氨基酸修饰的BODIPY类化合物及制备方法和用途

氨基酸修饰的bodipy类化合物及制备方法和用途
技术领域
1.本发明属药物合成领域，涉及新型氨基酸修饰的bodipy类化合物、制备方法和应用。具体涉及一种含氨基酸残基或羟基取代的bodipy类化合物，及其制备方法和在制药中的应用。


背景技术：

2.据报道，恶性肿瘤已经成为严重危害人民生命健康的常见疾病。据不完全统计，2020年全球大约有1930万癌症新发病例和1000万癌症死亡病例；2020年我国新发病例约为457万，死亡300万。临床实践显示，由于肿瘤早期具有转移的能力，临床诊断原发肿瘤中约50％的患者已产生远端转移，肿瘤细胞増长快、易变异，容易产生多药耐药，从而导致化疗失败，据有关统计，其中90％以上与肿瘤细胞的多药耐药相关。近几年免疫疗法取得了很大的成功，但是多数病人对免疫治疗的应答率低于30％，因此严重限制了免疫疗法的应用。因此，目前临床现有的抗肿瘤药物不能满足治疗的要求，急需开发新型的肿瘤治疗方法。
3.光动力治疗在1996年被fda批准进入临床，属于新型肿瘤治疗方法，与传统的肿瘤治疗方式相比，光动力治疗具有以下明显优势：可高度选择性的杀伤肿瘤；光动力可单独应用，或者联合化疗、手术治疗、放疗或者免疫治疗，对肿瘤进行协同治疗；治疗效果显著，创伤性很小；多次治疗不产生耐药性。目前有关光动力抗肿瘤药物研究中，已有多个光敏剂上市或进入临床研究，应用于皮肤癌、前列腺癌、口腔鳞癌、痤疮、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌及食道癌的治疗中，尤其在皮肤癌的治疗中取得了显著的疗效。
4.卟吩姆钠(photofrin)是第一代光敏剂的典型代表，临床上被批准用于治疗恶性肿瘤，但在临床应用中存在长期皮肤光毒性、代谢缓慢、肿瘤选择性差、化学异质性、摩尔吸收系数低、生物利用度差等严重缺陷。第二代光敏剂主要以环四吡咯型光敏剂(二氢卟吩、叶绿素和酞菁)为主，如塔拉泊芬(talaporfin)、维替泊芬(verteporfin)、光克洛(photochlor)和pc4等光敏剂已经商业化。氟硼二吡咯甲川(bodipy)作为非卟啉类新型光敏剂，因其优良的光稳定性、高摩尔吸光系数、代谢速率快、光毒性高、暗毒性很低、化学结构易于修饰等优点成为研究的热点。adpm06是bodipy光敏剂的典型代表，显示了强效的抗肿瘤效果，特别是在动物体内模型中实现完全治愈，并且治疗8周时间内没有复发。然而，bodipy光敏剂以及大多数四吡咯型的光敏剂水溶性非常差，通常需要乳化剂的辅助才能达到有效的抗肿瘤效果，因而限制了它们在临床中的应用。虽然乳化剂已成功应用于批准的药物制剂(如cremophor el乳化的紫杉醇)，但研究表明，乳化剂的应用可能导致严重的过敏反应。因此，有关研究对新型水溶性光敏剂的进行了大量的研究，各种类似物被衍生化以增加水溶性，例如引入糖基、乙二醇链、季铵盐、多肽和含酸基团，其中，含有脂肪酸部分的talaporfin和padeliporfin是临床批准光敏剂的成功案例。
[0005][0006]
基于目前报道的bodipy类光敏剂大多数水溶性很差，本技术的发明人拟提供新型氨基酸修饰的bodipy类化合物，尤其是一类氨基酸残基或羟基取代的bodipy类光敏剂，该类化合物比现有技术的化合物具有水溶性显著增加、光稳定性增强，单线态氧产率提高，光毒性提高，体内抗肿瘤活性好等优点，可进一步开发为新型光敏剂。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供新的氨基酸修饰bodipy类化合物及其制备方法和用途，尤其是一类氨基酸残基或羟基取代的bodipy类光敏剂。本技术的氨基酸残基或羟基取代的bodipy类光敏剂具有水溶性显著增加、光稳定性增强，单线态氧产率提高，光毒性提高，体内抗肿瘤活性好等优点。
[0008]
具体的，本发明提供了具有良好抗肿瘤作用的新型bodipy类光敏剂，涉及通式(ⅰ)或(ⅱ)结构的氨基酸残基或羟基取代的bodipy类化合物：
[0009][0010]
其中：
[0011]
r1、r2独立地选自苯基、c
1-6
烷基取代的苯基、c
1-6
烷氧基取代的苯基、卤素取代的苯基；
[0012]
r3选自羟基、-nr4；
[0013]
其中r4选自氨基酸残基。
[0014]
虚线为c-c键或不存在。
[0015]
优选地，其中虚线为c-c键。
[0016]
优选地，其中r1、r2选自苯基。
[0017]
优选地，其中r4选自天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天门冬酰胺残基、甘氨酸残基；进一步优选地，r4选自天冬氨酸残基、谷氨酸残基。
[0018]
本发明中，化合物具有下述化合物1、2、3、4、5、6、7的结构：
[0019]
[0020]
[0021][0022]
