靶向SARS-CoV-2的抗原结合分子的制作方法

靶向sars-cov-2的抗原结合分子
1.相关申请
2.本技术要求于2020年7月6日提交的美国临时申请号63/048,588以及于2020年8月25日提交的美国临时申请号63/070,038的权益。将上述申请的全部传授内容通过援引并入本文。
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5.a)文件名：57081009002_sequence_listing.txt；创建于2021年7月2日，大小为55kb。


背景技术：

6.sars-冠状病毒-2(sars-cov-2)是一种新型冠状病毒，引起了聚集性肺炎病例(covid-19)。
7.covid-19在世界各地迅速传播，从而导致了大流行。世界卫生组织于2020年4月21日发布了冠状病毒病(covid-2019)情况报告，报告了2,397,216例确诊感染和162,956例死亡病例。其中，在过去24小时内增加了83,006例新病例和5,109例死亡病例。依靠检疫、隔离和感染控制措施来防止疾病传播，并为患病者提供支持性护理(baden和rubin,n engl j med.[新英格兰医学杂志],(2020))。


技术实现要素：

[0008]
急需开发用于预防covid-19传播以及治疗covid-19患者的特定抗病毒治疗剂。
[0009]
本文披露的本发明部分地基于以下发现：本发明的多肽与严重急性呼吸综合征冠状病毒2的刺突糖蛋白(sars-cov-2-刺突蛋白)特异性结合。因此，本发明总体上涉及可用于减少刺突蛋白(例如，sars-cov-2-刺突蛋白)介导的病毒进入细胞中的组合物(例如，多肽、药物组合物)和方法。
[0010]
本文提供了与sars-cov-2-刺突蛋白特异性结合的多肽。在一方面，本发明提供了特异性结合sars-cov-2-刺突蛋白的多肽，其中该多肽包含与选自以下的抗体的互补位相同的互补位：
[0011]
a)包含seq id no:4和seq id no:13的抗体；
[0012]
b)包含seq id no:5和seq id no:13的抗体；
[0013]
c)包含seq id no:6和seq id no:13的抗体；
[0014]
d)包含seq id no:7和seq id no:14的抗体；
[0015]
e)包含seq id no:8和seq id no:15的抗体；
[0016]
f)包含seq id no:9和seq id no:13的抗体；
[0017]
g)包含seq id no:10和seq id no:13的抗体；
[0018]
h)包含seq id no:41和seq id no:13的抗体；
[0019]
i)包含seq id no:42和seq id no:13的抗体
[0020]
j)包含seq id no:43和seq id no:47的抗体；
[0021]
k)包含seq id no:44和seq id no:48的抗体；或
[0022]
l)包含seq id no:45和seq id no:49的抗体。
[0023]
在另一方面，本发明提供了一种特异性结合sars-cov-2-刺突蛋白的多肽，其中该多肽包含：
[0024]
a)免疫球蛋白重链可变区(vh)，该免疫球蛋白重链可变区包含各自分别与seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45的重链互补决定区1(hcdr1)、重链互补决定区2(hcdr2)和重链互补决定区3(hcdr3)相同的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和
[0025]
b)免疫球蛋白轻链可变区(v
l
)，该免疫球蛋白轻链可变区包含各自分别与seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49的轻链互补决定区1(lcdr1)、轻链互补决定区2(lcdr2)和轻链互补决定区3(lcdr3)相同的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0026]
在一些实施例中，该多肽包含选自以下的抗体的hcdr1、hcdr2和hcdr3以及lcdr1、lcdr2和lcdr3：
[0027]
a)包含seq id no:4和seq id no:13的抗体；
[0028]
b)包含seq id no:5和seq id no:13的抗体；
[0029]
c)包含seq id no:6和seq id no:13的抗体；
[0030]
d)包含seq id no:7和seq id no:14的抗体；
[0031]
e)包含seq id no:8和seq id no:15的抗体；
[0032]
f)包含seq id no:9和seq id no:13的抗体；
[0033]
g)包含seq id no:10和seq id no:13的抗体；
[0034]
h)包含seq id no:41和seq id no:13的抗体；
[0035]
i)包含seq id no:42和seq id no:13的抗体；
[0036]
j)包含seq id no:43和seq id no:47的抗体；
[0037]
k)包含seq id no:44和seq id no:48的抗体；或
[0038]
l)包含seq id no:45和seq id no:49的抗体。
[0039]
在一些实施例中，该多肽进一步包含与包含以下的抗体的互补位相同的互补位：
[0040]
a)seq id no:4和seq id no:13；
[0041]
b)seq id no:5和seq id no:13；
[0042]
c)seq id no:6和seq id no:13；
[0043]
d)seq id no:7和seq id no:14；
[0044]
e)seq id no:8和seq id no:15；
[0045]
f)seq id no:9和seq id no:13；
[0046]
g)seq id no:10和seq id no:13；
[0047]
h)seq id no:41和seq id no:13；
[0048]
i)seq id no:42和seq id no:13；
[0049]
j)包含seq id no:43和seq id no:47的抗体；
[0050]
k)包含seq id no:44和seq id no:48的抗体；或
[0051]
l)包含seq id no:45和seq id no:49的抗体。
[0052]
在又一方面，本发明提供了一种包含含有seq id no:2的vh的多肽，其中：
[0053]
a)x1不是t；
[0054]
b)x2不是r；
[0055]
c)x3不是s；
[0056]
d)x4不是t；
[0057]
e)x5不是t；
[0058]
f)x6不是l；
[0059]
g)x7不是l；
[0060]
h)x8不是r；
[0061]
i)x9不是t；
[0062]
j)x
10
不是l；或者
[0063]
k)x
11
不是y，
[0064]
或前述内容的任何组合。
[0065]
在一些实施例中，该多肽进一步包含含有seq id no:11的v
l
，其中：
[0066]
a)x
12
不是s；
[0067]
b)x
13
不是l；或者
[0068]
c)x
14
不是v，
[0069]
或前述内容的任何组合。
[0070]
在又一方面，本发明提供了一种包含特异性结合sars-cov-2-刺突蛋白的多肽，该多肽包含含有seq id no:46的vh，其中：
[0071]
x1是e或q；
[0072]
x2是p或s；
[0073]
x3是a或e；
[0074]
x4是l或v；
[0075]
x5是i或v；
[0076]
x6是s或t；
[0077]
x7是a或m；
[0078]
x8是k或q；
[0079]
x9是g或s；
[0080]
x
10
是n、q或r；
[0081]
x
11
是a或s；
[0082]
x
12
是p或q；
[0083]
x
13
是k或s；
[0084]
x
14
是q或r；
[0085]
x
15
是l或m；
[0086]
x
16
是s或t；
[0087]
x
17
是a或v；
[0088]
x
18
是k或t；
[0089]
x
19
是s或t；
[0090]
x
20
是l或m；
[0091]
x
21
是e或q；
[0092]
x
22
是l或w；
[0093]
x
23
是n或s；
[0094]
x
24
是r或s；
[0095]
x
25
是k或r；
[0096]
x
26
是a或s；
[0097]
x
27
是d或s；
[0098]
x
28
是m或v；
[0099]
x
29
是f或y；
[0100]
x
30
是n或r；或者
[0101]
x
31
是v或y，
[0102]
或前述内容的任何组合。
[0103]
在一些实施例中，该多肽进一步包含含有seq id no:50的v
l
，其中：
[0104]
x
32
是d或e；
[0105]
x
33
是q或v；
[0106]
x
34
是l或m；
[0107]
x
35
是g或s；
[0108]
x
36
是s或t；
[0109]
x
37
是a或l；
[0110]
x
38
是p或v；
[0111]
x
39
是d或e；
[0112]
x
40
是a或v；
[0113]
x
41
是i或l；
[0114]
x
42
是s或t；
[0115]
x
43
是e或g；
