miR-7885-5p及其靶标基因PEPCK在制备白蚁解毒抑制剂及其应用

mir-7885-5p及其靶标基因pepck在制备白蚁解毒抑制剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及绿色生物防治技术领域，具体涉及白蚁体内mir-7885-5p及其靶标基因pepck在抑制白蚁解毒能力，提高白蚁生物防治效果中的应用。


背景技术：

2.白蚁是一种全球性的经济害虫，在农作物、园林树木、房屋建筑和水库堤坝等都造成严重的危害，给人类的生命财产造成巨大威胁。在白蚁的防治中化学防治是最常见的防治手段。然而，化学防治存在很多的缺点，如：容易产生抗药性、会破坏生态平衡和污染环境。并且现在很多高度污染化学药剂已经被禁用。因此，研究和开发无毒、无污染、对环境友好的防治方法成为白蚁防治领域的迫切需求之一。
3.生物防治可以作为一种良好的方法替代化学防治。在自然界中，由真菌致死的昆虫约占全部病原微生物致病导致死亡的60%，而在生物防治中生防菌是其中一种得到广泛研究和应用的方法。目前，在绿色防控技术中，绿僵菌（metarhizium）是最成功、最经济、最广泛、最安全的生防制剂之一。其寄主昆虫包括鳞翅目、膜翅目、双翅目、同翅目、半翅目等有害昆虫。这些昆虫专性致病真菌能够附着于昆虫表皮，在合适的温度下，萌发，产生芽管，并形成侵入钉。随后分泌几丁质酶，溶解昆虫体壁，并进入昆虫体腔，侵入昆虫的脂肪组织和肌肉。最后在昆虫体内繁殖，掠夺营养，产生毒素，从而导致昆虫死亡。然而，在野外利用真菌防治白蚁的效果并不理想，这是由于白蚁属于社会性昆虫，其巢内成员依赖社会免疫体系，进化出抵御真菌侵染和分解真菌毒素的防御反应。因此，如何削弱白蚁的这种防御反应是提高生防菌杀灭白蚁的关键。
4.目前，rnai在鞘翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目、直翅目和缨翅目等农业昆虫及蜚蠊目和双翅目等有害昆虫中受到了广泛的关注。此外，rnai结合生防菌协同防治有害昆虫（例如鳞翅目、双翅目和同翅目等有害昆虫）的方法得到研究者的广泛应用。这是因为，单纯通过rnai致死有害昆虫依赖高浓度双链核酸。一些低浓度核酸虽然无法致死昆虫，但是可以显著削弱昆虫环境适应能力，如免疫力、解毒能力和抗氧化能力。在本发明中，申请人以白蚁解毒机制为靶标开发的白蚁解毒抑制剂，通过抑制白蚁的解毒机制，来降低白蚁分解绿僵菌毒素的能力，增强绿僵菌对白蚁的毒性，从而提高杀虫效果。使用白蚁解毒抑制剂可延缓白蚁产生抗药性，不仅可增强真菌的杀虫效果，而且能显著降低化学杀虫剂的使用量，避免造成环境污染。本发明拟以mir-7885-5p及其靶标基因pepck来制备白蚁解毒抑制剂，从而提高生防菌对白蚁的杀灭效果。通过喂食mir-7885-5p模拟物和pepcksirna实验发现，mir-7885-5p模拟物和pepcksirna都能够增强金龟子绿僵菌对白蚁的毒性，从而提高生防菌对白蚁的杀灭效果。
5.