本发明的另一目的是提供上述bodipy类化合物的制备方法，尤其涉及制备氨基酸残基或羟基取代的bodipy类化合物的方法。
[0023]
以化合物1为例，本发明的化合物的制备过程如下：
[0024][0025]
以化合物2为例，本发明的化合物的制备过程如下：
[0026]
[0027]
更近一步，本发明的氨基酸残基或羟基取代bodipy类化合物可制备光动力抗肿瘤的光敏剂。所述的肿瘤包括皮肤癌、前列腺癌、口腔鳞癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌及食道癌。
[0028]
本发明的化合物进行了对肿瘤抑制活性测试实验，结果显示出较好的肿瘤抑制活性，其中化合物2对三种肿瘤株均表现出了小于0.1μm的细胞抑制活性。
[0029]
本发明中，所采用的药效学试验方法，是本领域技术人员所熟知的方法。
[0030]
本发明中，所采用的b16-f10细胞，a375细胞和hela细胞是本领域技术人员可通过市购的途径所获得的。
[0031]
本发明提供了新的氨基酸修饰bodipy类化合物，尤其是一类氨基酸残基或羟基取代的bodipy类光敏剂。本技术的氨基酸残基或羟基取代的bodipy类光敏剂具有水溶性显著增加、光稳定性增强，单线态氧产率提高，光毒性提高，体内抗肿瘤活性好等优点。所述的氨基酸残基或羟基取代的bodipy类光敏剂可治疗包括皮肤癌、前列腺癌、口腔鳞癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌及食道癌等恶性肿瘤。
附图说明
[0032]
图1，化合物2在b16-f10中的细胞器定位实验，其中，(a1,a2,a3)明场中细胞形态；(b1)线粒体绿色荧光探针(250nm)孵育后的图像；(b2)溶酶体绿色荧光探针(500nm)孵育后的图像；(b3)内质网绿色荧光探针(2μm)孵育后的图像；(c1,c2,c3)化合物2的红色荧光图像；(d1,d2,d3)相应探针的绿色荧光和化合物2的红色荧光叠合图，比例尺：10μm。
[0033]
图2，在b16-f10细胞(a)或a375细胞(b)中检测化合物2产生的胞内活性氧，其中，(a1,b1)在暗处用100nm的化合物2孵育；分别用10nm(a2,b2),20nm(a3,b3)和100nm(a4,b4)的化合物2孵育，然后给予光剂量54j/cm2；(a5,b5)ros阳性细胞的占比，。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001。
[0034]
图3，化合物2诱导b16-f10细胞凋亡作用，其中，(a)对照组；(b,c,d)分别用10nm(b),50nm(c)和250nm(d)的化合物2孵育,然后给予光剂量54j/cm2；(e)凋亡和坏死细胞所占比例，**p《0.01,****p《0.0001。
[0035]
图4，在b16-f10移植瘤模型中评价化合物2的肿瘤抑制效果，其中，(a)肿瘤离体图片(虚线代表治愈的肿瘤)；(b)肿瘤体积生长曲线；(c)离体肿瘤重量；(d)小鼠体重变化曲线；(e)不同组肿瘤组织的h&e染色，**p《0.01,***p《0.001,and****p《0.0001。
具体实施方式
[0036]
实施例1：合成化合物1
[0037]
(1)3-苯基-2h-氮杂环丙烯的合成
[0038]
将原料(1,2-二溴乙基)苯(5.2g,19.9mmol)溶于dmf(30ml)中，将叠氮化钠(3.9g，60mmol)慢慢加入到上述溶液中，室温反应10h。之后用无水乙醚和饱和碳酸钠溶液萃取三次，合并有机相浓缩得到(1-叠氮基乙烯基)苯。
[0039]
将三乙烯二胺(dabco,1.5g,13.4mmol)加入到甲苯(70ml)中，升温至110℃，将(1-叠氮基乙烯基)苯溶于甲苯中，滴加至溶液中，回流2h，旋蒸除去甲苯，得到黄色油状粗产品3-苯基-2h-氮杂环丙烯。产物不经分离，直接用于下一步反应。
[0040]
(2)2-(4-甲氧基苯基)-4-苯基-1h-吡咯的合成
[0041]
将对甲氧基苯乙酮(1g,6.7mmol)溶解于干燥thf(30ml)中，氮气保护，冷却至-78℃，慢慢注射加入lda(13.4mmol)，反应30min。将3-苯基-2h-氮杂环丙烯(784mg,6.7mmol)溶解于四氢呋喃中，慢慢加入反应体系，反应2h，室温反应1h。反应结束后，加入氯化铵水溶液猝灭反应，用二氯甲烷和水萃取，合并有机相，饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，用二氯甲烷：石油醚＝1:10柱层析得到中间体2-(4-甲氧基苯基)-4-苯基-1h-吡咯，白色晶体，939mg，收率56.3％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.27(s,1h),7.45(d,j＝7.1hz,2h),7.33(s,2h),7.24(s,2h),7.08(s,1h),7.00(s,1h),6.83(s,2h),6.59(s,1h),3.72(s,3h)。