[0116]
x
44
是a、n或s；
[0117]
x
45
是l或y；
[0118]
x
46
是e或g；
[0119]
x
47
是k或q；
[0120]
x
48
是k或r；
[0121]
x
49
是s或t；
[0122]
x
50
是a或q；
[0123]
x
51
是s或t；
[0124]
x
52
是i或v；
[0125]
x
53
是d或s；
[0126]
x
54
是r或s；
[0127]
x
55
是e或q；
[0128]
x
56
是t或v；
[0129]
x
57
是l或q；或者
[0130]
x
58
是l或v，
[0131]
或前述内容的任何组合。
[0132]
在另一方面，本发明提供了一种特异性结合sars-cov-2-刺突蛋白的多肽，该多肽包含：
[0133]
a)与seq id no:3具有至少70％同一性的vh序列；
[0134]
b)与seq id no:12具有至少70％同一性的v
l
序列；或
[0135]
c)其组合，
[0136]
其中该vh序列不包含seq id no:3，该v
l
序列不包含seq id no:12或两者。
[0137]
在一些实施例中，本发明的多肽是融合蛋白。
[0138]
在其他方面，本发明提供了一种编码本文披露的多肽的多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体、和包含这种多核苷酸或载体的宿主细胞。
[0139]
在另一方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者(例如，患有sars-cov感染，诸如covid-19的受试者)的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本文披露的多肽或包含本文披露的多肽的组合物(例如，药物组合物)。
[0140]
在另一方面，本发明提供了一种抑制sars-cov-2-刺突蛋白与细胞(例如，受试者的细胞)之间的融合的方法，该方法包括使该细胞与有效量的包含本文披露的多肽的组合物或包含本文披露的多肽的组合物(例如，药物组合物)接触。
附图说明
[0141]
本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。应请求并且支付必要的费用后，具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由专利局提供。
[0142]
前述内容将根据以下对示例性实施例的更具体描述而变得清楚，如附图中说明，在附图中相同的附图符号在不同的视图中是指相同的部分。附图并非必定按比例，而是将重点放在说明实施例上。
[0143]
图1描绘了sars-cov-2-刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)的氨基酸序列。本文披露的参考抗体所结合的表位残基用星号指示。
[0144]
图2a描绘了可用于本发明的多肽的重链可变(vh)序列的非限制性实例的比对。重链互补决定区(hcdr)序列使用粗体字母和下划线指示。“*”指示互补位残基。xn的位置通过比对底部的对应数字指示，其中n是从1-11的数字。还参见表1中的vh共有序列a(seq id no:2)。
[0145]
图2b描绘了可用于本发明的多肽的轻链可变(v
l
)序列的非限制性实例的比对。轻链互补决定区(lcdr)序列使用粗体文本和下划线指示。“*”指示互补位残基。xn的位置通过比对底部的对应数字指示，其中n是从12-14的数字。还参见表1中的v
l
共有序列a(seq id no:11)。
[0146]
图3a描绘了可用于本发明的多肽的重链可变(vh)序列的非限制性实例的比对。重链互补决定区(hcdr)序列使用粗体字母和下划线指示。“*”指示互补位残基。xn的位置通过
比对底部的对应数字指示，其中n是从1-31的数字。还参见表1中的vh共有序列b(seq id no:46)。
[0147]
图3b描绘了可用于本发明的多肽的轻链可变(v
l
)序列的非限制性实例的比对。轻链互补决定区(lcdr)序列使用粗体文本和下划线指示。“*”指示互补位残基。xn的位置通过比对底部的对应数字指示，其中n是从32-58的数字。还参见表1中的v
l
共有序列b(seq id no:50)。
[0148]
图4a描绘了可用于本发明的多肽的重链可变(vh)序列的非限制性实例的比对。重链互补决定区(hcdr)序列使用粗体字母和下划线指示。“*”指示互补位残基。xn的位置通过比对底部的对应数字指示，其中n是从1-55的数字。
[0149]
图4b描绘了可用于本发明的多肽的轻链可变(v
l
)序列的非限制性实例的比对。轻链互补决定区(lcdr)序列使用粗体文本和下划线指示。“*”指示互补位残基。xn的位置通过比对底部的对应数字指示，其中n是从56-94的数字。
[0150]
图5说明了本发明的多肽(ab-8，igg)中和突变体sars-cov-2假病毒的能力。这些条表示相对于亲本d614g亲本病毒携带新突变或缺失的假病毒的抗体中和的ic
50
值的倍数差异(wt-突变体)/(wt)。-2.5与2.5之间的值在此测定中被认为是不显著的。
[0151]
图6描绘了用生物层干涉技术测量的人源化igg1抗体(灰色条)和种子抗体(黑色条)对于cov-2rbd的亲和力。
[0152]
图7描绘了用生物层干涉技术测量的人源化igg1抗体(灰色迹线)和种子抗体(黑色迹线)对于cov-2rbd的缔合和解离。
具体实施方式
[0153]
示例性实施例的描述如下。
[0154]
参考仅用于说明性目的的实例，以下描述了本发明的若干方面。应理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个的情况下实践或通过其他方法、方案、试剂、细胞系和动物实践本发明。本发明不受动作或事件的示出顺序的限制，因为某些动作可以以不同的顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并不需要所有示出的动作、步骤或事件来实施根据本发明的方法。本领域技术人员很好地理解并且通常使用常规方法来采用本文描述或引用的许多技术和程序。
[0155]
结合sars-cov-2刺突蛋白的多肽
[0156]
sars-cov-2是covid-19的病原体。sars-cov-2-刺突蛋白或sars-cov-2的s蛋白是有利于sars-cov-2病毒进入宿主细胞(诸如人宿主细胞)中的蛋白质。在不受理论约束的情况下，据信sars-cov-2-刺突蛋白通过与宿主细胞表面上的进入受体(例如，血管紧张素转换酶2(ace2)或跨膜蛋白酶丝氨酸2(tmprss2))结合来促进感染。野生型sars-cov-2-刺突蛋白序列的一个非限制性实例是ncbi refseqyp_009724390(seq id no:1)。
[0157]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldpl
setkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt(seq id no:1)。
[0158]
如本文所用，sars-cov-2刺突蛋白包括野生型sars-cov-2刺突蛋白(例如，seq id no:1)、野生型sars-cov-2刺突蛋白的变体、以及野生型和变体sars-cov-2刺突蛋白的修饰形式。
[0159]
在一方面，本发明提供了一种与包含seq id no:1的sars-cov-2刺突蛋白结合的多肽。
[0160]
在一些实施例中，该多肽与sars-cov-2-刺突蛋白的变体结合。在一些实施例中，该变体包含与野生型sars-cov-2-刺突蛋白序列(例如，seq id no:1)具有至少约90％序列同一性，例如与野生型sars-cov-2-刺突蛋白序列具有至少约：91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该序列同一性是约：90％-99.9％、90％-99.8％、92％-99.8％、92％-99.6％、94％-99.6％、94％-99.5％、95％-99.5％、95％-99.4％、96％-99.4％、96％-99.2％、97％-99.2％或97％-99％。
[0161]
在一些实施例中，相对于seq id no:1，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含选自以下的一个或多个突变：l5f、s13i、t19r、a67v、69del、70del、d80g、t95i、g142d、144del、w152c、e154k、f157s、a222v、d253g、g261d、v367f、k417n、n439k、l452r、y453f、s477n、e484k、f486l、s494p、e484q、n501t、n501y、f565l、a570d、d614g、q677h、p681h、p681r、a701v、t716i、t859n、f888l、s982a、d950n、q957r、q1071h、v1176f、d1118h、k1191n、或其组合，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或全部45个。
[0162]
