一种重组人甲状腺球蛋白及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种重组人甲状腺球蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.甲状腺球蛋白(tg)是一种潜在的自身抗原，当进入血液后可刺激机体产生抗甲状腺球蛋白抗体(tgab)。tgab是甲状腺疾病中首先发现的自身抗体，具有高度种属特异性，是诊断自身免疫甲状腺疾病的常用指标。在自身免疫性甲状腺炎患者中可发现tgab浓度升高，出现频率是70％-80％。graves病tgab的阳性率约为60％，经治疗后滴度下降提示治疗有效，如果滴度持续较高，易发展成黏液性水肿。甲状腺功能亢进症患者测得tgab阳性且滴度较高，提示抗甲状腺药物治疗效果不佳，且停药后易复发。甲状腺癌与tgab呈一定的相关性，阳性率可达13％-65％，tgab值的升高是肿瘤恶化的一种标志。
3.抗甲状腺球蛋白抗体的靶抗原甲状腺球蛋白是一种由甲状腺上皮细胞合成和分泌的可溶性碘化糖蛋白，分子量660kd，由2748个氨基酸组成。tgab是tg进入血液后产生的抗体，通常存在于自身免疫性甲状腺疾病的病人体内。自身免疫性甲状腺疾病(aitd)是一种十分常见的甲状腺疾病，主要包括慢性/淋巴细胞性甲状腺炎(hashimoto式病)、毒性弥漫性甲状腺肿(graves病)，其共同特征是血液中存在多种甲状腺自身抗体，最主要的甲状腺自身抗体为抗甲状腺球蛋白抗体(tgab)和抗甲状腺过氧化物酶抗体(tpo-ab)。患有hashimoto病、graves病、慢性甲状腺炎、亚急性甲状腺炎、甲状腺机能亢进等疾病的患者，血清tgab水平升高。某些患有非自身免疫甲状腺疾病，如类风湿疾病、红斑狼疮、恶性贫血、i型糖尿病等疾病的病人，以及健康人特别是女人和老年人体中也可能检测到tgab。
4.综上所述，现今tgab检测不但是针对患有甲状腺疾病患者的检测，甚至已成为常规体检中重要的一项检测指标。市面上也有重组的人甲状腺球蛋白在售，但多为大肠杆菌表达的甲状腺球蛋白片段，如果将大肠杆菌表达的人甲状腺球蛋白制备成tgab检测试剂，可预期其会造成临床样本漏检现象。国内外ivd生产的tgab试剂中的人甲状腺球蛋白原料多为人甲状腺组织中提取，能够避免前者的临床样本漏检现象。但是，存在这样一个问题：人甲状腺组织来源受限，导致人甲状腺球蛋白原料成本高，这也是tgab检测价格高的一个重要因素。


技术实现要素：

5.本发明解决了体外表达人甲状腺球蛋白的技术问题，在很大程度上降低人甲状腺球蛋白原料成本，以期实现降低tgab检测价格的技术效果。
6.为解决上述问题，本发明提供一种重组人甲状腺球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
7.s10：获取人甲状腺球蛋白基因序列的cds序列；
8.s20：优化并合成cds序列，获得优化后的cds序列；
9.s30：构建重组表达载体：将优化后的cds序列利用nhe i和asc i双酶切后，插入nhe i和asc i双酶切的哺乳动物细胞表达载体中，获得重组表达载体；
10.s40：目的蛋白的表达：将重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中，以制备目的蛋白，离心收集细胞上清液；
11.s50：分离纯化目的蛋白：将细胞上清液浓缩后，进行镍柱亲和纯化，再用分子筛色谱柱分离出660kd-700kd分子量区间的蛋白，获得重组人甲状腺球蛋白。
12.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：cds为编码序列，对其进行优化后，再构建重组表达载体，通过转染哺乳动物细胞系制备重组人甲状腺球蛋白，蛋白制备简单，蛋白来源稳定，无需从人甲状腺组织中提取，且上述方法能够有效缩短蛋白制备周期，并有效降低人工成本和物料成本。
13.在本发明的一个实例中，合成cds序列包括以下步骤：
14.s21：在cds序列的上游依次添加nhe i限制性酶切位点、kozak序列和atg，在cds序列的下游依次添加6