[0042]
(3)二氟化硼螯合(z)-2-((5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚苯基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-醇的合成
[0043]
将原料7-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚(37.5mg,0.1mmol)加入到冰醋酸(1ml)中搅拌，温度降低至5℃，然后加入亚硝酸钠(6.9mg,0.1mmol)，继续搅拌15min。溶液的颜色从无色变为棕色，然后变成绿色，最后变为棕色。然后加入原料2-(4-甲氧基苯基)-4-苯基-1h-吡咯(24.9mg,0.1mmol)，之后加入醋酸酐(0.4ml)，反应液立即变成绿色，室温继续搅拌30min，然后升温至80℃搅拌30min，tlc点板显示反应完全。待反应液冷却至室温，加入冰水猝灭反应，将沉淀出的蓝色染料过滤，滤饼用水冲洗，干燥。滤饼用中性氧化铝柱层析，二氯甲烷为洗脱剂，旋干溶剂，用油泵抽干得到产品。
[0044]
上述产物溶于干燥的1,2-二氯乙烷中(10ml)，加入三乙胺(0.24ml)，然后滴加三氟化硼乙醚(0.24ml)，室温搅拌30min，然后升温至80℃搅拌30min。反应液冷却至室温，加入冰水猝灭反应，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，用二氯甲烷/石油醚(1/8)柱层析，得到粗产品。
[0045]
上述得到的产物(1.0mmol)溶解于ch2cl2/meoh/h2o(20ml/8ml/1ml)体系中，加入k2co3(6.0mmol,829.2mg)室温搅拌16h，旋蒸除去有机层，水相加入0.5n hcl调整ph至5，化合物沉淀析出，然后用二氯甲烷/正己烷(1/1)重结晶得到产物，铜色固体，收率45.1％。1h nmr(600mhz,dmso)δ10.91(s,1h),8.48(d,j＝8.9hz,1h),8.13(d,j＝7.3hz,2h),8.09(d,j＝8.9hz,2h),7.78(d,j＝7.2hz,2h),7.58(t,j＝7.6hz,2h),7.51(t,j＝7.4hz,1h),7.44(t,j＝7.5hz,2h),7.40
–
7.33(m,2h),7.13(d,j＝8.9hz,2h),6.93
–
6.86(m,2h),3.88(s,3h),2.94(s,4h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ162.45,160.72,155.52,152.27,146.55,145.88,142.72,138.10,137.53,133.36,132.30,131.84,130.92,130.73,130.03,128.72,128.48,128.35,128.16,124.08,117.18,117.09,115.96,115.23,114.09,55.30,29.26,21.04。
[0046]
(4)二氟化硼螯合叔丁基(z)-2-((2-((5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-基)氧基)乙酸酯的合成
[0047]
将原料二氟化硼螯合(z)-2-((5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚苯基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-醇(56.9mmol，0.1mmol)溶解于dmf(5ml)中，加入k2co3(0.2mmol,27.6mg)，然后滴加溴乙酸叔丁酯(0.3mmol，58.5mg)，80℃搅拌1h。反应液用二氯甲烷和水萃取三次，浓缩有机层，用二氯甲烷/石油醚体系柱层析，得到产物，铜色固体，收率88.7％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.72(d,j＝9.0hz,1h),8.10(t,j＝7.9hz,4h),
7.75(d,j＝7.5hz,2h),7.52(t,j＝7.5hz,2h),7.46(t,j＝7.3hz,1h),7.42(t,j＝7.4hz,2h),7.39
–
7.35(m,1h),7.07(d,j＝8.7hz,2h),6.99(s,1h),6.94(dd,j＝8.9,2.4hz,1h),6.88(d,j＝2.0hz,1h),4.62(s,2h),3.93(s,3h),3.03
–
2.89(m,4h),1.53(s,9h).