在一些实施例中，相对于seq id no:1，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含选自以下的一个或多个突变：69del、70del、144del、e484k、s494p、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、d1118h或k1191n、或其组合。在一些实施例中，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含69del、70del、144del、n501y、a570d、d614g、p681h、t716i、s982a、和d1118h。在一些实施例中，该变体sars-cov-2-刺突蛋白进一步包含e484k、s494p或k1191n、或其组合。
[0163]
在一些实施例中，相对于seq id no:1，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含选自以
下的一个或多个突变：d80a、d215g、241del、242del、243del、k417n、e484k、n501y、d614g或a701v、或其组合。在一些实施例中，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含d80a、d215g、241del、242del、243del、k417n、e484k、n501y、d614g、和a701v。
[0164]
在一些实施例中，相对于seq id no:1，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含选自以下的一个或多个突变：t19r、g142d、156del、157del、r158g、l452r、t478k、d614g、p681r或d950n、或其组合。在一些实施例中，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含t19r、156del、157del、r158g、l452r、t478k、d614g、p681r、和d950n。在一些实施例中，该变体sars-cov-2-刺突蛋白进一步包含或g142d。
[0165]
在一些实施例中，相对于seq id no:1，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含选自以下的一个或多个突变：69del、70del、144del、a222v、g261d、v367f、k417n、n439k、y453f、s477n、e484k、f486l、n501t、n501y、a570d或d614g、或其组合。
[0166]
在一些实施例中，相对于seq id no:1，该变体sars-cov-2-刺突蛋白包含选自以下的一个或多个突变：e484k、n501y或d614g、或其组合。
[0167]
在一些实施例中，相对于seq id no:1，该修饰的sars-cov-2刺突蛋白包含选自以下的一个或多个突变：f817p、a892p、a899p、a942p、k986p、v987p。
[0168]
在一些实施例中，该多肽结合sars-cov-2刺突蛋白受体结合结构域(rbd)(seq id no:52)或rbd内的表位(例如，rbd 5(图1))。
[0169]
rvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgp(seq id no:52)。
[0170]
在一些实施例中，该多肽与rbd的变体或rbd内的表位结合。在一些实施例中，该变体包含与野生型rbd(例如，seq id no:52)或野生型rbd 5(图1)具有至少约90％序列同一性，例如具有至少约：91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或99.9％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该序列同一性是约：90％-99.9％、90％-99.8％、92％-99.8％、92％-99.6％、94％-99.6％、94％-99.5％、95％-99.5％、95％-99.4％、96％-99.4％、96％-99.2％、97％-99.2％或97％-99％。
[0171]
在一些实施例中，该多肽与sars-cov-2刺突蛋白(例如，seq id no:1或seq id no:52)结合，并且包含免疫球蛋白轻链可变区、免疫球蛋白重链可变区、或免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，其中该多肽不包含全部五个seq id no:17、seq id no:21、seq id no:24、seq id no:31和seq id no:35。在一些实施例中，该多肽包含1、2、3或4个选自seq id no:17、seq id no:21、seq id no:24、seq id no:31和seq id no:35的cdr。
[0172]
在另一方面，本发明提供了一种特异性结合sars-cov-2刺突蛋白的多肽，其中该多肽包含：
[0173]
a)免疫球蛋白重链可变区(vh)，该免疫球蛋白重链可变区包含与seq id no:4具有至少55％(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)同一性的氨基酸序列；
[0174]
b)免疫球蛋白轻链可变区(v
l
)，该免疫球蛋白轻链可变区包含与seq id no:55具
有至少55％(例如，至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％)同一性的氨基酸序列；或
[0175]
c)a)和b)两者，
[0176]
其中该多肽不包含全部五个seq id no:17、seq id no:21、seq id no:24、seq id no:31和seq id no:35。在一些实施例中，该多肽包含1、2、3或4个选自seq id no:17、seq id no:21、seq id no:24、seq id no:31和seq id no:35的cdr。
[0177]
在一些实施例中，该多肽与野生型sars-cov-2刺突蛋白(例如，seq id no:1)结合。在一些实施例中，该多肽与野生型sars-cov-2刺突蛋白的一个或多个表位残基(例如，一个或多个表位残基)结合。
[0178]
如本文所用，术语“参考”或“参考多肽”是指与sars-cov-1特异性结合的多肽(例如，免疫球蛋白分子)，并且不是本发明的多肽。可以将参考多肽和本发明的多肽的序列进行比较以说明它们之间的结构差异(例如，一个或多个氨基酸位置处的差异，诸如氨基酸取代)。在一些实施例中，本发明的多肽与参考多肽相比将具有超过非实质性差异(例如，一个或多个实质性差异)，使得本发明的多肽通常将在受控条件下表现出以下中的一种或多种(即，一种、两种、或全部三种)：与参考多肽相比以不同的方式表现出不同的功能以实现不同的结果。参考多肽相对于本发明的多肽的不同之处在于一个或多个氨基酸，例如，在一些实施例中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸。在某些实施例中，参考多肽相对于本发明提供的多肽偏离至少约：0.4％、0.8％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或更多氨基酸同一性。
[0179]
如本文所用，术语“序列同一性”是指当序列对齐以实现最大同一性水平(以百分比表示)时，两个核苷酸序列或两个氨基酸序列在相同位置处具有相同残基的程度。对于序列比对和比较，典型地将一个序列指定为测试序列与其进行比较的参考序列。参考序列与测试序列之间的序列同一性表示为参考序列的整个长度上的位置的百分比，在该位置处参考序列和测试序列在参考序列和测试序列对齐时共享相同的核苷酸或氨基酸，以实现最大同一性水平。作为实例，当在对齐以实现最大同一性水平时，测试序列在参考序列的整个长度上在70％的相同位置处具有相同的核苷酸或氨基酸残基时，两个序列被认为具有70％的序列同一性。
[0180]
用于比较以实现最大同一性水平的序列比对可以由本领域普通技术人员使用适当的比对方法或算法容易地进行。在一些情况下，比对可以包括引入间隙，以提供最大同一性水平。实例包括smith和waterman,adv.appl.math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、needleman和wunsch,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源性比对算法、pearson和lipman,proc.nat'l.acad.sci.usa[美国科学院院报]85:2444(1988)的皮尔逊相似度搜索方法、这些算法的计算机实现方式(威斯康星遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta、和tfasta，遗传学计算机课题组，575science dr.,madison,wis.)、以及目视检查(通常参见ausubel等人,current protocols in molecular biology[最新分子生物学实验方法汇编])。
[0181]
当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定后续坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算一个或多