×
his标签和asc i限制性酶切位点，获得合成后的cds序列。
15.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：kozak序列被广泛应用于表达载体的构建中，atg为起始密码子，在cds序列的上游和下游分别添加限制性酶切位点，以便插入同样酶切的表达载体，进而构建重组表达载体。并且，添加6个组氨酸编码序列，形成标签his-tag，便于利用镍柱对制备的重组人甲状腺球蛋白进行分离纯化。
16.在本发明的一个实例中，优化cds序列为针对哺乳动物细胞系进行密码子优化，优化后的cds序列如seq id no：1所示。
17.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：针对哺乳动物细胞系进行密码子优化，密码子优化能够提高蛋白质的翻译效率，从而提高蛋白的表达量。
18.在本发明的一个实例中，哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤细胞、犬肾内皮细胞、小鼠脾细胞、人胚肾细胞、人体细胞杂交细胞中的任一种。
19.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：哺乳动物细胞系能够完成糖基化修饰和蛋白的正确折叠等复杂的翻译后修饰功能，因而表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方便最接近天然的人甲状腺球蛋白。并且上述哺乳动物细胞系获取容易，能够被广泛应用于目的蛋白表达。
20.在本发明的一个实例中，转染为瞬时转染或稳定转染。
21.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：哺乳动物细胞表达系统是以哺乳动物细胞作为宿主进行蛋白表达生产，具有转录后修饰，蛋白正确折叠与装配等功能，表达的蛋白更接近天然状态，是活性蛋白因子及各类受体蛋白的优异表达系统。利用哺乳动物表达体系生产蛋白通常有两种方式：瞬时转染与稳定转染，这两者都是将目的基因转染至特定哺乳动物细胞内，进而表达得到目的蛋白。瞬时转染的优势有：能够快速生产得到微量至中量的重组蛋白；实验成本低；一个宿主可以带有多个拷贝，表达效率高。稳定转染的优势有：目的基因不会随着细胞传代而消失，进而能够长期稳定地生产目的蛋白。
22.在本发明的一个实例中，稳定转染制备目的蛋白包括以下步骤：
23.s61：将重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中；
24.s62：用抗性筛选试剂筛选出阳性克隆；
25.s63：对阳性克隆连续培养，离心收集培养的细胞上清液。
26.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：抗性筛选试剂能够用于筛选表达特定抗性基因的稳定细胞株，进而能够长期稳定生产目的蛋白，且得到稳转株之后后续生产蛋白的成本降低。
27.在本发明的一个实例中，瞬时转染制备目的蛋白包括以下步骤：
28.s71：将重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中；
29.s72：将转染后的细胞一次培养，离心收集培养的细胞上清液。
30.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用上述方法制备目的蛋白，表达效率高，且操作便捷。
31.在本发明的一个实例中，转染方法包括脂质体转染，pei转染，电转染。
32.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：脂质体转染操作简便，适合转染各种细胞；pei转染与脂质体转染类似，但是其具有更低的毒性，操作简单，适用性广；电转染适用性广，适用于质粒和几十kb的基因组片段。
33.本发明还提供一种重组人甲状腺球蛋白，采用上述任一实例的制备方法获得，且重组人甲状腺球蛋白为人甲状腺球蛋白全长蛋白。