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ167.42,161.39,160.82,155.34,154.80,146.54,144.90,144.71,140.82,138.48,132.92,132.29,132.05,131.99,131.28,130.50,129.01,128.74,128.60,128.51,128.23,124.91,120.89,117.36,115.37,114.21,113.48,82.89,65.61,55.46,30.55,28.14,21.82。
[0048]
(5)二氟化硼螯合(z)-2-((2-((4-碘-5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-基)氧基)乙酸(化合物1)的合成
[0049]
将化合物二氟化硼螯合叔丁基(z)-2-((2-((5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-基)氧基)乙酸酯(68.3mg，0.1mmol)溶解于dcm/tfa(5ml/1ml)体系中，室温搅拌5h。反应液除去有机溶剂，加入碳酸钾溶液调整ph至5，然后用二氯甲烷和水萃取三次。合并有机层，用dcm/meoh(50/1)体系柱层析，得到中间体。得到的中间体(0.05mmol)溶于二氯甲烷(3ml)，加入乙酸(1ml)，然后加入nis(0.055mmol，12.4mg)，室温搅拌40min。反应液用二氯甲烷和亚硫酸钠水溶液萃取三次，合并浓缩有机层，用dcm/meoh(50/1)体系柱层析，得到产物，然后用二氯甲烷/正己烷(1/1)重结晶得到终产物1，铜色固体，收率61.2％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.39(d,j＝9.1hz,1h),7.78(d,j＝7.5hz,2h),7.75(d,j＝7.4hz,2h),7.57(d,j＝8.4hz,2h),7.54
–
7.38(m,6h),7.16
–
7.01(m,4h),4.82(s,2h),3.88(s,3h),2.98(d,j＝5.5hz,2h),2.94(d,j＝5.6hz,2h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ169.36,162.85,159.97,158.63,151.50,147.30,141.31,140.14,139.21,135.00,132.45,132.07,130.33,130.06,129.02,128.12,127.69,124.16,118.06,115.02,114.55,113.10,80.01,64.98,55.08,29.07,21.03.hrms m/z:754.1188[m+h]
+
,calcd for c
37h28
bf2in3o
4 754.1180。
[0050]
实施例2：二氟化硼螯合(z)-(2-((2-((4-碘-5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-基)氧基)乙酰基)天冬氨酸(化合物2)的合成
[0051]
将二氟化硼螯合(z)-2-((2-((4-碘-5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-基)氧基)乙酸(75.3mg，0.1mmol)溶解于dcm/thf(6ml/3ml)体系中，加入hatu(0.12mmol，45.6mg)，室温搅拌30min。l-asp(o
t
bu)2·
hcl(0.13mmol,36.6mg)和dipea(0.13mmol,16.8mg)混合在5ml二氯甲烷中，滴加到上述反应液中，室温反应3h。反应液用0.1n hcl溶液洗三次，用二氯甲烷和水萃取，合并有机层，用dcm/meoh(100/1)柱层析得到中间体。此中间体溶于dcm/tfa(7ml/1ml)，室温反应9h。反应液用二氯甲烷和水萃取三次，合并有机层，用dcm/meoh(30/1)柱层析，得到终产物2，铜色固体，收率55.6％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.40(d,j＝9.0hz,1h),7.79(d,j＝7.6hz,2h),7.76(d,j＝7.4hz,2h),7.58(d,j＝8.4hz,2h),7.52(dd,j＝14.0,7.0hz,4h),7.48
–
7.40(m,2h),7.14
–
7.06(m,4h),4.73(s,2h),4.53(s,1h),3.88(s,3h),2.99(d,j＝5.9hz,2h),2.95(d,j＝6.6hz,2h),2.70(s,1h),2.62(s,1h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ172.23,171.80,166.33,162.31,160.02,158.45,151.89,147.25,141.44,140.47,139.26,134.94,134.38,132.41,132.08,130.36,130.07,129.04,128.14,127.70,124.06,118.42,115.18,
114.72,113.12,80.23,66.65,55.10,48.24,29.11,28.87,21.03.hrms m/z:869.1454[m+h]
+
,calcd for c
41h33
bf2in4o
7 869.1450。
[0052]
实施例3：二氟化硼螯合(z)-(2-((2-((4-碘-5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-基)氧基)乙酰基)谷氨酸(化合物3)的合成