个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于确定序列同一性百分比的常用工具是蛋白质基本局部比对搜索工具(blastp)，通过美国国立卫生研究院的美国国家医学图书馆的美国国家生物技术信息中心可用。(altschul等人,1990)。
[0182]
术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”代表通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的聚合物，无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)如何。蛋白质、肽或多肽可以包含任何合适的l-和/或d-氨基酸，例如常见的α-氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸)、非α-氨基酸(例如，β-丙氨酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸(statine))、和不寻常的氨基酸(例如，瓜氨酸、同型瓜氨酸、同型丝氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸)。肽上的氨基、羧基和/或其他官能团可以是游离的(例如，未修饰的)或用合适的保护基团保护。用于氨基和羧基基团的合适保护基团以及用于添加或去除保护基团的方法是本领域已知的，并且披露于例如green和wuts,“protecting groups in organic synthesis[有机合成中的保护基团],”约翰
·
威利父子出版公司(john wiley and sons),1991。蛋白质、肽或多肽的官能团也可以使用本领域已知的方法衍生化(例如，烷基化)或标记(例如，用可检测标记，诸如荧光团或半抗原)。如果需要，蛋白质、肽或多肽可以包含一种或多种修饰(例如，氨基酸接头、酰化、乙酰化、酰胺化、甲基化、末端改性剂(例如，环化修饰)、n-甲基-α-氨基基团取代)。另外，蛋白质、肽或多肽可以是已知和/或天然存在的肽的类似物，例如，具有一个或多个保守氨基酸残基取代的肽类似物。
[0183]
在一方面，本发明提供了一种特异性结合sars-cov-2-刺突蛋白的多肽，其中该多肽包含与选自以下的抗体的互补位相同的互补位：
[0184]
a)包含seq id no:4和seq id no:13的抗体；
[0185]
b)包含seq id no:5和seq id no:13的抗体；
[0186]
c)包含seq id no:6和seq id no:13的抗体；
[0187]
d)包含seq id no:7和seq id no:14的抗体；
[0188]
e)包含seq id no:8和seq id no:15的抗体；
[0189]
f)包含seq id no:9和seq id no:13的抗体；
[0190]
g)包含seq id no:10和seq id no:13的抗体；
[0191]
h)包含seq id no:41和seq id no:13的抗体；
[0192]
i)包含seq id no:42和seq id no:13的抗体；
[0193]
j)包含seq id no:43和seq id no:47的抗体；
[0194]
k)包含seq id no:44和seq id no:48的抗体；或
[0195]
l)包含seq id no:45和seq id no:49的抗体。
[0196]
关于seq id no:4-10、13-15、41-45、和47-49，参见表1，并且关于包含seq id no:4-10、13-15、41-45、和47-49的抗体的互补位残基，参见图2a-4b。
[0197]
术语“互补位”是指抗体或其抗原结合片段中的一组氨基酸残基，它们有助于与靶蛋白的表位的结合相互作用。结合相互作用可以是氢键、盐桥、范德华相互作用、离子键或其组合。结合相互作用可以是直接的或间接的，例如，经由配位的中间体分子，诸如离子或水。在一些实施例中，互补位的残基仅包含作为定义的cdr的一部分的残基。在其他实施例中，互补位的残基进一步包含一个或多个不是定义的cdr的一部分的残基。
[0198]
在一些实施例中，当多肽与靶抗原结合时，互补位定向为距离靶抗原上的表位小
于约5.0埃，例如距离该表位小于约：4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0或0.9埃，或约：0.9-5.0、0.9-4.8、1.0-5、1.0-4.5、1.0-4.0、1.0-3.5、1.1-3.5、1.1-3.0、1.2-3.0、1.2-2.5、1.3-2.5、1.3-2.4、1.4-2.4、1.4-2.3、1.5-2.3、1.5-2.2、1.6-2.2、1.6-2.1、1.7-2.1、1.7-2.0或1.8-2.0埃。在一些实施例中，当多肽与靶抗原结合时，构成互补位的所有氨基酸残基定向为距离靶抗原上的表位小于约5.0埃。在其他实施例中，当多肽与靶抗原结合时，互补位中构成互补位的并非所有氨基酸残基(例如，氨基酸残基的约40％、50％、60％、70％、80％、90％)定向为距离靶抗原上的表位小于约5.0埃。
[0199]
在一些实施例中，包含本文披露的互补位的多肽包含免疫球蛋白重链可变区(vh)和免疫球蛋白轻链可变区(v
l
)。在某些实施例中，互补位残基包含在多肽的vh和v
l
内。
[0200]
在另一方面，本发明提供了一种特异性结合sars-cov-2-刺突蛋白的多肽，其中该多肽包含：
[0201]
a)vh，该vh包含各自分别与seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45的hcdr1、hcdr2和hcdr3相同的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和
[0202]
b)v
l
，该v
l
包含各自分别与seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49的lcdr1、lcdr2和lcdr3相同的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0203]
在一些实施例中，该多肽包含选自以下的抗体的hcdr1、hcdr2和hcdr3以及lcdr1、lcdr2和lcdr3：
[0204]
a)包含seq id no:4和seq id no:13的抗体；
[0205]
b)包含seq id no:5和seq id no:13的抗体；
[0206]
c)包含seq id no:6和seq id no:13的抗体；
[0207]
d)包含seq id no:7和seq id no:14的抗体；
[0208]
e)包含seq id no:8和seq id no:15的抗体；
[0209]
f)包含seq id no:9和seq id no:13的抗体；
[0210]
g)包含seq id no:10和seq id no:13的抗体；
[0211]
h)包含seq id no:41和seq id no:13的抗体；
[0212]
i)包含seq id no:42和seq id no:13的抗体；
[0213]
j)包含seq id no:43和seq id no:47的抗体；
[0214]
k)包含seq id no:44和seq id no:48的抗体；或
[0215]
l)包含seq id no:45和seq id no:49的抗体。
[0216]
该cdr(例如，hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和/或lcdr3)可以是由任何本领域公认的用于鉴定抗体的cdr残基的方法定义的cdr，如本文进一步描述(例如，如由kabat定义的cdr，如由chothia定义的cdr)。
[0217]
在一些实施例中，该多肽进一步包含与包含以下的抗体的互补位相同的互补位：
[0218]
a)seq id no:4和seq id no:13；
[0219]
b)seq id no:5和seq id no:13；
[0220]
c)seq id no:6和seq id no:13；
[0221]
d)seq id no:7和seq id no:14；
[0222]
e)seq id no:8和seq id no:15；
[0223]
f)seq id no:9和seq id no:13；
[0224]
g)seq id no:10和seq id no:13；
[0225]
h)seq id no:41和seq id no:13；
[0226]
i)seq id no:42和seq id no:13；
[0227]
j)seq id no:43和seq id no:47；
[0228]
k)seq id no:44和seq id no:48；或
[0229]
l)seq id no:45和seq id no:49。
[0230]
在另一方面，本发明提供了一种包含特异性结合sars-cov-2-刺突蛋白的多肽，该多肽包含含有seq id no:2的vh，其中：
[0231]
a)x1不是t；
[0232]
b)x2不是r；
[0233]
c)x3不是s；
[0234]
d)x4不是t；
[0235]
e)x5不是t；
[0236]
f)x6不是l；
[0237]
g)x7不是l；
[0238]