技术实现要素：

6.本发明的目的是提供mir-7885-5p及其靶标基因pepck的序列，和mir-7885-5p模拟物以及pepcksirna在抑制白蚁解毒能力，促进金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果中的应用。
7.一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的mir-7885-5p模拟物及pepcksirna，其特征在于，mir-7885-5p模拟物的rna序列为seq id no: 1，pepcksirna来源于pepckdsrna，pepckdsrna的rna序列为seq id no: 2。
8.所述的增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的mir-7885-5p模拟物和pepcksirna在制备白蚁解毒抑制剂上的应用。
9.所述的增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的mir-7885-5p模拟物和pepcksirna结合纳米载体在制备以mir-7885-5p模拟物和pepcksirna为活性成分的白蚁解毒抑制剂上的应用，纳米载体包括壳聚糖、脂质体、水滑石、碳量子点以及其他以保护mir-7885-5p模拟物和pepcksirna为目的的材料。
10.所述的mir-7885-5p模拟物和pepcksirna协同金龟子绿僵菌在制备用于防治白蚁的产品中的应用。
11.一种防治白蚁的方法，将mir-7885-5p模拟物和pepcksirna分别与白蚁食物混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，即可实现抑制白蚁解毒能力。
12.一种防治白蚁的方法，将mir-7885-5p模拟物和pepcksirna分别与白蚁食物混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，使用金龟子绿僵菌孢子悬浮液感染取食mir-7885-5p模拟物或pepcksirna的白蚁，实现防治。
13.一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的mir-7885-5p模拟物的制备方法，包括如下步骤：（1）将黑胸散白蚁体内mir-7885-5p，序列为seq id no: 3设计成4条单链dna，4条单链dna分别为：正义链1为seq id no: 4，正义链2为seq id no: 5，反义链1为seq id no: 6和反义链2为seq id no: 7；（2）正义链1与正义链2等量混合后，进行退火pcr得到mir-7885-5p正义链dna模板；（3）反义链1与反义链2等量混合后，进行退火pcr得到mir-7885-5p反义链dna模板；（4）将mir-7885-5p正义链dna模板与反义链dna模板等量混合，通过t7体外转录系统获得mir-7885-5p模拟物，mir-7885-5p模拟物rna序列为seq id no: 1（图1a）。
14.一种增强生防菌杀灭白蚁效果的pepcksirna的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）根据黑胸散白蚁体内pepck的dna序列seq id no: 8，设计2条扩增引物，分别为上游引物为seq id no: 9和下游引物为seq id no: 10，通过pcr扩增获得pepck基因片段，片段序列为seq id no:11。
15.（2）根据pepck基因片段seq id no:11设计含转录增强子和t7启动子的特异性引物，上游引物为seq id no:12，下游引物为seq id no:13，通过pcr扩增获得pepckdsrna模板，序列为seq id no:14。
16.（3）利用pepckdsrna模板，通过t7体外转录系统获得pepckdsrna，pepckdsrna的rna序列为seq id no: 2。
17.（4）利用rnase iii将pepckdsrna消化成作用效果更强的pepcksirna（图1b）。
18.本发明通过喂食mir-7885-5p模拟物对白蚁解毒相关基因的表达进行检测：将70微克mir-7885-5p模拟物溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为处理组；将70微克对照模拟物溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为对照组。取食2天后，对培养皿中白蚁进行解毒相关基因表达检测。结果表明，与对照组白蚁相比，取食2天mir-7885-5p模拟物的处理组白蚁体内解毒相关基因显著下调（图2）。
19.本发明通过喂食mir-7885-5p模拟物协同生防菌在白蚁生物防治中的应用：将70微克mir-7885-5p模拟物溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为处理组；将70微克对照模拟物溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为对照组。取食2天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。结果显示，与对照组染菌白蚁相比，喂食mir-7885-5p模拟物的染菌白蚁死亡率显著上升（图3）。
20.本发明通过喂食mir-7885-5p模拟物为活性成分的纳米药剂在白蚁生物防治中的应用：entranster