[0053]
合成方法同化合物2的合成路线。化合物3，铜色固体，收率51.8％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.40(d,j＝7.2hz,1h),7.81
–
7.73(m,3h),7.64
–
7.57(m,3h),7.53
–
7.48(m,4h),7.47
–
7.41(m,2h),7.28(s,1h),7.10(m,3h),4.74(m,2h),4.28(d,j＝6.0hz,1h),3.88(s,3h),3.04
–
2.88(m,4h),2.29(t,j＝7.3hz,2h),2.05
–
1.96(m,1h),1.90
–
1.82(m,1h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ173.62,172.77,166.96,162.48,160.01,158.48,151.82,147.23,141.40,140.42,139.26,134.93,134.40,134.13,132.40,132.08,131.89,131.35,131.29,130.54,130.35,130.27,130.07,129.05,128.64,128.56,128.26,128.14,127.71,124.08,118.32,115.02,114.88,113.12,80.17,66.52,55.10,50.89,29.88,29.15,25.87,21.03.hrms m/z:883.1608[m+h]
+
,calcd for c
42h35
bf2in4o
7 883.1606。
[0054]
实施例4：二氟化硼螯合(z)-2-(4-(4-碘-2-((7-甲氧基-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-2-基)亚氨基)-3-苯基-2h-吡咯-5-基)苯氧基)乙酸(化合物4)的合成
[0055]
(1)二氟化硼螯合(z)-4-(2-((7-甲氧基-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-2-基)亚氨基)-3-苯基-2h-吡咯-5-基)苯酚的合成
[0056]
合成方法同化合物二氟化硼螯合(z)-2-((5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚苯基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-醇的合成路线。产物铜色固体，收率40.6％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.71(d,j＝9.0hz,1h),8.07(d,j＝7.4hz,2h),8.02(d,j＝8.6hz,2h),7.73(d,j＝7.3hz,2h),7.50(t,j＝7.5hz,2h),7.44(t,j＝7.4hz,1h),7.39(t,j＝7.4hz,2h),7.34(t,j＝7.2hz,1h),6.99
–
6.92(m,4h),6.84(d,j＝2.4hz,1h),5.06(s,1h),3.90(s,3h),2.96(s,4h).
13
cnmr(151mhz,cdcl3)δ162.82,157.24,155.48,154.46,146.69,145.07,144.31,140.26,138.56,132.96,132.49,132.27,132.20,132.12,131.88,131.37,130.44,128.91,128.58,128.44,128.18,125.32,119.94,116.96,115.62,114.58,113.28,55.53,30.52,21.84。
[0057]
(2)二氟化硼螯合叔丁基(z)-2-(4-(2-((7-甲氧基-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-2-基)亚氨基)-3-苯基-2h-吡咯-5-基)苯氧基)乙酸酯的合成
[0058]
合成方法同化合物二氟化硼螯合叔丁基(z)-2-((2-((5-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2h-吡咯-2-亚基)氨基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-7-基)氧基)乙酸酯的合成路线。化合物，铜色固体，收率85.2％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.71(d,j＝9.0hz,1h),8.06(dd,j＝8.1,3.7hz,4h),7.73(d,j＝7.2hz,2h),7.50(t,j＝7.5hz,2h),7.44(t,j＝7.4hz,1h),7.39(t,j＝7.4hz,2h),7.34(t,j＝7.3hz,1h),7.02(d,j＝8.9hz,2h),6.97(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),6.94(s,1h),6.84(d,j＝2.5hz,1h),4.61(s,2h),3.90(s,3h),3.01
–
2.92(m,4h),1.52(s,9h).
13
c nmr(151mhz,cdcl3)δ167.74,162.85,159.40,155.59,154.26,146.74,145.11,144.31,140.20,138.59,132.97,132.53,132.25,131.87,131.12,130.44,128.90,128.57,128.44,128.18,125.87,119.93,116.98,114.69,114.55,113.29,82.63,65.73,55.53,30.52,28.08,21.85。
