一种含油微藻的保藏方法与流程

1.本发明涉及微生物领域，具体涉及一种含油微藻的保藏方法。


背景技术：

2.气候和环境变化仍是当前世界面临的严峻挑战。我国是二氧化碳排放第一大国，要实现“双碳”目标，碳减排工作迫在眉睫。以二氧化碳为原料高效生产能源、大宗化学品及材料，是实现碳“捕集+利用”的有效解决方案。2021年7月，《中国二氧化碳捕集利用与封存(ccus)年度报告(2021)》报告中将微藻生物固碳作为ccus的一个重要的生物利用方向。
3.微藻是现今代谢工程领域最具潜力的原料生物质之一，由于微藻细胞内具有叶绿素、海胆蛋白等光合器官，是非常有效的光合作用生物系统，能高效地利用太阳能，并通过光合作用将h2o、co2和无机盐转化为有机化合物，多糖、淀粉、油脂、蛋白及其他高附加值产品。微藻作为细胞工厂具有诸多优势，生长周期短、可以捕集co2、光合效率高，且其co2固定效率一般能达到陆生植物的10-50倍；同时微藻生长速度快还能积累淀粉、油脂等高附加值产品。微藻主要生活在水中，可以是淡水、海水或是半盐水，仅占用少量的土地资源，因其可以快速、高效地固定和利用co2，是解决热电厂等各类工厂大量排放co2、减少温室效应的有效途径之一。因此，同植物相比，微藻结构简单且基因可操作性强，是优质的细胞工厂，已经成为人类食品、医药、燃料、精细化工领域重要材料来源。
4.藻种是一个重要的自然资源，藻种的保藏是一项重要的基础研究工作。从自然界获得优良藻种来之不易，保障藻种在科研和生产过程中的优良性能，减少藻种的退化和死亡，具有十分重要的意义。常用的微藻保存方法有继代法保存、固定化法保存、超低温保存、浓缩低温保存、冷冻真空干燥保存和低温甘油生理盐水保存。国内外许多高校和研究所在微藻养殖技术的开发和微藻育种方面开展了许多有益的工作，纷纷建立了自己的藻种资源库。目前各类藻种库一般采用低温液体传代保藏法、琼脂固体传代保藏法和低温冷藏传代对藻种进行保藏，保藏时间一般不超过1年。cn108384721公开了一种小球藻保藏方法，该方法只针对小球藻使用范围窄，采用低温冷藏的方式，最多可保存9个月，随着传代次数的增多会对藻种造成污染和突变，容易导致藻种性能的下降。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种含油微藻的保藏方法，采用特制的复配防冻剂，能延长含油微藻的保藏时间至2-3年。复苏后各项指标稳定。
6.本发明提供一种含油微藻的保藏方法，包括：收集处于稳定生长期的含油微藻，加入液体培养基得到浓缩微藻细胞溶液，向其中加入复配防冻剂，分段降温缓慢冷冻；其中所述复配防冻剂包括防冻剂ⅰ、防冻剂ⅱ和中和剂，防冻剂ⅰ为浓缩微藻细胞溶液总重量的1%~20%，防冻剂ⅱ为浓缩微藻细胞溶液总重量的1%~20%，中和剂为浓缩微藻细胞溶液总重量的0.5%~5%；防冻剂ⅰ选自甘油（gly）、二甲基亚砜（dmso）、聚乙二醇（peg）和丙二醇（pdo）中的至少一种，防冻剂ⅱ选自蔗糖（suc）、葡萄糖（glu）和蜂蜜（hon）中的至少
一种，中和剂为酰胺类化合物中的一种。
7.进一步的，所述分段降温缓慢冷冻具体是：先0~5℃维持4~8h，再于-18~-40℃维持2~4h，最后于-60~-80℃维持2~4h，保藏于-80℃。
8.进一步的，所述防冻剂ⅰ优选为甘油（gly）和/或二甲基亚砜（dmso）。
9.进一步的，所述防冻剂ⅱ优选为葡萄糖。
10.进一步的，所述中和剂优选为乙酰胺和/或甲酰胺。
11.进一步的，以浓缩微藻细胞溶液的总重量计，防冻剂ⅰ优选为5%~20%，防冻剂ⅱ优选为3%~8%，中和剂优选为0.5%~3%。
12.进一步的，所述复配防冻剂是将防冻剂ⅰ、防冻剂ⅱ和中和剂混合后再加入至浓缩微藻细胞溶液中，或将防冻剂ⅰ、防冻剂ⅱ和中和剂分别加入至浓缩微藻细胞溶液中。
13.进一步的，所述浓缩微藻细胞溶液中微藻细胞的浓度为1g/l~10g/l。
14.进一步的，所述液体培养基为bg11、se、tap或d1等淡水微藻培养基。
15.进一步的，利用本发明的上述方法保藏后的含油微藻的复苏过程如下：将冷冻后的微藻取出，迅速放至20℃-30℃恒温箱中，保温30min快速解冻，去除防冻剂，加入新鲜培养基培养至对数生长期转至柱式光照反应器中复苏。
16.其中所述去除复配防冻剂，是用去离子水、生理盐水或新鲜培养基氢洗藻液2-3次。保藏微藻经静置培养至稳定期后，以1%-10%接种量接种至微藻柱式光照反应器中，反应器中装液量为150ml-200ml，温度为25℃-30℃，光暗比为10:14-14:10，通入空气量为0.5l/min，每天通入大约1分钟二氧化碳来调节培养液的ph值，培养至稳定期。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的保藏方法采用特定的复配防冻剂，能渗透到细胞内和吸附在细胞表面形成双重保护，阻止冰晶生长对细胞的破坏，缓解对细胞的损伤；其中的中和剂可降低防冻剂渗透到细胞内对微藻细胞产生的毒性；本发明在冷冻阶段采用分段降温缓慢冷冻的方式，过程中微藻细胞内产生的冰晶小，减少对细胞的损伤。
18.本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
19.下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
20.以下所述的细胞相对活性采用荧光染色法，取5ml待测藻液，向其中加入60μmol二醋酸荧光素(fda)振荡混匀，每5min振荡一次，于室温下避光染色30min后取样于525nm处检测荧光值(激发光波长选取480nm)，可得细胞相对活性(%)，当od
689.5nm
《5.0时，相对细胞活性(%)=(保藏后微藻细胞稀释液的荧光值/od
689.5nm
)/保藏前微藻细胞悬液的荧光值/od
689.5nm
)
×
100%；当od
689.5nm
》5.0时，相对细胞活性(%)=(保藏后微藻细胞稀释液的荧光值/保藏前微藻细胞悬液的荧光值)
×
100%。