34.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用上述任一实例的制备方法获得的重组人甲状腺球蛋白，蛋白纯度≥0.99，纯度高。
35.本发明还提供如上述实例所述的重组人甲状腺球蛋白的应用，应用于制备抗人甲状腺球蛋白检测试剂。
36.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：采用上述任一实例的制备方法降低了重组人甲状腺球蛋白的制备成本，因此使用其来制备抗人甲状腺球蛋白检测试剂，能够在原料上降低抗人甲状腺球蛋白检测试剂的生产成本。抗人甲状腺球蛋白检测试剂包括放射性免疫法检测试剂、化学发光法检测试剂、酶联免疫法检测试剂、比浊法检测试剂、浊度法检测试剂、免疫层析法检测试剂。其中，化学发光法检测试剂包括磁微粒化学发光法检测试剂、酶促化学发光法检测试剂、电化学发光法检测试剂；比浊法检测试剂包括免疫比浊法、散射比浊法、投射比浊法、光扫描比浊法、乳胶比浊法、光电比浊法。
37.本发明还提供一种抗人甲状腺球蛋白检测试剂盒，采用重组人甲状腺球蛋白获得。
38.与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：重组的人甲状腺球蛋白全长蛋白，是由稳转或瞬转的哺乳动物细胞系制备，蛋白制备简单，蛋白来源稳定，且全长蛋白配制成的试剂盒避免了tgab检测出现假阴性的情况，且其临床检测特异性高。
附图说明
39.图1为本发明实施例提供的tg-pires表达质粒酶切后的电泳图。
40.图2为本发明实施例提供的tg镍纯化电泳图。
41.图3为本发明实施例提供的sec-hplc检测tg蛋白组分的结果分析图。
42.图4为本发明实施例提供的sec-hplc检测tg蛋白组分的结果分析图。
43.图5为本发明实施例提供的tg蛋白制备的试剂与在售美康试剂检测临床样本的线性关系图。
具体实施方式
44.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。
45.本发明提供一种重组人甲状腺球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
46.s10：获取人甲状腺球蛋白基因序列的cds序列；
47.s20：优化并合成cds序列，获得优化后的cds序列；
48.s30：构建重组表达载体：将优化后的cds序列利用nhe i和asc i双酶切后，插入nhe i和asc i双酶切的哺乳动物细胞表达载体中，获得重组表达载体；
49.s40：目的蛋白的表达：将重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中，以制备目的蛋白，离心收集细胞上清液；
50.s50：分离纯化目的蛋白：将细胞上清液浓缩后，进行镍柱亲和纯化，再用分子筛色谱柱分离出660kd-700kd分子量区间的蛋白，获得重组人甲状腺球蛋白。
51.具体的，cds为编码序列，对其进行优化后，再构建重组表达载体，通过转染哺乳动物细胞系制备目的蛋白，即重组人甲状腺球蛋白，蛋白制备简单，蛋白来源稳定，且上述方法可有效缩短蛋白制备周期，有效降低人工成本和物料成本。
52.进一步的，合成cds序列包括以下步骤：
53.s21：在cds序列的上游依次添加nhe i限制性酶切位点、kozak序列和atg，在cds序列的下游依次添加6
×
his标签和asc i限制性酶切位点，获得合成后的cds序列。
54.具体的，kozak序列被广泛应用于表达载体的构建中，atg为起始密码子，在cds序列的上游和下游分别添加限制性酶切位点，以便插入同样酶切的表达载体，进而构建重组表达载体。并且，添加6个组氨酸编码序列，形成标签his-tag，便于利用镍柱对制备的重组人甲状腺球蛋白进行分离纯化。
55.进一步的，优化cds序列为针对哺乳动物细胞系进行密码子优化，优化后的cds序列如seq id no：1所示。
56.具体的，针对哺乳动物细胞系进行密码子优化，密码子优化能够提高蛋白质的翻译效率，从而提高蛋白的表达量。