[0059]
(3)二氟化硼螯合(z)-2-(4-(4-碘-2-((7-甲氧基-3-苯基-4,5-二氢-1h-苯并[g]吲哚-2-基)亚氨基)-3-苯基-2h-吡咯-5-基)苯氧基)乙酸的合成
[0060]
合成方法同化合物1的合成路线。化合物4，铜色固体，收率56.2％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.42(d,j＝9.1hz,1h),7.80
–
7.72(m,4h),7.58
–
7.48(m,6h),7.44(m,2h),7.12(s,2h),7.06(d,j＝8.5hz,2h),4.80(s,2h),3.90(s,3h),2.99(s,2h),2.94(s,2h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ170.12,164.36,159.09,158.61,151.30,147.76,147.57,141.35,140.09,139.42,135.31,132.63,132.20,130.52,130.42,130.24,129.23,128.31,127.87,124.83,117.96,114.69,114.53,113.69,80.07,64.53,55.99,29.28,21.24.hrms m/z:754.1187[m+h]
+
,calcd for c
37h28
bf2in3o
4 754.1180。
[0061]
实施例5：合成化合物5
[0062]
合成方法同化合物2的合成路线。化合物5，铜色固体，收率56.9％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.43(d,j＝9.1hz,1h),7.81
–
7.74(m,3h),7.65
–
7.60(m,2h),7.59
–
7.55(m,2h),7.53
–
7.49(m,3h),7.47
–
7.41(m,2h),7.29(s,1h),7.13(d,j＝7.3hz,3h),4.66(s,2h),4.42(s,1h),3.91(s,3h),3.03
–
2.99(m,2h),2.98
–
2.93(m,2h),2.65(s,1h),2.58(s,1h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ174.16,172.09,171.77,167.21,164.27,159.03,158.38,151.07,147.66,147.48,141.21,139.91,139.31,135.22,132.51,132.10,130.40,130.29,130.12,129.54,129.10,128.19,127.74,124.95,117.82,114.56,114.40,113.89,79.78,66.58,55.88,55.65,48.18,29.16,28.91,21.13.hrms m/z:869.1453[m+h]
+
,calcd for c
41h33
bf2in4o
7 869.1450。
[0063]
实施例6：合成化合物6
[0064]
合成方法同化合物3的合成路线。化合物6，铜色固体，收率49.3％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.44(dd,j＝13.3,8.8hz,2h),7.77(dd,j＝12.4,7.7hz,3h),7.65
–
7.55(m,3h),7.53
–
7.40(m,6h),7.12(d,j＝7.7hz,3h),4.67(q,j＝14.7hz,2h),4.35(m,1h),3.90(s,3h),3.00(d,j＝6.5hz,2h),2.96(d,j＝6.8hz,2h),2.33(t,j＝7.5hz,2h),2.10
–
2.04(m,1h),1.94
–
1.84(m,1h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ173.69,172.82,167.54,164.20,158.95,158.45,151.07,147.59,147.41,141.17,139.87,139.24,135.15,134.36,132.45,132.01,130.34,130.24,130.06,129.04,128.13,127.69,124.80,117.78,114.51,114.33,113.80,79.73,66.46,55.82,50.91,29.99,29.11,25.99,21.07.hrms m/z:883.1611[m+h]
+
,calcd for c
42h35
bf2in4o
7 883.1606。
[0065]
实施例7：合成化合物7
[0066]
合成方法同化合物2的合成路线。化合物7，铜色固体，收率78.6％。hrms m/z:811.1523[m+h]
+
,calcd for c
39h31
bf2in4o
5 811.1516。
[0067]
实施例8：化合物的光物理/光化学性质,在pbs中的溶解度和log p测试
[0068]
将所合成的化合物测试了在相应溶剂中的最大吸收波长(λ
abs
)、摩尔消光系数(ε)、荧光发射波长(λ
em
)、荧光量子产率(φf)、单线态氧产出相对速率(rel.rate)、单线态氧产率(φ
δ
)、溶解度及logp，对应的数据在表1中列出。由表中的数据可知，相比阳性对照bdp-4，所合成的化合物最大吸收均在近红外波段，摩尔吸光系数较高，荧光量子产率有所增加。以锌酞菁(znpc)作为参比，测试了化合物在n,n二甲基甲酰胺中的单线态氧产出相对速率(rel.rate)和单线态氧产率(φ
δ
)。数据显示，除了化合物1，其余化合物的光敏化能力