21.微藻油脂含量的测定采用乙酸乙酯正己烷法测定，称量干藻粉100mg放入瓷研钵中，加入适量石英砂和液氮，待液氮挥发后，研磨破壁，放入离心管。加入体积比为1的乙酸乙酯和正己烷混合有机溶剂，超声清洗仪处理20min，50℃恒温水浴中提取45min。提取后离心15min，收集上清液至离心管中。提取液中加入等体积的蒸馏水，震荡混匀后离心4min，收
集上层有机相至已烘干的玻璃试管中，玻璃管净重为w0。80℃水浴蒸发玻璃试管中的溶剂后80℃烘箱烘干至恒重，重量为w1。计算藻细胞的总脂含量(%)=100
×
(w
1-w0)/m。
22.实施例1挑取平板上的单针藻接种至50ml bg11培养基中，温度30℃，光照强度为10000 lux，光暗比为14:10，ph为6.0-8.0，每天手动摇3次，长至稳定期。取藻液经离心（4000r/min，3min）、去离子水洗两次后，加入新鲜培养基重悬，得到10g/l浓缩微藻细胞溶液，按溶液重量计，分别加入5% gly和5%葡萄糖，作为防冻剂，再加入中和剂0.5%乙酰胺，5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性80%。
23.实施例2微藻培养过程同实施例1。复配防冻剂为浓缩微藻细胞溶液重量10%的gly、5%的葡萄糖和0.5%的乙酰胺中和剂，冷冻过程为5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性85.4%。
24.实施例3微藻培养过程同实施例1。复配防冻剂为浓缩微藻细胞溶液重量10%的gly、5%的葡萄糖和1.0%的乙酰胺中和剂，冷冻过程为5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性90.5%。
25.实施例4微藻培养过程同实施例1。复配防冻剂为浓缩微藻细胞溶液重量20%的gly、5%的葡萄糖和1.0%的乙酰胺中和剂，冷冻过程为5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性87.7%。
26.实施例5微藻培养过程同实施例1。复配防冻剂为浓缩微藻细胞溶液重量20%的gly、5%的葡萄糖和1.5%乙酰胺中和剂，冷冻过程为5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性88%。
27.实施例6微藻培养过程同实施例1。复配防冻剂为浓缩微藻细胞溶液重量10%的dmso、5%的葡萄糖和1.0%的乙酰胺中和剂，冷冻过程为5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃，进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性89.5%。
28.采用此条件保藏3年后，微藻的细胞相对活性为60%；保藏3年后取出冻存微藻置于25℃恒温箱中，保温30min。4000r/min离心3min，加入生理盐水洗三次去除复合防冻剂后，接种至50ml摇瓶静置培养至对稳定期，以5%接种量接种至微藻柱式光照反应器中，反应器中装液量为200ml，温度为30℃，光暗比为14:10，通入空气量为0.5l/min，每天通入大约1分钟二氧化碳来调节培养液的ph值，培养至稳定期。复苏后微藻油脂含量为32%（冷冻保藏前微藻油脂含量为32%）。
29.而同样的微藻采用继代法保藏3年后油脂含量下降至27%。
30.比较例1微藻培养过程同实施例1。按浓缩微藻细胞溶液重量的5%加入gly，5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃，进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性40%。
31.采用此条件保藏3年后，微藻的细胞相对活性为15%；
保藏3年后将冷冻的微藻细胞取出复苏，过程同实施例6。复苏后微藻油脂含量为28%（冷冻保藏前微藻油脂含量为32%）。
32.比较例2微藻培养过程同实施例1。按浓缩微藻细胞溶液重量的10%加入gly，5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃，进行冷冻保藏期。保存后细胞相对活性59%。
33.比较例3微藻培养过程同实施例1。按浓缩微藻细胞溶液重量的20%加入gly，5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃，进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性55%。
34.比较例4微藻培养过程同实施例1。按浓缩微藻细胞溶液重量的5%加入葡萄糖，5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃，进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性30%。
35.比较例5微藻培养过程同实施例1。按浓缩微藻细胞溶液重量的10%加入葡萄糖，5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃，进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性40%。
36.比较例6微藻培养过程同实施例1。按浓缩微藻细胞溶液重量的20%加入葡萄糖，5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃，进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性42%。
37.比较例7微藻培养过程同实施例1。分别按浓缩微藻细胞溶液重量的10%加入gly和葡萄糖，5℃维持4h，-20℃维持2h，-60℃维持2h，放置于-80℃，进行冷冻保藏。保存后细胞相对活性60%。