57.进一步的，哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤细胞、犬肾内皮细胞、小鼠脾细胞、人胚肾细胞、人体细胞杂交细胞中的任一种。
58.具体的，选用的哺乳动物细胞系还可以是上述细胞系进行遗传改造的细胞系中的任一种。
59.进一步的，转染为瞬时转染或稳定转染。
60.具体的，哺乳动物细胞表达系统是以哺乳动物细胞作为宿主进行蛋白表达生产，具有转录后修饰，蛋白正确折叠与装配等功能，表达的蛋白更接近天然状态，是活性蛋白因子及各类受体蛋白的优异表达系统。利用哺乳动物表达体系生产蛋白通常有两种方式：瞬时转染与稳定转染，这两者都是将目的基因转染至特定哺乳动物细胞内，进而表达得到目的蛋白。瞬时转染的优势有：能够快速生产得到微量至中量的重组蛋白；实验成本低；一个宿主可以带有多个拷贝，表达效率高。稳定转染的优势有：目的基因不会随着细胞传代而消失，进而能够长期稳定地生产目的蛋白。
61.进一步的，稳定转染制备目的蛋白包括以下步骤：
62.s61：将重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中；
63.s62：用抗性筛选试剂筛选出阳性克隆；
64.s63：对阳性克隆连续培养，离心收集培养的细胞上清液。
65.具体的，抗性筛选试剂包括g418，抗性筛选试剂能够用于筛选表达特定抗性基因的稳定细胞株，进而能够长期稳定生产目的蛋白，且得到稳转株之后，后续生产蛋白的成本降低。
66.进一步的，瞬时转染制备目的蛋白包括以下步骤：
67.s71：将重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中；
68.s72：将转染后的细胞一次培养，离心收集培养的细胞上清液。
69.具体的，采用上述方法制备目的蛋白，表达效率高，且操作便捷。
70.进一步的，转染方法包括脂质体转染，pei转染，电转染。
71.脂质体转染操作简便，适合转染各种细胞；pei转染与脂质体转染类似，但是其具有更低的毒性，操作简单，适用性广；电转染适用性广，适用于质粒和几十kb的基因组片段。
72.进一步的，本发明还提供一种重组人甲状腺球蛋白，采用上述任一实例的制备方法获得，且重组人甲状腺球蛋白为人甲状腺球蛋白全长蛋白。
73.采用上述任一实例的制备方法获得的重组人甲状腺球蛋白，蛋白纯度≥0.99，纯度高。
74.进一步的，本发明还提供如上述实例所述的重组人甲状腺球蛋白的应用，应用于制备抗人甲状腺球蛋白检测试剂。
75.采用上述任一实例的制备方法降低了重组人甲状腺球蛋白的制备成本，因此使用其来制备抗人甲状腺球蛋白检测试剂，能够在原料上降低抗人甲状腺球蛋白检测试剂的生产成本。抗人甲状腺球蛋白检测试剂包括放射性免疫法检测试剂、化学发光法检测试剂、酶联免疫法检测试剂、比浊法检测试剂、浊度法检测试剂、免疫层析法检测试剂。其中，化学发光法检测试剂包括磁微粒化学发光法检测试剂、酶促化学发光法检测试剂、电化学发光法检测试剂；比浊法检测试剂包括免疫比浊法、散射比浊法、投射比浊法、光扫描比浊法、乳胶比浊法、光电比浊法。
76.进一步的，本发明还提供一种抗人甲状腺球蛋白检测试剂盒，采用重组人甲状腺球蛋白获得。
77.重组的人甲状腺球蛋白全长蛋白，是由稳转或瞬转的哺乳动物细胞系制备，蛋白制备简单，蛋白来源稳定，且全长蛋白配制成的试剂盒避免了tgab检测出现假阴性的情况，且其临床检测特异性高。
78.实施例一：
79.在一个具体实施例中，采用pires表达载体构建重组表达载体。
80.tg-pires哺乳动物细胞表达载体的构建
81.从ncbi基因库中找到人甲状腺球蛋白基因序列(nm_003235)，并摘取其中的cds序列，针对cho细胞系进行密码子优化，密码子优化后的序列如seq id no：1所示。
82.密码子优化后的基因序列由上海生工生物工程有限公司人工合成，并克隆到pires表达载体的mcs中，构建成tg-pires表达质粒。tg-pires表达质粒用nhe i/asc i限制
性内切酶酶切鉴定插入情况，电泳图参见图1，可清楚的看到两个条带，其分别为tg基因条带和pires载体条带。
