探针的设计方法，以及如何确定待检测基因对应目标探针和目标引物，因此在此不再赘述。
[0088]
本实施例采用的目标引物为cla-f(具体序列如seq id no.:1所示)和cla-r(具体序列如seq id no.:2所示)，目标探针有两个，一个为探针a(序列如seq id no.:7所示)；另一个为探针b(序列如seq id no.:8所示)。
[0089]
探针a的5’端标记fam荧光基团，3’端标记bhq1淬灭基团，以a2142g突变型和a2143g突变型序列为主要关注序列，相对于这两种序列探针a存在一个碱基错配；以野生型和a2142c突变型序列为次要关注序列，相对于这两种序列探针a存在两个碱基错配。探针b的5’端标记rox荧光基团，3’端标记bhq2淬灭基团，以a2142c突变型和a2143g突变型序列为主要关注序列，相对于这两种序列探针b具有1个碱基的错配；以野生型和a2142g突变型序列为次要关注序列，相对于这两种序列探针b具有两个碱基的错配。下表为探针a和探针b与靶序列杂交时的tm值范围：
[0090][0091]
如上表所述，探针a对于野生型和a2142c突变型的tm值接近且较低，对于a2142g突变型和a2143g突变型的tm值接近且较高，而探针b对于野生型和a2142g突变型的tm值接近且较低，对于a2142c突变型和a2143g突变型的tm值接近且较高，因此两组探针可组合使用，实现对野生型、三种不同突变型的精确检测。
[0092]
s23、采用所述目标探针和所述目标引物，对所述待检测样品进行扩增，并进行熔解曲线分析，得到样品熔解曲线。
[0093]
具体地，采用所述目标探针和所述目标引物，对所述待检测样品进行扩增，并进行熔解曲线分析，将熔解曲线分析过程中仪器采集得到的熔解曲线作为样品熔解曲线。
[0094]
扩增前先制备荧光pcr的反应体系。由于本实施例的目的并非单纯的扩增产物，而是为了检测扩增产物中的基因多态性，因此，在添加目标引物时，采用不对称的方式，扩增方式为非对称扩增，产生大量的靶标核苷酸单链。
[0095]
以体系体积25ul为例，本实施例采用的pcr体系包括：在pcr反应管中建立25μl的荧光pcr反应体系，其中包含的组分有：1
×
pcr buffer,3.0mm mgcl2，5％甘油，0.25mm dn(u)tps，400nm cla-f引物，40nm cla-r引物，200nm探针a，200nm探针b，2.5u taq dna聚合酶，0.5u udg酶。反应体系配制好后，向pcr反应管中加入一定浓度的待检测样本，震荡混匀
并短暂离心后得到单个反应体系。pcr的反应体系可根据实际的试剂，使用的taq酶等因素进行调整。
[0096]
配置pcr反应体系后将其放置在pcr仪上进行检测，以上海宏石slan-96s荧光pcr仪为例，设置如下反应程序：
[0097][0098]
其中，每一个阶段的反应时间、温度、循环次数可根据目标引物、目标探针以及扩增序列的特性进行调整，荧光检测中采用的通道由探针序列连接的荧光基团和淬灭基团决定。
[0099]
s24、基于预设的标准熔解曲线，对所述样品熔解曲线进行分析，得到所述待检测样品对应的基因型。
[0100]
具体地，为了检测目标引物和目标探针扩增后的峰形，本实施例在对待检测样品进行检测之前，先对纯合样品进行检测。如图2～5所示，针对野生型，探针a在47～48℃存在峰值，探针b在52℃存在峰值；针对a2142g突变型，探针a在54～55℃存在峰值，探针b在51℃存在峰值；针对a2142c突变型，探针a在46～47℃存在峰值，探针b在58℃存在峰值；针对a2143g突变型，探针a在55℃存在峰值，探针b在61～62℃存在峰值。将对纯合样品进行检测得到的熔解曲线作为标准熔解曲线，对待检测样品进行检测。
[0101]
本实施例为了验证检测结果的正确性，将野生型和不同的突变型基因组进行混合，作为待检测样品，然后采用探针a和探针b进行检测。
[0102]
在第一组待检测样品中，基因组为野生型和a2142g突变型混合，混合比例为9：1，检测后得到的如图6所示的样品熔解曲线。针对左图，探针a对应的样品熔解曲线中，47～48℃之间存在一个峰值，在54～55℃之间存在第二个峰值，说明待检测样品中为野生型和a2142g突变型的组合，或者野生型和a2143g突变型的组合。针对右图，探针b对应的样品熔解曲线中，52℃存在一个峰值，在其他温度区间不存在明显的检测峰，说明待检测样品中为
野生型纯合，或者野生型和a2142g突变型的组合。根据标准熔解曲线，结合图6中的两个样品熔解曲线，可判断待检测样品中包含野生型和a2142g突变型。
[0103]
在第二组待测样品中，基因组为野生型和a2142c突变型混合，混合比例为9：1，检测后得到的如图7所示的样品熔解曲线。针对左图，探针a对应的样品熔解曲线中，47～48℃之间存在一个峰值，在其他温度区间不存在明显的检测峰，说明待检测样品中为野生型纯合样品，或者野生型和a2142c突变型的组合。针对右图，探针b对应的样品熔解曲线中，52℃存在一个峰值，在58℃存在第二个峰值，说明待检测样品中为野生型和a2142c突变型的组合。根据标准熔解曲线，结合图7中的两个样品熔解曲线，可判断待检测样品中包含野生型和a2142c突变型。
[0104]
在第三组待测样品中，基因组为野生型和a2143g突变型混合，混合比例为9：1，检测后得到的如图8所示的样品熔解曲线。针对左图，探针a对应的样品熔解曲线中，47～48℃之间存在一个峰值，在55℃存在第二个峰值，说明待检测样品中为野生型和a2142g突变型的组合，或者野生型和a2143g突变型的组合。针对右图，探针b对应的样品熔解曲线中，52℃存在一个峰值，在61℃存在第二个峰值，说明待检测样品中为野生型和a2143g突变型的组合，或者a2142g突变型和a2143g突变型的组合。根据标准熔解曲线，结合图8中的两个样品熔解曲线，可判断待检测样品中包含野生型和a2143g突变型。