h)x8不是r；
[0239]
i)x9不是t；
[0240]
j)x
10
不是l；或者
[0241]
k)x
11
不是y，
[0242]
或前述内容的任何组合。
[0243]
以下示出了鉴定为seq id no:2的序列，该序列是本文中的seq id no:3-10的共有vh序列。
[0244]
evqleesgtvlarpgasvkmsckasgytftx1yx2mhwikqrpgqglewigaiypgnx3dtx4ynqkfkdkakltavx5stssaymelssltnedsavyfctregipqx6x7x8x9x
10
d x
11
wgqgtsvtvss(seq id no:2)。
[0245]
在一些实施例中，本文披露的多肽进一步包含v
l
。在一些实施例中，该多肽包含含有seq id no:11的v
l
，其中：
[0246]
a)x
12
不是s；
[0247]
b)x
13
不是l；或者
[0248]
c)x
14
不是v，
[0249]
或前述内容的任何组合。
[0250]
以下示出了鉴定为seq id no:11的序列，该序列是本文中的seq id no:12-15的共有v
l
序列：
[0251]
dilmtqspsslsaslgervsltcrasqeix
12
gylswlqekpdgtikrliyaastldsgvpkrfsgsrsgsdysltisslesedfadyycx
13
qyx
14
sypwtfgggtkleik(seq id no:11)。
[0252]
在一些实施例中：
[0253]
a)x1是t或s；
[0254]
b)x2是r或w；
[0255]
c)x3是s或g；
[0256]
d)x4是t、q或n；
[0257]
e)x5是t或k；
[0258]
f)x6是l或k；
[0259]
g)x7是l或t；
[0260]
h)x8是r或n；
[0261]
i)x9是t或s；
[0262]
j)x
10
是l或f；或者
[0263]
k)x
11
是y或v，
[0264]
或前述内容的任何组合。
[0265]
在一些实施例中：
[0266]
a)x1是s；
[0267]
b)x2是w；
[0268]
c)x3是g；
[0269]
d)x4是q或n；
[0270]
e)x5是k；
[0271]
f)x6是k；
[0272]
g)x7是t；
[0273]
h)x8是n；
[0274]
i)x9是s；
[0275]
j)x
10
是f；或者
[0276]
k)x
11
是v，
[0277]
或前述内容的任何组合。
[0278]
在一些实施例中，x1不是t。在一些实施例中，x1是t或s。在一些实施例中，x1是t。在一些实施例中，x1是s。在一些实施例中，x2不是r。在一些实施例中，x2是r或w。在一些实施例中，x2是r。在一些实施例中，x2是w。在一些实施例中，x3不是s。在一些实施例中，x3是s或g。在一些实施例中，x3是s。在一些实施例中，x3是g。在一些实施例中，x4不是t。在一些实施例中，x4是t、q或n。在一些实施例中，x4是t。在一些实施例中，x4是q。在一些实施例中，x4是n。在一些实施例中，x5不是t。在一些实施例中，x5是t或k。在一些实施例中，x5是t。在一些实施例中，x5是k。在一些实施例中，x6不是l。在一些实施例中，x6是l或k。在一些实施例中，x6是l。在一些实施例中，x6是k。在一些实施例中，x7不是l。在一些实施例中，x7是l或t。在一些实施例中，x7是l。在一些实施例中，x7是t。在一些实施例中，x8不是r。在一些实施例中，x8是r或n。在一些实施例中，x8是r。在一些实施例中，x8是n。在一些实施例中，x9不是t。在一些实施例中，x9是t或s。在一些实施例中，x9是t。在一些实施例中，x9是s。在一些实施例中，x
10
不是l。在一些实施例中，x
10
是l或f。在一些实施例中，x
10
是l。在一些实施例中，x
10
是f。在一些实施例中，x
11
不是y。在一些实施例中，x
11
是y或v。在一些实施例中，x
11
是y。在一些实施例中，x
11
是v。
[0279]
在一些实施例中：
[0280]
a)x
12
是s或g；
[0281]
b)x
13
是l或q；或者
[0282]
c)x
14
是v或l，
[0283]
或前述内容的任何组合。
[0284]
在一些实施例中：
[0285]
a)x
12
是g；
[0286]
b)x
13
是q；或者
[0287]
c)x
14
是l，
[0288]
或前述内容的任何组合。
[0289]
在一些实施例中，x
12
不是s。在一些实施例中，x
12
是s或g。在一些实施例中，x
12
是s。在一些实施例中，x
12
是g。在一些实施例中，x
13
不是l。在一些实施例中，x
13
是l或q。在一些实施例中，x
13
是l。在一些实施例中，x
13
是q。在一些实施例中，x
14
不是v。在一些实施例中，x
14
是v或l。在一些实施例中，x
14
是v。在一些实施例中，x
14
是l。
[0290]
在另一方面，本发明提供了一种包含特异性结合sars-cov-2-刺突蛋白的多肽，该多肽包含含有seq id no:46的vh，其中：
[0291]
x1是e或q；
[0292]
x2是p或s；
[0293]
x3是a或e；
[0294]
x4是l或v；
[0295]
x5是i或v；
[0296]
x6是s或t；
[0297]
x7是a或m；
[0298]
x8是k或q；
[0299]
x9是g或s；
[0300]
x
10
是n、q或r；
[0301]
x
11
是a或s；
[0302]
x
12
是p或q；
[0303]
x
13
是k或s；
[0304]
x
14
是q或r；
[0305]
x
15
是l或m；
[0306]
x
16
是s或t；
[0307]
x
17
是a或v；
[0308]
x
18
是k或t；
[0309]
x
19
是s或t；
[0310]
x
20
是l或m；
[0311]
x
21
是e或q；
[0312]
x
22
是l或w；
[0313]
x
23
是n或s；
[0314]
x
24
是r或s；
[0315]
x
25
是k或r；
[0316]
x
26
是a或s；
[0317]
x
27
是d或s；
[0318]
x
28
是m或v；
[0319]
x
29
是f或y；
[0320]
x
30
是n或r；或者
[0321]
x
31
是v或y，
[0322]
或前述内容的任何组合。
[0323]
以下示出了鉴定为seq id no:46的序列，该序列是本文中的seq id no:43-45的共有vh序列。
[0324]
x1vqlvqsgaevkkx2gx3sx4kx5sckasgytftx6ywmhwvrqx7pgx8glewmgaiypgnx9dtx
10
yx
11
x
12
x
13
fqgx
14
vtx
15
x
16
x
17
dx
18
six
19
tayx
20
x
21
x
22
x
23
x
24
lx
25
x
26
x
27
dtax
28
yx
29
ctregipqllx
30
tldx
31
wgqgtlvtvss(seq id no:46)。
[0325]
在一些实施例中，x1是e或q。在一些实施例中，x1是e。在一些实施例中，x1是q。在一些实施例中，x2是p或s。在一些实施例中，x2是p。在一些实施例中，x2是s。在一些实施例中，x3是a或e。在一些实施例中，x3是a。在一些实施例中，x3是e。在一些实施例中，x4是l或v。在一些实施例中，x4是l。在一些实施例中，x4是v。在一些实施例中，x5是i或v。在一些实施例中，x5是i。在一些实施例中，x5是v。在一些实施例中，x6是s或t。在一些实施例中，x6是s。在一些实施例中，x6是t。在一些实施例中，x7是a或m。在一些实施例中，x7是a。在一些实施例中，x7是m。在一些实施例中，x8是k或q。在一些实施例中，x8是k。在一些实施例中，x8是q。在一些实施例中，x9是g或s。在一些实施例中，x9是g。在一些实施例中，x9是s。在一些实施例中，x
10
是n、q或r。在一些实施例中，x
10
是n。在一些实施例中，x
10
是q。在一些实施例中，x
10
是r。在一些实施例中，x
11
是a或s。在一些实施例中，x
11
是a。在一些实施例中，x
11
是s。在一些实施例中，x
12
是p或q。在一些实施例中，x
12
是p。在一些实施例中，x
12
是q。在一些实施例中，x
13
是k或s。在一些实施例中，x
13
是k。在一些实施例中，x
13
是s。在一些实施例中，x
14
是q或r。在一些实施例中，x
14
是q。在一些实施例中，x
14
是r。在一些实施例中，x
15
是l或m。在一些实施例中，x
15
是l。在一些实施例中，x
15
是m。在一些实施例中，x
16
是s或t。在一些实施例中，x
16
是s。在一些实施例中，x
16
是t。在一些实施例中，x
17
是a或v。在一些实施例中，x
17
是a。在一些实施例中，x
17
是v。在一些实施例中，x
18
是k或t。在一些实施例中，x
18
是k。在一些实施例中，x
18
是t。在一些实施例中，x
19
是s或t。在一些实施例中，x
19
是s。在一些实施例中，x
19
是t。在一些实施例中，x
20
是l或m。在一些实施例中，x
20
是l。在一些实施例中，x
20
是m。在一些实施例中，x
21
是e或q。在一些实施例中，x
21
是e。在一些实施例中，x
21
是q。在一些实施例中，x
22
是l或w。在一些实施例中，x
22