83.实施例二：
84.在实施例一的基础上，进行tg-pires质粒转染及表达蛋白的阳性细胞筛选。
85.具体的，转染为稳定转染。
86.质粒转染及细胞加压筛选：复苏cho-s悬浮细胞系，培养细胞至细胞数约8
×
105，细胞活率≥98％，1000rpm/min离心5min；用opti培养液悬浮细胞，培养液为5-10ml，并进行细胞计数，1000rpm/min离心5min；用电转液悬浮细胞，电转液添加量按390μl中有1
×
107个细胞添加，然后取390μl悬浮好的转染液放入电转杯中，并在电转杯中加入20μg tg-pires质粒，轻柔吹打，放入电转仪点击(一般使用270v，电击2次)，在125ml药瓶中加入25ml opti培养液，将电转液加入到摇瓶中，进行37℃培养箱培养；第二天观察细胞并计数，细胞数超过3
×
105，活率大于80％以上时，加1％g418加压筛选，细胞继续放37℃培养箱培养，并每天进行细胞计数，等细胞数涨到1
×
106，在培养的细胞中加100nm的氨甲喋吟(mtx)加压筛选。细胞继续进行37℃培养箱培养，并每天进行细胞计数，等细胞数再次涨到1
×
106，进行部分细胞冻存。
87.冻存方法：取10ml新鲜培养基将细胞重悬，然后将10ml细胞悬液加入到50ml离心管中，取约500μl细胞悬液进行计数并计算细胞总数，将细胞在1000rpm下，离心10min，然后取适量冻存液(7％二甲基亚砜、93％sfm4cho培养基)将细胞吹打均匀，使细胞密度达到300万/ml。按每管300万/支分装细胞，将分装并标记好的冻存管放于4℃冰箱中静置2h，然后将其塞入棉包中，-80℃冰箱放置过夜，第2d将其放入液氮罐中长期保存。
88.阳性单克隆细胞筛选：将进行过100nm mtx加压后活率复苏的细胞，取100μl，活率复苏到98％以上的细胞稀释到96孔板中，保证每孔细胞数≤2个，96孔板细胞连续培养1周，取细胞上清，用美康生物生产的人甲状腺球蛋白检测试剂盒检测每孔上清中抗原表达水平，对有表达的细胞孔进行第二次亚克隆，或进行第三亚克隆，直到细胞阳性率为100％，进行细胞培养放大及冻存。
89.实施例三：
90.在实施二的基础上，进行重组tg蛋白表达及分离纯化。
91.tg细胞上批次表达：将tg细胞用30ml、cd18培养液复苏到125ml的培养瓶，放37℃摇床中24小时后换液。调整细胞状态，直至细胞活率＞98％，准备批次培养。接种细胞1
×
106，培养约3天，当细胞数约4
×
106左右的情况下，用200ml的培养液扩培到500ml的培养瓶，继续在37℃培养。待500ml的培养瓶的细胞数达到4
×
106左右(一般第二天)，用800ml的培养液扩培到1600ml的培养瓶，继续在37℃培养。待细胞数达到4
×
106～6
×
106，放到30℃开始批次培养。细胞一直放于30℃培养，每隔24h取样，进行细胞计数并作生化分析，按体积进行补料。采取补料和补糖的方式进行补料，参见表1，直到细胞数开始下降，活率低于80％左右，进行细胞收液，取上清准备纯化。
92.表1细胞上批次培养过程中补料和补糖方式
[0093][0094]
重组tg蛋白分离纯化：将已收取的表达细胞上清，先1500rpm/min离心取上清，再10000rpm/min离心取上清，上清经膜包浓缩至100ml体积，将浓缩后的细胞上清透析到0.01m ph7.4磷酸盐缓冲液中，准备过柱。取150ml镍填料装柱，并用0.01m ph7.4磷酸盐缓冲液平衡5个柱体积后，开始进行上样，采用泵蠕动上样，上样流速控制在0.5ml/min，为保证tg蛋白全部挂住，通常会将流穿液再次上样。上样完毕后，用0.01m ph7.4磷酸盐，加10mm咪唑的缓冲液洗柱8个柱体积，再依次用50mm、80mm、120mm和500mm咪唑磷酸盐缓冲液洗脱蛋白，并进行sds-page电泳，电泳结果图参见图2a。通过80mm和120mm咪唑洗脱液可清晰地看到330kd的tg单体目的带，将80mm和120mm咪唑磷酸盐缓冲液洗脱液混合后浓缩，浓缩后进行sds-page电泳，电泳结果图参见图2b，tg单体纯度＞90％。