tm-in vivo纳米转染试剂盒是一种核酸纳米载体，能够有效保护双链核酸不被降解，提高干扰效率。参考entranster
tm-in vivo纳米转染试剂盒说明书制备含mir-7885-5p或者对照模拟物为活性成分的纳米药剂。将含50微克mir-7885-5p模拟物的纳米药剂溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为处理组；将含50微克对照模拟物的纳米药剂溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为对照组。取食2天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。结果显示，与对照组染菌白蚁相比，取食mir-7885-5p模拟物纳米药剂的染菌白蚁的死亡率显著上升（图4）。
21.本发明通过喂食pepcksirna对白蚁解毒基因pepck的表达进行检测：将20微克pepcksirna溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为处理组；将20微克对照sirna溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为对照组。取食1天后，对培养皿中白蚁进行pepck基因表达检测。结果表明，与对照组白蚁相比，取食2天pepcksirna的处理组白蚁体内解毒基因pepck显著下调（图5）。
22.本发明通过喂食pepcksirna协同生防菌在白蚁生物防治中的应用：将20微克pepcksirna溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为处理组；将20微克对照sirna溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养12头白蚁的培养皿中供白蚁取食，作为对照组。取食1天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。结果显示，与对照组染菌白蚁相比，喂食pepcksirna的染菌白蚁死亡率显著上升（图6）。
23.综上所述，mir-7885-5p模拟物和pepcksirna能够有效抑制白蚁解毒能力，显著提高了金龟子绿僵菌对白蚁的防治效果。
24.本发明有以下4个明显的优点：1. 生防菌的毒力和昆虫的解毒能力很大程度上影
响生物防治的效果，mir-7885-5p以及pepck直接作用于昆虫解毒能力，因而在提高生物防治效果方面更具针对性；2.mir-7885-5p模拟物和pepcksirna均为小分子双链rna，制备简单，效率更高，对环境友好，对人畜安全；3.mir-7885-5p模拟物和pepcksirna能够通过喂食进入白蚁体内发挥作用，使用方法简单；4.与金龟子绿僵菌结合使用，mir-7885-5p模拟物和pepcksirna能够显著提高生防菌对白蚁的杀灭效果，具有良好的应用前景。
附图说明
25.图1：mir-7885-5p模拟物和pepcksirna的凝胶电泳图。a.mir-7885-5p模拟物电泳条带；b.pepcksirna电泳条带。
26.图2：mir-7885-5p模拟物对解毒相关基因表达的影响。mir-7885-5p模拟物对a.线粒体nad(p)transhydrogenase基因，b.multiplec2andtransmembranedomain-containingprotein1基因，c.脑同工酶proteinkinasec基因，d.hypoxiaup-regulatedprotein1基因，e.elongationfactor2基因和f.pepck（phosphoenolpyruvatecarboxykinase[gtp]）基因的抑制作用。
[0027]
图3：mir-7885-5p模拟物对染菌白蚁存活率的影响。
[0028]
图4：取食mir-7885-5p模拟物纳米药剂对染菌白蚁存活率的影响。
[0029]
图5：pepcksirna对白蚁体内解毒基因pepck的影响。
[0030]
图6：pepcksirna对染菌白蚁存活率的影响。
具体实施方式
[0031]
实施例1mirna-7885-5p模拟物的制备过程根据黑胸散白蚁体内mir-7885-5p的序列seqidno:3设计成4条单链dna，分别为：正义链1为seqidno:4，正义链2为seqidno:5，反义链1为seqidno:6和反义链2为seqidno:7。将2微升100μm的正义链1与2微升100μm的正义链2混合，进行退火pcr获得mirna-7885-5p正义链模板。将2微升100μm的反义链1与2微升100μm的反义链2混合，进行退火pcr获得mirna-7885-5p反义链模板。随后将2.5微升上述mirna-7885-5p正义链模板与2.5微升mirna-7885-5p反义链模板混合，利用20微升t7体外转录系统获得mirna-7885-5p模拟物。稀释原溶液并进行凝胶电泳检测（图1a）。
[0032]
实施例2mirna-7885-5p模拟物对白蚁体内解毒相关基因表达的影响将70微克mir-7885-5p模拟物溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将70微克gfpsirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食2天后，利用rt-qpcr技术检测处理组和对照组白蚁体内解毒相关基因的表达量。如图2所示，与对照组相比，mir-7885-5p模拟物显著抑制5种白蚁体内解毒相关基因的表达（p《0.05,wilcoxontest）。