是l。在一些实施例中，x
22
是w。在一些实施例中，x
23
是n或s。在一些实施例中，x
23
是n。在一些实施例中，x
23
是s。在一些实施例中，x
24
是r或s。在一些实施例中，x
24
是r。在一些实施例中，x
24
是s。在一些实施例中，x
25
是k或r。在一些实施例中，x
25
是k。在一些实施例中，x
25
是r。在一些实施例中，x
26
是a或s。在一些实施例中，x
26
是a。在一些实施例中，x
26
是s。在一些实施例中，x
27
是d或s。在一些实施例中，x
27
是d。在一些实施例中，x
27
是s。在一些实施例中，x
28
是m或v。在一些实施例中，x
28
是m。在一些实施例中，x
28
是v。在一些实施例中，x
29
是f或y。在一些实施例中，x
29
是f。在一些实施例中，x
29
是y。在一些实施例中，x
30
是n或r。在一些实施例中，x
30
是n。在一些实施例中，x
30
是r。在一些实施例中，x
31
是v或y。在一些实施例
中，x
31
是v。在一些实施例中，x
31
是y。
[0326]
在一些实施例中，本文披露的多肽进一步包含v
l
。在一些实施例中，该多肽包含含有seq id no:50的v
l
，其中：
[0327]
x
32
是d或e；
[0328]
x
33
是q或v；
[0329]
x
34
是l或m；
[0330]
x
35
是g或s；
[0331]
x
36
是s或t；
[0332]
x
37
是a或l；
[0333]
x
38
是p或v；
[0334]
x
39
是d或e；
[0335]
x
40
是a或v；
[0336]
x
41
是i或l；
[0337]
x
42
是s或t；
[0338]
x
43
是e或g；
[0339]
x
44
是a、n或s；
[0340]
x
45
是l或y；
[0341]
x
46
是e或g；
[0342]
x
47
是k或q；
[0343]
x
48
是k或r；
[0344]
x
49
是s或t；
[0345]
x
50
是a或q；
[0346]
x
51
是s或t；
[0347]
x
52
是i或v；
[0348]
x
53
是d或s；
[0349]
x
54
是r或s；
[0350]
x
55
是e或q；
[0351]
x
56
是t或v；
[0352]
x
57
是l或q；或者
[0353]
x
58
是l或v，
[0354]
或前述内容的任何组合。
[0355]
以下示出了鉴定为seq id no:50的序列，该序列是本文中的seq id no:47-49的共有v
l
序列：
[0356]
x
32
ix
33
x
34
tqspx
35
x
36
lsx
37
sx
38
gx
39
rx
40
tx
41
x
42
crasqx
43
isgyl x
44
wx
45
qqkpx
46
x
47
apx
48
rliyaasx
49
lx
50
x
51
gx
52
px
53
rfsgsgsgtdftltisx
54
lx
55
pedfax
56
yycx
57
qylsypwtfgqgtkx
58
eik(seq id no:50)。在一些实施例中，x
32
是d或e。在一些实施例中，x
32
是d。在一些实施例中，x
32
是e。在一些实施例中，x
33
是q或v。在一些实施例中，x
33
是q。在一些实施例中，x
33
是v。在一些实施例中，x
34
是l或m。在一些实施例中，x
34
是l。在一些实施例中，x
34
是m。在一些实施例中，x
35
是g或s。在一些实施例中，x
35
是g。在一些实施例中，x
35
是s。在一些实施例中，x
36
是s或
no:47、seq id no:44/seq id no:48或seq id no:45/seq id no:49，不同之处在于从1至3个(例如，1、2或3个)残基的取代。在一些实施例中，该多肽包含与选自以下的v
h/vl
组合的互补位相同的互补位：seq id no:3/seq id no:12。
[0360]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含与seq id no:3具有至少约70％同一性的vh。例如，该vh可以与seq id no:3具有至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，该vh与seq id no:3具有至少约85％或至少约90％同一性。以下示出了鉴定为seq id no:3的序列，该序列对应于鼠vh结构域：
[0361]
evqleesgtvlarpgasvkmsckasgytfttyrmhwikqrpgqglewigaiypgnsdttynqkfkdkakltavtstssaymelssltnedsavyfctregipqllrtldywgqgtsvtvss(seq id no:3)
[0362]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含与以下具有至少约70％同一性的vh：seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45、或前述内容的组合。例如，该vh可以与seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41或seq id no:42、或前述内容的组合具有至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，该vh与以下具有至少约85％或至少约90％同一性：seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45、或前述内容的组合。
[0363]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含与seq id no:12具有至少约70％同一性的v
l
。例如，该v
l
可以与seq id no:12具有至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，该v
l
与seq id no:12具有至少约85％或至少约90％同一性。以下示出了鉴定为seq id no:12的序列，该序列对应于鼠v
l
结构域：
[0364]
dilmtqspsslsaslgervsltcrasqeisgylswlqekpdgtikrliyaastldsgvpkrfsgsrsgsdysltisslesedfadyyclqyvsypwtfgggtkleik(seq id no:12)。
[0365]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含与以下具有至少约70％同一性的v
l
：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49、或前述内容的组合。例如，该v
l
可以与seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49、或前述内容的组合具有至少约71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施例中，该v
l
与以下具有至少约85％同一性：seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15、或前述内容的组合。在一些实施例中，该v
l
与以下具有至少约85％或至少约90％同一性：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49、或前
述内容的组合。
[0366]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含相对于seq id no:3包含至少1个氨基酸取代的vh。例如，氨基酸取代的数量可以是至少约：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，或约：1-20、1-19、2-19、2-18、2-17、3-17、3-16、4-16、4-15、5-15、5-14、6-14、6-13、7-13、7-12、8-12、8-11或9-11个。在一些实施例中，该vh相对于seq id no:3包含约1-10个氨基酸取代。
[0367]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含相对于以下包含至少1个氨基酸取代的vh：seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45、或前述内容的组合。例如，氨基酸取代的数量可以是至少约：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，或约：1-20、1-19、2-19、2-18、2-17、3-17、3-16、4-16、4-15、5-15、5-14、6-14、6-13、7-13、7-12、8-12、8-11或9-11个。在一些实施例中，该vh相对于以下包含约1-10个氨基酸取代：seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45、或前述内容的组合。
[0368]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含相对于seq id no:12包含至少1个氨基酸取代的v