技术特征：
1.一种含油微藻的保藏方法，其特征在于，包括：收集处于稳定生长期的含油微藻，加入液体培养基得到浓缩微藻细胞溶液，向其中加入复配防冻剂，分段降温缓慢冷冻；其中所述复配防冻剂包括防冻剂ⅰ、防冻剂ⅱ和中和剂，防冻剂ⅰ为浓缩微藻细胞溶液总重量的1%~20%，优选为5%~20%，防冻剂ⅱ为浓缩微藻细胞溶液总重量的1%~20%，优选为3%~8%，中和剂为浓缩微藻细胞溶液总重量的0.5%~5%，优选为0.5%~3%；防冻剂ⅰ选自甘油、二甲基亚砜、聚乙二醇和丙二醇中的至少一种，防冻剂ⅱ选自蔗糖、葡萄糖和蜂蜜中的至少一种，中和剂为酰胺类化合物中的一种。2.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，所述分段降温缓慢冷冻具体是：先0~5℃维持4~8h，再于-18~-40℃维持2~4h，最后于-60~-80℃维持2~4h，保藏于-80℃。3.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，所述防冻剂ⅰ为甘油和/或二甲基亚砜。4.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，所述防冻剂ⅱ为葡萄糖。5.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，所述中和剂为乙酰胺和/或甲酰胺。6.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，所述复配防冻剂是将防冻剂ⅰ、防冻剂ⅱ和中和剂混合后再加入至浓缩微藻细胞溶液中，或将防冻剂ⅰ、防冻剂ⅱ和中和剂分别加入至浓缩微藻细胞溶液中。7.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，所述液体培养基为bg11、se、tap或d1淡水微藻培养基。8.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，所述浓缩微藻细胞溶液中微藻细胞的浓度为1g/l-10g/l。9.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于，利用本发明的上述方法保藏后的含油微藻的复苏过程如下：将冷冻后的微藻取出，迅速放至20℃~30℃恒温箱中，保温30min快速解冻，去除防冻剂，加入新鲜培养基培养至对数生长期转至柱式光照反应器中复苏。10.根据权利要求9所述的保藏方法，其特征在于，去除复配防冻剂，是用去离子水、生理盐水或新鲜培养基清洗藻液2~3次。11.根据权利要求9所述的保藏方法，其特征在于，保藏微藻经静置培养后，以1%-10%接种量接种至微藻柱式光照反应器中，反应器中温度为25℃~30℃，光暗比为10:14~14:10，通入空气量为0.5l/min，每天通入大约1分钟二氧化碳来调节培养液的ph值，培养至稳定期。

技术总结
一种含油微藻的保藏方法，包括：收集处于稳定生长期的含油微藻，加入液体培养基得到浓缩微藻细胞溶液，加入复配防冻剂，分段降温缓慢冷冻；复配防冻剂包括浓缩微藻细胞溶液总重量1%~20%的防冻剂Ⅰ、1%~20%的防冻剂Ⅱ和0.5%~5%的中和剂，防冻剂Ⅰ选自甘油、二甲基亚砜、聚乙二醇和丙二醇中的至少一种，防冻剂Ⅱ选自蔗糖、葡萄糖和蜂蜜中的至少一种，中和剂为酰胺类化合物。本发明的复配防冻剂能渗透到细胞内和吸附在细胞表面形成双重保护，阻止冰晶生长对细胞的破坏，缓解对细胞的损伤；中和剂可降低防冻剂渗透到细胞内对微藻细胞产生的毒性；本发明在冷冻阶段采用分段降温缓慢冷冻的方式，过程中微藻细胞内产生的冰晶小，减少对细胞的损伤。胞的损伤。


技术研发人员：廖莎 王鹏翔 师文静 孙启梅 张霖
受保护的技术使用者：中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院
技术研发日：2022.01.29
技术公布日：2023/8/5