均优于对照。相比对照光敏剂bdp-4，所有化合物的水溶性均显著提高，logp值显著降低。
[0069]
光敏化效率测试方法如下：
[0070]
1)，dpbf溶液的配制
[0071]
称取dpbf(m＝270.32)2.70mg，移至100ml棕色容量瓶，有机溶剂定容，混匀，超声震荡，避光静置30min，配制得到100μm的dpbf的有机溶液。,2，
[0072]
2)化合物溶液的配制
[0073]
移液管移取2ml(10μm化合物溶液)至10ml容量瓶，有机溶剂定容配制为2μm溶液。
[0074]
3)混合溶液的配制
[0075]
移液管移取2ml配制的100μm dpbf溶液于锡箔纸避光的ep管中，同样方法取2ml配制的2μm化合物溶液于ep管，混合均匀，立即测试样品吸收，记录为0s。
[0076]
4)光照操作
[0077]
光源采用卤素灯(25w)，中间含隔热水层和滤光片(》510nm)，光功率为6.0mw/cm2。打开光源，移走挡光板，照射间隔为10s，10s后插上挡光板，立即测定样品的吸收。依照此过程，分别测定光照20s、30s、40s、50s、60s样品的吸收。
[0078]
5)以标准品酞菁锌(znpc)的光敏化效率做参比。
[0079]
表1.光物理/光化学性质,在pbs中的溶解度和log p数据。
[0080][0081]a甲醇中测试；b氯仿中测试；c在dmf中dpbf相对于bdp-4的降解速率；d在dmf中测试，znpc(φ
δ
＝0.56)作为参比。
[0082]
实施例9：细胞活性测试
[0083]
(1)细胞培养
[0084]
细胞培养条件：实验选用三种肿瘤细胞株，分别为b16-f10(鼠源黑色素瘤细胞)，a375(人源黑色素瘤细胞)，hela(人宫颈癌细胞)。培养基为dmem(hyclone)，培养基含有10％胎牛血清(fbs)和1％的青霉素(10,000units/ml)-链霉素(10,000μg/ml)(hyclone)。细胞复苏后，在37℃含有5％co2培养箱中培养。
[0085]
细胞及动物光照条件：光源采用卤素灯(75w)，采用滤光片过滤得到近红外光(λ》590nm)，采用隔热水层除去卤素灯发出的热量。
[0086]
(2)细胞毒性实验
[0087]
细胞光毒性评价采用cck-8测试方法。将培养的细胞用胰酶消化后接种于96孔培养板，密度大约3000个/孔，培养12h使其贴壁生长。然后除去培养基，加入不同浓度的化合物，每个浓度设置五个复孔，孵育时间为16h，然后将含有化合物的培养基吸出，加入新鲜培养基，用卤素灯给予光照(λ》590nm,光剂量54j/cm2)，再孵育24h后将培养基吸出，向96孔板中加入cck-8含量为10％的培养基100μl,培养箱中放置2h后，然后用酶标仪测试450nm处的吸光度(od值)。细胞活力通过以下公式计算：细胞活力＝[(实验组od值-调零孔od值)/(对照组od值-调零孔od值)]
×
100％。
[0088]
细胞暗毒性测试不加光照，其余采用和光毒性相同的测试方法。
[0089]
(3)具体结果见表2。结果表明，在所测试三种肿瘤细胞模型中，化学物2抑制活性相对较好，优于阳性对照bdp-4。本发明的化合物可进一步开发为新型光动力抗肿瘤光敏剂。
[0090]
表2.化合物在b16-f10,a375和hela三种肿瘤细胞株中的光毒性和暗毒性
[0091][0092]
实施例10：细胞器定位实验
[0093]
光敏剂的定位性质决定了光动力作用的位点，影响细胞死亡机制。在光动力反应中，一般认为ii型反应产生的单线态氧起主要作用，由于单线态氧具有很短的半衰期(0.03to 0.18ms)和有限的扩散距离(《0.04μm)，因此光敏剂在肿瘤细胞中的分布位置就是光敏剂发挥作用的位点。因此，为了研究化合物2的细胞器定位能力，开展了细胞器共定位实验。实验使用激光共聚焦活细胞工作站，将b16-f10细胞分别用化合物和市售细胞器染料孵育后，根据两者的定位重合能力判断其定位效果。
[0094]
b16-f10细胞接种于培养皿中，然后在含5％co2的培养箱中37℃条件下孵育12h,吸除培养基，加入含化合物2(5μm)的新鲜培养基，培养箱中孵育16h。之后用pbs润洗细胞三次，然后分别用mito-tracker green(250nm),lyso-tracker green(500nm)或er-tracker green(2μm)孵育40min，然后用pbs润洗三次，加入新鲜的培养基，然后进行共聚焦定位成像(leica tcs sp8活细胞成像工作站)。
[0095]
如图1所示，图a1、a2、a3是细胞在明场下的形态，b1、b2、b3分别是细胞经线粒体、溶酶体和内质网定位探针孵育后的绿色荧光图像，c1、c2、c3是细胞经化合物2孵育后的红色荧光图像，d1、d2、d3是相应探针的绿色荧光和化合物红色荧光的叠合图像。从d1、d2、d3的定位效果显示，化合物2在线粒体、溶酶体和内质网均有分布，说明可能通过多种细胞死亡方式发挥光动力作用。
[0096]
实施例11：细胞内活性氧水平测试
[0097]
在光动力反应中，光敏剂通过i型反应和ii型反应产生的活性氧杀死肿瘤细胞。为了进一步更直观的研究光动力反应中产生的活性氧水平，我们采用市售的活性氧探针h2dcfda检测化合物2在细胞内活性氧水平。
[0098]
b16-f10细胞用不同浓度(10,20,100nm)的化合物2孵育，之后加入活性氧探针h2dcfda(10μm)孵育，给予光剂量54j/cm2。对照组用化合物2(100nm)孵育，不加光照，其余和实验组相同处理。然后用cytoflex s流式细胞仪(beckman,usa)检测胞内活性氧水平。如图2所示，和对照组a相比，b、c、d三个实验组均有显著性差异，而且在测试浓度范围内，活性氧的产生和化合物2的浓度呈现剂量依赖的方式。
[0099]
实施例12：细胞凋亡实验
[0100]