[0105]
除野生型与突变型的组合，突变型与突变型的组合，或者多个突变型的组合，由于其对应的tm之间存在差异，都能通过探针a和探针b检测出来，同时，对于浓度较低，例如本例中针对10％的a2142g突变型都能进行检测出来，减少漏检的可能性，提高对于基因多态性检测的精确度。
[0106]
本发明提供一种基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括前文所述的目标引物和目标探针，该目标引物和目标探针根据需要检测的基因进行设计得到，具体的设计方法在前文已经详细描述，故在此不再赘述。试剂盒中还包括pcr反应成分、阴性质控品和阳性质控品。pcr反应成分用于完成pcr，阴性质控品和阳性质控品用于对检测结果进行质量控制，以帮助使用者对检测结果的有效性进行判断。
[0107]
以针对hp的23s rrna基因v功能域位点2142和2143为例，目标引物序列如seq id no.:1和seq id no.:2所示，目标探针包括探针a和探针b，探针a序列如seq id no.:7所示，探针b序列如seq id no.:8所示。pcr反应成分包括pcr缓冲液、mgcl2等成分，阴性质控品为纯水，阳性质控品包含23s rrna基因野生型的hp基因组。
[0108]
针对其他的靶基因，目标引物和目标探针的序列存在变化，pcr反应成分、阴性质控品和阳性质控品也可根据需求变更，在此不作范围限制。
[0109]
本试剂盒能够实现对基因多态性进行精确的检测，减少漏检发生的概率，提高检测的精确度。
[0110]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种用于基因多态性检测的探针设计方法，其特征在于，所述方法包括：获取具有多态性区域的靶基因序列；将所述靶基因序列中的高度保守区作为引物结合区，将具有多态性位点的区域作为扩增区，设计与所述靶基因序列对应的若干个检测对，其中，每一个所述检测对包括上游引物、下游引物和探针序列，所述探针序列对应的结合区域覆盖至少一个所述多态性位点，且所述探针序列与所述靶基因序列存在非匹配位点；基于预设的筛选规则，对所述探针序列进行筛选，得到与所述多态性区域对应的目标探针。2.根据权利要求1所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其特征在于，所述筛选规则包括针对任意一条所述探针序列，该探针序列与所述靶基因序列中的主要关注序列的结合力强于与次要关注序列的结合力。3.根据权利要求1所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其特征在于，所述筛选规则包括针对任意一条探针序列，该探针序列对应不同基因型的靶基因序列的tm值不完全相等。4.根据权利要求2所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其特征在于，所述规则包括针对每一个检测对，根据该检测对对应的扩增产物对所述探针序列的干扰，确定探针序列中的目标序列。5.根据权利要求4所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其特征在于，所述基于预设的筛选规则，对所述探针序列进行筛选，得到与所述多态性区域对应的目标探针包括：针对每一个检测对，对所述检测对对应的扩增产物进行结构模拟，得到预测结构；计算该检测对中的探针序列与所述预测结构对的结合能力值；根据所述结合能力值，对所述探针序列进行筛选。6.根据权利要求1所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其特征在于，每一个所述探针序列的5’端标记不同的荧光基团，所述探针序列的3’端标记与所述荧光基团对应的淬灭基团。7.根据权利要求1～7中任意一项所述用于基因多态性检测的探针设计方法，其特征在于，所述方法还包括将所述目标探针对应的上游引物和下游引物作为目标引物。8.一种基因多态性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：获取待检测样本和待检测基因；基于如权利要求1～7中任意一项所述用于基因多态性检测的探针设计方法，针对所述待检测基因设计目标探针和目标引物；采用所述目标探针和所述目标引物，对所述待检测样品进行扩增，并进行熔解分析，得到熔解曲线；基于预设的标准熔解曲线，对所述样品熔解曲线进行分析，得到所述待检测样品对应的基因型。9.根据权利要求8所述的基因多态性的检测方法，其特征在于，所述扩增为非对称扩增。10.一种用于检测基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求8所述的目标引物和目标探针，以及pcr反应成分、阴性质控品和阳性质控品。

技术总结
本发明公开了一种用于基因多态性检测的探针设计方法、检测方法和试剂盒，方法包括:获取具有多态性区域的靶基因序列；将所述靶基因序列中的高度保守区作为引物结合区，将具有多态性位点的区域作为扩增区，设计与所述靶基因序列对应的若干个检测对，其中，每一个所述检测对包括上游引物、下游引物和探针序列，所述探针序列对应的结合区域覆盖至少一个所述多态性位点，且所述探针序列与所述靶基因序列存在非匹配位点；基于预设的筛选规则，对所述探针序列进行筛选，得到与所述多态性区域对应的目标探针。本发明能够提高对于基因多态性检测的精确度，减少漏检的发生，同时有效提高检测效率、减少探针使用数量、提高单管检测通量。提高单管检测通量。提高单管检测通量。


技术研发人员：申耘 吴晓卫 田洁
受保护的技术使用者：深圳市朗瑞生物科技有限公司
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/8/5