[0095]
具体的，图2a中各通道分别为：1：marker；2：上样前样品；3：上样流穿样品；4：50mm咪唑洗脱液；5：80mm咪唑洗脱液；6：120mm咪唑洗脱液；7：500mm咪唑洗脱液。
[0096]
具体的，图2b中各通道分别为：1：marker；2：tg镍纯化蛋白。
[0097]
为更精准的分析tg蛋白纯度，将tg蛋白进行sec-hplc测定，测定结果参见图3，通过图3可见3种组分，峰1分子量约977.44kd，峰面积占比18.77％，峰2分子量约为677.03kd，峰面积占比72.99％，峰3分子量约为489.98kd，峰面积占比8.24％。由于tg分子量为660kd，推测峰2应该是tg蛋白峰。将tg蛋白浓缩液过分子筛，分管收集各组分，各管进行sec-hplc测定，将分子量在660kd-700kd区间的组分混合，浓缩后再进行sec-hplc测定，测定结果参见图4，由图4可知，tg蛋白纯度可达100％。
[0098]
值得说明的是，本实施例获得的重组人甲状腺球蛋白是人甲状腺球蛋白全长蛋白。
[0099]
实施例四：
[0100]
本实施例提供一种抗人甲状腺球蛋白检测试剂盒，采用上述实例获得的重组人甲状腺球蛋白制备得到。
[0101]
具体的，利用本发明得到的tg蛋白对人血清中tgab进行检测，该检测是利用化学发光法，制作抗人甲状腺球蛋白检测试剂盒，在体外测定血清样本中的tgab含量。
[0102]
进一步的，检测原理为：
[0103]
第一步，将样本添加到含包被有tg蛋白的磁性微球的反应管中，样本中的抗tg抗体tgab与包被有tg蛋白的磁性微球结合；
[0104]
第二步，将第一步结合后的磁性微球洗涤后，加入吖啶酯标记的抗人igg抗体，反应将形成抗原-抗体-抗人igg抗体复合物，通过外加磁场使结合有免疫复合物的磁性微球沉淀，而未结合的物质则被冲洗除去。化学发光标记物吖啶酯在碱性条件下被h2o2氧化，所产生的的光轻度与样本中tgab的浓度成正比。
[0105]
实施例五：
[0106]
本实施例提供一种抗人甲状腺球蛋白检测试剂，采用上述实例获得的重组人甲状腺球蛋白制备得到。
[0107]
具体的，抗人甲状腺球蛋白检测试剂包括放射性免疫法检测试剂、化学发光法检测试剂、酶联免疫法检测试剂、比浊法检测试剂、浊度法检测试剂、免疫层析法检测试剂。其中，化学发光法检测试剂包括磁微粒化学发光法检测试剂、酶促化学发光法检测试剂、电化学发光法检测试剂；比浊法检测试剂包括免疫比浊法、散射比浊法、投射比浊法、光扫描比浊法、乳胶比浊法、光电比浊法。
[0108]
为验证及评估本发明提供的tg蛋白制备的试剂在临床应用上的实用性，采用美康生物科技股份有限公司的抗甲状腺球蛋白检测试剂盒(化学发光法)作为参比产品，对在美康国宾体检中心与美康中医院选出的167例样本作为研究对象，美康生物公司的抗甲状腺球蛋白检测试剂盒与本发明提供的tg蛋白制备的试剂盒在ms-i3080全自动化学发光仪上对进本进行检测，并对结果进行分析，分析结果参见图5。
[0109]
临床检测结果表明，本发明提供的tg蛋白制备的检测试剂盒对血清中存在的tgab检测具有较高的灵敏度和准确性，且本发明提供的蛋白制备的试剂盒与产品试剂盒检测结果呈显著相关(r2＝0.9939)。
[0110]
综上所述，本发明提供的tg蛋白可与tgab高度特异性结合，且灵敏度高。本发明提供的tg蛋白制备的化学发光检测试剂可以精准地测定血清样本中的tgab，具有高灵敏度、准确性，与市场上在售试剂检测结果具有高度相关性，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对自身免疫甲状腺疾病的诊断。
[0111]
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

技术特征：