实验采用b16-f10细胞，将细胞接种于六孔板中，然后在含5％co2的培养箱中37℃条件下孵育12h。之后，吸除原有培养基，分别加入不同浓度的化合物2，孵育16h,给予光剂量54j/cm2，然后用pbs冲洗三次，加入新鲜的培养基，之后继续孵育24h。对照组a(250nm)不给予光照。采用annexin v-fitc和pi(beyotime,china)双染色法评价细胞坏死和凋亡，实验仪器为cytoflex s流式细胞仪(beckman,usa)。实验采用光剂量为54j/cm2，实验结果如图3所示：浓度在10nm时，b组的凋亡率达到了10.23％；浓度在50nm时，c组的凋亡率达到了54.62％；浓度在250nm时，d组的凋亡率为95.96％；对照组a的凋亡率只有8.80％。数据表明，c组和d组同对照组相比有显著差异，并且化合物2对细胞凋亡的影响呈现浓度依赖性。
[0101]
实施例13：b16-f10小鼠移植瘤实验
[0102]
实验选用bdp-4和市售的光敏剂ce6作为参比，研究化合物2在小鼠体内的抗肿瘤活性。在小鼠右背部接种b16-f10肿瘤细胞，每个肿瘤接种细胞密度为3
×
105。在接种后第七天，选用体重在18-22g之间，肿瘤体积在80-100mm3的小鼠用于实验。小鼠随机分为四个组：对照组，ce6实验组，bdp-4实验组，化合物2实验组，每组五只。对照组给予等量生理盐水，实验组采用尾静脉注射方法注射化合物溶液(2mg/kg)，注射12h后给予肿瘤部位光照，光源为激光灯(发射功率200mw/cm2)，每只小鼠照射时间为5min,总光剂量为60j/cm2。给予光照后，将所有小鼠置于动物房中饲养，隔天用游标卡尺记录肿瘤的长径(l)和短径(w)，用天平称量小鼠体重。肿瘤体积计算公式：v＝0.5
×
(l
×
w2)。
[0103]
实验结果如图4所示，图a表示14天后各组肿瘤离体图片，图b表示各组肿瘤生长曲线，图c表示各组肿瘤重量，图d表示生长期间各组小鼠体重变化情况，图e表示各种肿瘤组织的h&e染色。bdp-4组和化合物2组的肿瘤体积和重量明显低于对照组和ce6组，其中化合物2组的两个肿瘤完全消失。在光照后第6天开始，化合物2组和adpm06组肿瘤开始反弹，之后随着时间延长，adpm06组肿瘤生长速度逐渐高于化合物2组。实验组和对照组小鼠体重无明显差异。h&e肿瘤组织染色表明，bdp-4组和化合物2组的肿瘤组织发生了明显的损伤，对照组和ce6组肿瘤组织无明显变化。因此，化合物2在b16-f10移植瘤模型中的抗肿瘤效果优于bdp-4及市售光敏剂ce6。

技术特征：
1.如下式(ⅰ)或(ⅰi)结构氨基酸修饰的bodipy类化合物：其中：r1、r2独立地选自苯基、c
1-6
烷基取代的苯基、c
1-6
烷氧基取代的苯基、卤素取代的苯基；r3选自羟基、-nr4；其中r4选自氨基酸残基；虚线为c-c键或不存在。2.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其中r1、r2选自苯基。3.根据权利要求1-2任一项所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其中r4选自天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天门冬酰胺残基、甘氨酸残基。4.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其特征是，所述的化合物为具有下述结构的化合物1，5.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其特征是，所述的化合物为具有下述结构的化合物2，6.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其特征是，所述的化合物为具有下述结构的化合物3，
7.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其特征是，所述的化合物为具有下述结构的化合物4，8.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其特征是，所述的化合物为具有下述结构的化合物5，9.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其特征是，所述的化合物为具有下述结构的化合物6，10.根据权利要求1所述的氨基酸修饰的bodipy类化合物，其特征是，所述的化合物为具有下述结构的化合物7，
11.权利要求1-10任一项所述氨基酸修饰的bodipy类化合物在制备光动力治疗药物中的用途。12.权利要求1-10任一项所述氨基酸修饰的bodipy类化合物在制备治疗恶性肿瘤药物中的用途。13.按权利要求12的用途，其特征在于，所述的恶性肿瘤选自皮肤癌、前列腺癌、口腔鳞癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌及食道癌。

技术总结
本发明属药物合成技术领域，涉及氨基酸修饰的BODIPY类化合物，具体涉及如下式的含氨基酸残基或羟基取代的BODIPY类化合物，及其制备方法和在制药中的应用。本发明的化合物经试验显示，通过发生光动力作用，起到显著抑制肿瘤生长的作用。所述的化合物具有良好的抗肿瘤活性，可进一步制备光动力治疗药物和抗恶性肿瘤药物，用于治疗皮肤癌、前列腺癌、口腔鳞癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌及食道癌等恶性肿瘤。及食道癌等恶性肿瘤。及食道癌等恶性肿瘤。


技术研发人员：赵伟利 董肖椿 喻支梁 刘唱
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2022.01.26
技术公布日：2023/8/5