l
。例如，氨基酸取代的数量可以是至少约：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，或约：1-20、1-19、2-19、2-18、2-17、3-17、3-16、4-16、4-15、5-15、5-14、6-14、6-13、7-13、7-12、8-12、8-11或9-11个。在一些实施例中，该v
l
相对于seq id no:12包含约1-10个氨基酸取代。
[0369]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含相对于以下包含至少1个氨基酸取代的v
l
：seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15、或前述内容的组合。例如，氨基酸取代的数量可以是至少约：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个，或约：1-20、1-19、2-19、2-18、2-17、3-17、3-16、4-16、4-15、5-15、5-14、6-14、6-13、7-13、7-12、8-12、8-11或9-11个。在一些实施例中，该v
l
相对于以下包含约1-10个氨基酸取代：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49、或前述内容的组合。
[0370]
在一些实施例中，这些氨基酸取代是保守取代。术语“保守氨基酸取代”或“保守取代”是指在blosum62中具有0或更大的值的氨基酸取代。
[0371]
在一些实施例中，这些氨基酸取代是高度保守取代。术语“高度保守氨基酸取代”或“高度保守取代”是指在blosum62中具有至少1(例如，至少2)的值的氨基酸取代。
[0372]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含含有seq id no:3的vh。在一些实施例中，本文披露的多肽包含含有以下的vh：seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45。
[0373]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含含有seq id no:12的v
l
。在一些实施例中，本文披露的多肽包含含有以下的v
l
：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49。
[0374]
在一些实施例中，本文披露的多肽包含：
web服务器(可在www.ofranlab.org/paratome/处获得，参见vered kunik等人,nucleic acids research[核酸研究],第40卷,第w1期,2012年7月1日,第w521
–
w524页)。
[0396]
如本文所用，“cdr”涵盖由本领域公认的用于鉴定抗体上的cdr残基的方法定义的任何cdr。参见例如kabat,e.a.等人,(1991)sequences of proteins of immunological interest[具有免疫学意义的蛋白质序列],第五版,美国卫生与公众服务部(u.s.department of health and human services),nih公开号91-3242，chothia等人,(1989)nature[自然]342:877；chothia,c.等人,(1987)j.mol.biol.[分子生物学杂志]196:901-917；al-lazikani等人,(1997)j.molec.biol.[分子生物学杂志]273:927-948；以及almagro,j.mol.recognit.[分子识别期刊]17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs。当使用相同的方法确定两种抗体的cdr身份时，确定两种抗体彼此相对于hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和/或lcdr3具有相同的cdr。
[0397]
在一些实施例中，本文披露的多肽是抗原结合片段。术语“抗原结合片段”是指保留亲本全长抗体的抗原结合特性的免疫球蛋白分子(例如，抗体)的一部分。抗原结合片段的非限制性实例包括vh区、v
l
区、fab片段、f(ab’)2片段、fd片段、fv片段、和由一个vh结构域或一个v
l
结构域组成的结构域抗体(dab)等。vh和v
l
结构域可以经由合成接头连接在一起，以形成各种类型的单链抗体设计，其中vh/v
l
结构域在分子内配对或在分子间配对，在这种情况下，vh和v
l
结构域由单独的链表达，以形成单价抗原结合位点，诸如单链fv(scfv)或双链抗体。在一些实施例中，本文披露的多肽是选自fab、f(ab’)2、fab’、scfv、或fv的抗原结合片段。在一些实施例中，该多肽是scfv。
[0398]
在一些实施例中，本文披露的多肽(例如，抗体或抗原结合片段)被并入到基于细胞的疗法中。在一些实施例中，该多肽是工程化的t细胞受体。在一些实施例中，该多肽是嵌合抗原受体(car)(例如，在t(car-t)细胞、自然杀伤(car-nk)细胞、或巨噬细胞(car-m)上表达)。在一些实施例中，该car包含跨膜结构域和抗原识别部分，其中该抗原识别部分结合sars-cov-2(例如，rbd 11)。
[0399]
在一些实施例中，该多肽是抗体模拟物。术语“抗体模拟物”是指能够模拟抗体结合抗原的能力，但在结构上与天然抗体结构不同的多肽。抗体模拟物的非限制性实例包括adnectins、affibodies、affilins、affimers、affitins、alphabodies、anticalins、avimers、darpins、fynomers、kunitz结构域肽、单抗体、纳米抗体、nanoclamp、和versabody。
[0400]
在一些实施例中，本发明的多肽与参考抗体竞争结合野生型sars-cov-1-刺突蛋白、sars-cov-1-刺突蛋白变体、或其组合，其中参考抗体特异性结合野生型sars-cov-1-刺突蛋白。术语“特异性结合(specifically binding)”或“特异性结合(specifically binds)”是指抗体或其抗原结合片段与其表位之间相对于其他抗原或氨基酸序列的优先相互作用，即显著更高的结合亲和力。在一些实施例中，参考抗体包含seq id no:3的vh序列和seq id no:12的v
l
序列。在一些实施例中，参考抗体包含seq id no:17、seq id no:21和seq id no:24的相应hcdr1、hcdr2和hcdr3序列。在一些实施例中，参考抗体包含seq id no:32、seq id no:33和seq id no:35的相应lcdr1、lcdr2和lcdr3序列。在一些实施例中，参考抗体包含seq id no:17、seq id no:21和seq id no:24的相应hcdr1、hcdr2和hcdr3序列；以及seq id no:32、seq id no:33和seq id no:35的相应lcdr1、lcdr2和lcdr3序列。
platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics[高亲和力抗体-抗原结合动力学评价中的生物传感器平台的比较],analytical biochemistry[分析生物化学]508:78-96(2016)，其内容通过援引以其全文并入本文。
[0432]
在一些实施例中，该多肽以约5μm、2μm、1μm、500nm、200nm、100nm、50nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、0.5nm、0.2nm或0.1nm或更小的kd结合sars-cov-2-刺突蛋白。在一些实施例中，该多肽以100nm或更小的kd结合sars-cov-2。
[0433]
在一些实施例中，该多肽以约10-10-10-5
m、10-10-5x 10-6
m、2x 10-10-5x 10-6
m、2x 10-10-2x 10-6
m、5x 10-10-2x 10-6
m、5x 10-10-10-7
m、10-9-10-7
m、10-9-5x 10-8
m、2x 10-9-5x 10-8
m、2x 10-9-2x 10-8
m、5x 10-9-2x 10-8
m或5x 10-9-10-8
m的kd结合sars-cov-2-刺突蛋白。
[0434]
在一些实施例中，该多肽(例如，全长igg1抗体)以约10-6
m或更小的kd结合sars-cov-2-刺突蛋白或其片段(例如，rbd5表位)或其变体，例如约：500nm、200nm、100nm、50nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、0.5nm、0.2nm或0.1nm或更小；或约：10-10-10-6
m、10-10-5x 10-7
m、2x 10-10-5x 10-7
m、2x 10-10-2x10-7
m、5x 10-10-2x 10-7
m、5x 10-10-10-7
m、10-9-10-7
m、10-9-5x 10-8
m、2x 10-9-5x10-8
m、2x 10-9-2x 10-8
m、5x 10-9-2x 10-8
m或5x 10-9-10-8
m。