1.一种重组人甲状腺球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s10：获取人甲状腺球蛋白基因序列的cds序列；s20：优化并合成所述cds序列，获得优化后的所述cds序列；s30：构建重组表达载体：将所述优化后的所述cds序列利用nhe i和asc i双酶切后，插入nhe i和asc i双酶切的哺乳动物细胞表达载体中，获得所述重组表达载体；s40：目的蛋白的表达：将所述重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中，以制备所述目的蛋白；离心收集细胞上清液；s50：分离纯化所述目的蛋白：将所述细胞上清液浓缩后，进行镍柱亲和纯化，再用分子筛色谱柱分离出660kd-700kd分子量区间的蛋白，获得所述重组人甲状腺球蛋白。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述合成所述cds序列包括以下步骤：s21：在所述cds序列的上游依次添加nhe i限制性酶切位点、kozak序列和atg，在所述cds序列的下游依次添加6
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his标签和asc i限制性酶切位点，获得合成后的所述cds序列。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优化所述cds序列为针对所述哺乳动物细胞系进行密码子优化，所述优化后的所述cds序列如seq id no：1所示。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、小仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞、小鼠胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤细胞、犬肾内皮细胞、小鼠脾细胞、人胚肾细胞、人体细胞杂交细胞中的任一种。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转染为瞬时转染或稳定转染。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述稳定转染制备所述目的蛋白包括以下步骤：s61：将所述重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中；s62：用抗性筛选试剂筛选出阳性克隆；s63：对所述阳性克隆连续培养，离心收集培养的细胞上清液。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述瞬时转染制备所述目的蛋白包括以下步骤：s71：将所述重组表达载体转染至哺乳动物细胞系中；s72：将转染后的细胞一次培养，离心收集培养的细胞上清液。8.根据权利要求6-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述转染包括脂质体转染，pei转染，电转染。9.一种重组人甲状腺球蛋白，其特征在于，采用如权利要求1-8中任一项所述的制备方法获得，且所述重组人甲状腺球蛋白为人甲状腺球蛋白全长蛋白。10.如权利要求9所述的重组人甲状腺球蛋白的应用，其特征在于，应用于制备抗重组人甲状腺球蛋白检测试剂。11.一种抗人甲状腺球蛋白检测试剂盒，其特征在于，采用权利要求9所述的重组人甲状腺球蛋白获得。

技术总结
本发明提供一种重组人甲状腺球蛋白及其制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：S10：获取人甲状腺球蛋白基因序列的CDS序列；S20：优化并合成CDS序列，获得优化后的CDS序列；S30：构建重组表达载体；S40：目的蛋白的表达；S50：分离纯化目的蛋白。本发明解决了体外表达人甲状腺球蛋白的技术问题，在很大程度上降低人甲状腺球蛋白原料成本，以期实现降低TGAb检测价格的技术效果。测价格的技术效果。测价格的技术效果。


技术研发人员：邹继华 赵金华 许燕 杨克群 周海涛 宋丹丽 王芬 何进军 贾江花
受保护的技术使用者：美康生物科技股份有限公司
技术研发日：2022.07.31
技术公布日：2023/8/5