[0033]
实施例3mirna-7885-5p模拟物对染菌白蚁死亡率的影响将70微克mir-7885-5p模拟物溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5cm的
圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将70微克gfpsirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食2天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分，放回3.5厘米培养皿中继续培养10天。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。如图3所示，与对照组[lt
50
: 8.074 (7.448-8.885)]相比，处理组[lt
50
: 4.527 (2.824-5.836)]染菌白蚁死亡率显著升高（χ2= 11.558, p《0.01, kaplan
–
meier method），表明mir-7885-5p模拟物能够提高生防菌杀灭白蚁的能力。
[0034]
实施例4 mirna-7885-5p模拟物为活性成分的纳米药剂对染菌白蚁死亡率的影响利用entranster
tm-in vivo纳米转染试剂盒，参考说明书并略微进行修改，首先使用无酶水稀释10微升纳米颗粒原液到40微升，然后使用无酶水稀释50微克mirna-7885-5p模拟物到30微升，最后将两种稀释液混合，立即斡旋30秒，室温静置10分钟，制备成mir-252b模拟物为活性成分的纳米药剂，待用。采用相同的方法，将mirna-7885-5p模拟物替换为gfpsirna，制备成对照纳米药剂，待用。
[0035]
将上述50微克mirna-7885-5p模拟物为活性成分的纳米药剂滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将上述50微克gfpsirna的对照纳米药剂滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食2天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分，放回3.5厘米培养皿中继续培养10天。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。如图4所示，与对照组[lt
50
: 6.959 (5.494-9.141)]相比，处理组[lt
50
: 4.759 (3.628-5.727)]染菌白蚁死亡率显著升高（χ2= 7.963, p《0.01, kaplan
–
meier method），表明mirna-7885-5p模拟物为活性成分的纳米药剂能够提高生防菌杀灭白蚁的能力。
[0036]
实施例5 pepcksirna的制备过程根据黑胸散白蚁体内pepck的dna序列seq id no: 8，设计2条扩增引物，上游引物为seq id no: 9和下游引物为seq id no: 10，通过pcr扩增获得pepck基因片段，片段序列为seq id no:11。根据pepck基因片段seq id no:11设计含转录增强子和t7启动子的特异性引物，上游引物为seq id no:12，下游引物为seq id no:13，通过pcr扩增获得pepckdsrna模板。随后利用1微克pepckdsrna模板，通过20微升t7体外转录系统获得pepckdsrna。最后利用100微升rnase iii体系将100微克pepckdsrna消化20分钟，酶剪切成作用效果更强的pepcksirna。稀释原溶液并进行凝胶电泳检测（图1b）。
[0037]
实施例6 pepcksirna对白蚁解毒相关基因pepck表达的影响将20微克pepcksirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5cm的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将20微克gfpsirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培
养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食1天后，利用rt-qpcr技术检测处理组和对照组白蚁体内解毒相关基因pepck的表达量。如图5所示，与对照组相比，pepcksirna显著抑制pepck基因的表达（p《0.05, wilcoxon test）。
[0038]
实施例7 pepcksirna对染菌白蚁死亡率的影响将20微克pepcksirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5cm的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为处理组（处理组3个重复，共36头白蚁）。将20微克gfpsirna溶解至70微升无酶水中，随后滴加到直径1.5厘米的圆形滤纸片上，将其完全湿润，作为食物放入直径3.5厘米的圆形培养皿中，饲养12头黑胸散白蚁，作为对照组（对照组3个重复，共36头白蚁）。取食1天后，用金龟子绿僵菌孢子悬浮液（浓度106个孢子/毫升）浸湿上述取食后的白蚁，滤纸迅速吸干体表多余水分，放回3.5厘米培养皿中继续培养10天。每天记录处理组和对照组组内染菌白蚁的死亡个数，共记录10天。如图6所示，与对照组[lt
50
: 7.657 (6.246-10.305)]相比，处理组[lt
50
: 2.700 (2.457-2.943)]染菌白蚁死亡率显著提高（χ2= 34.479, p《0.01, kaplan
–
meier method），表明pepcksirna能够显著提高生防菌杀灭白蚁的能力。

技术特征：
1.一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的mir-7885-5p模拟物或pepck sirna，其特征在于，mir-7885-5p模拟物的rna序列为seq id no: 1；pepck sirna来源于pepck dsrna，pepck dsrna的rna序列为seq id no: 2。2. 权利要求1所述的增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的mir-7885-5p模拟物或pepck sirna在制备白蚁解毒抑制剂上的应用。3. 权利要求1所述的增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的mir-7885-5p模拟物或pepck sirna结合纳米载体在制备以mir-7885-5p模拟物和pepck sirna为活性成分的白蚁解毒抑制剂上的应用，纳米载体包括壳聚糖、脂质体、水滑石、碳量子点或其他以保护mir-7885-5p模拟物和pepck sirna为目的的材料中的任意一种。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的白蚁解毒抑制剂协同金龟子绿僵菌在制备用于防治白蚁的产品中的应用。5. 一种防治白蚁的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的mir-7885-5p模拟物或pepck sirna分别与白蚁食物混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，实现抑制白蚁解毒能力。6. 一种防治白蚁的方法，其特征在于，按照权利要求5所述的方法利用mir-7885-5p模拟物或pepck sirna分别喂食白蚁后，使用金龟子绿僵菌孢子悬浮液感染喂食后的白蚁，实现防治。7.一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的mir-7885-5p模拟物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将黑胸散白蚁体内mir-7885-5p，序列为seq id no: 3设计成4条单链dna，4条单链dna分别为：正义链1为seq id no: 4，正义链2为seq id no: 5，反义链1为seq id no: 6和反义链2为seq id no: 7；（2）正义链1与正义链2等量混合后，进行退火pcr得到mir-7885-5p正义链dna模板；（3）反义链1与反义链2等量混合后，进行退火pcr得到mir-7885-5p反义链dna模板；（4）将mir-7885-5p正义链dna模板与反义链dna模板等量混合，通过t7体外转录系统获得mir-7885-5p模拟物，mir-7885-5p模拟物rna序列为seq id no: 1。8.一种增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁效果的pepck sirna的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）根据黑胸散白蚁体内pepck的dna序列seq id no: 8，设计2条扩增引物，分别为上游引物为seq id no: 9和下游引物为seq id no: 10，通过pcr扩增获得pepck基因片段，片段序列为seq id no:11；（2）根据pepck基因片段seq id no:11设计含转录增强子和t7启动子的特异性引物，上游引物为seq id no:12，下游引物为seq id no:13，通过pcr扩增获得pepck dsrna模板，序列为seq id no:14；（3）利用pepck dsrna模板，通过t7体外转录系统获得pepck dsrna，pepck dsrna的rna序列为seq id no: 2；（4）利用rnase iii将pepck dsrna消化成作用效果更强的pepck sirna。

技术总结
一种miR-7885-5p及其靶标基因PEPCK在制备白蚁解毒抑制剂及其应用。两种相互联系且能够用于增强白蚁生物防治效果的RNA序列，即miR-7885-5p及其靶标基因PEPCK，其双链RNA能够显著抑制白蚁解毒能力，增强金龟子绿僵菌杀灭白蚁的效果。利用绿僵菌感染取食miR-7885-5p模拟物的白蚁，白蚁死亡率显著上升。基于PEPCK序列设计并合成PEPCK dsRNA，利用RNase III将PEPCK dsRNA消化成作用效果更强的PEPCK siRNA。白蚁取食PEPCK siRNA后，解毒相关基因PEPCK表达量显著下降。利用绿僵菌感染取食PEPCK siRNA后的白蚁，白蚁死亡率显著上升。白蚁死亡率显著上升。白蚁死亡率显著上升。


技术研发人员：刘龙 王东槐 汤清波 雷彩燕 黄求应 张元臣 张鑫
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/8/5