[0435]
在一些实施例中，该多肽以约10μm或更小的kd结合sars-cov-1-刺突蛋白。在一些实施例中，该kd是约：5μm、2μm、1μm、500nm、200nm、100nm、50nm、20nm、10nm、5nm、2nm、1nm、0.5nm、0.2nm或0.1nm或更小。在一些实施例中，该多肽以约10-10-10-5
m、10-10-5x 10-6
m、2x 10-10-5x 10-6
m、2x 10-10-2x 10-6
m、5x 10-10-2x 10-6
m、5x 10-10-10-7
m、10-9-10-7
m、10-9-5x 10-8
m、2x 10-9-5x 10-8
m、2x 10-9-2x 10-8
m、5x 10-9-2x 10-8
m或5x 10-9-10-8
m的kd结合sars-cov-1-刺突蛋白。
[0436]
在一些实施例中，该多肽(例如，全长igg1抗体)以约106/ms或更小的缔合常数结合sars-cov-2-刺突蛋白或其片段(例如，rbd5表位)或其变体，例如约：5x105/ms、2x 105/ms、105/ms、5x 104/ms、2x 104/ms、104/ms或更小；或约：10
4-106/ms、10
4-5x 105/ms、2x 10
4-5x 105/ms、2x 10
4-2x 105/ms、5x 10
4-2x 105/ms或5x10
4-105/ms。
[0437]
在一些实施例中，该多肽(例如，全长igg1抗体)以约10-2
/s或更小的解离常数结合sars-cov-2-刺突蛋白或其片段(例如，rbd5表位)或其变体，例如约：8x10-3
/s、6x 10-3
/s、4x 10-3
/s、2x 10-3
/s、10-3
/s、8x 10-4
/s、6x 10-4
/s、4x 10-4
/s、2x 10-4
/s、10-4
/s、8x 10-5
/s、6x 10-5
/s、4x 10-5
/s、2x 10-5
/s、10-5
/s、8x 10-6
/s、6x 10-6
/s、4x 10-6
/s、2x 10-6
/s或10-6
/s或更小；或约：10-6-10-2
/s、2x 10-6-10-2
/s、2x 10-6-5x 10-3
/s、5x 10-6-5x 10-3
/s、5x 10-6-2x 10-3
/s、10-5-2x 10-3
/s、10-5-10-3
/s、2x 10-5-10-3
/s、2x 10-5-5x 10-4
/s、5x 10-5-5x 10-4
/s、5x 10-5-2x 10-4
/s或10-4-2x 10-4
/s。
[0438]
在一些实施例中，该多肽(例如，全长igg1抗体)以约0.05或更大的r
max
结合sars-cov-2-刺突蛋白或其片段(例如，rbd5表位)或其变体，例如约：0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75或0.8或更大；或约：0.1-0.8、0.15-0.8、0.15-0.75、0.2-0.75、0.2-0.7、0.25-0.7、0.25-0.65、0.3-0.65、0.3-0.6、0.35-0.6、0.35-0.55、0.4-0.55或0.4-0.5。
[0439]
在一些实施例中，该多肽减少sars-cov-2-刺突蛋白与进入受体(例如，ace2)的结合。
[0440]
在一些实施例中，该进入受体是ace2。在一些实施例中，该ace2是哺乳动物ace2。
在一些实施例中，该ace2是灵长类动物ace2。在一些实施例中，该灵长类动物ace2是人ace2(geneid 59272；示例性蛋白质序列np_001358344.1)。在一些实施例中，该灵长类动物ace2是选自下组的非人灵长类动物ace2，该组由以下组成：黑猩猩ace2(例如，a0a2j8ku96、xp_016798468.1、xp_016798469.1、pni38578.1)、猕猴ace2(例如，b6duf2、np_001129168.1、xp_024647450.1)、食蟹猴ace2(例如，a0a2k5x283、xp_005593094.1)及其组合。
[0441]
在一些实施例中，该多肽使sars-cov-2-刺突蛋白与其细胞靶受体(例如，ace2)的结合减少至少约10％。例如，减少至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，该多肽使sars-cov-2-刺突蛋白与ace2的结合减少至少约30％。
[0442]
在一些实施例中，sars-cov-2-刺突蛋白与其细胞靶受体(例如，ace2)在该多肽存在下的结合水平相对于在该多肽不存在下的结合水平是小于约90％，例如小于约：85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
[0443]
在一些实施例中，sars-cov-2-刺突蛋白与其细胞靶受体(例如，ace2)在该多肽存在下的结合水平相对于在该多肽不存在下的结合水平是约1％-90％，例如相对于在该多肽不存在下的结合水平是约：2％-90％、2％-85％、3％-85％、3％-80％、4％-80％、4％-75％、5％-75％、5％-70％、6％-70％、6％-65％、7％-65％、7％-60％、8％-60％、8％-55％、9％-55％、9％-50％、10％-50％、10％-45％、15％-45％、15％-40％、20％-40％、20％-35％、25％-35％或25％-30％。
[0444]
在一些实施例中，该多肽使sars-cov-1-刺突蛋白与其细胞靶受体的结合减少至少约10％。例如，减少至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0445]
在一些实施例中，该多肽(例如，全长igg1抗体)以约25,000ng/ml或更小的ic
50
中和人宿主细胞的sars-cov-2感染性，例如约：20,000ng/ml、15,000ng/ml、10,000ng/ml、5,000ng/ml、2,500ng/ml、1,000ng/ml、750ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml或10ng/ml或更小；例如约：10-25,000ng/ml、10-20,000ng/ml、25-20,000ng/ml、25-15,000ng/ml、50-15,000ng/ml、50-10,000ng/ml、75-10,000ng/ml、75-5,000ng/ml、100-5,000ng/ml、100-2,500ng/ml、250-2,500ng/ml、250-1,000ng/ml、500-1,000ng/ml或500-750ng/ml。
[0446]
在一些实施例中，该多肽(例如，全长igg1抗体)以约50,000ng/ml或更小的ic
80
中和人宿主细胞的sars-cov-2感染性，例如约：25,000ng/ml、15,000ng/ml、10,000ng/ml、5,000ng/ml、2,500ng/ml、1,000ng/ml、750ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml或10ng/ml或更小；例如约：10-50,000ng/ml、10-25,000ng/ml、25-25,000ng/ml、25-15,000ng/ml、50-15,000ng/ml、50-10,000ng/ml、75-10,000ng/ml、75-5,000ng/ml、100-5,000ng/ml、100-2,500ng/ml、250-2,500ng/ml、250-1,000ng/ml、500-1,000ng/ml或500-750ng/ml。
[0447]
在一些实施例中，该多肽减少sars-cov-2与宿主蛋白酶(例如，ii型跨膜丝氨酸蛋白酶(tmprss2))的结合。在不受理论约束的情况下，介导原代靶细胞上sars-cov-2-刺突蛋
白活化和初始病毒进入的主要宿主蛋白酶是tmprss2。
[0448]
在一些实施例中，该宿主蛋白酶是tmprss2。在一些实施例中，该tmprss2是哺乳动物tmprss2。在一些实施例中，该tmprss2是灵长类动物tmprss2(例如，人tmprss2)或非人灵长类动物tmprss2(例如，黑猩猩tmprss2、猕猴tmprss2或食蟹猴tmprss2)。
[0449]
在一些实施例中，该多肽使sars-cov-2与宿主蛋白酶(例如，tmprss2)的结合减少至少约10％，例如至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0450]
在一些实施例中，sars-cov-2与宿主蛋白酶(例如，tmprss2)在该多肽存在下的结合水平相对于在该多肽不存在下的结合水平是小于约90％，例如小于约：85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
[0451]
在一些实施例中，sars-cov-2与宿主蛋白酶(例如，tmprss2)在该多肽存在下的结合水平相对于在该多肽不存在下的结合水平是约1％-90％，例如约：2％-90％、2％-85％、3％-85％、3％-80％、4％-80％、4％-75％、5％-75％、5％-70％、6％-70％、6％-65％、7％-65％、7％-60％、8％-60％、8％-55％、9％-55％、9％-50％、10％-50％、10％-45％、15％-45％、15％-40％、20％-40％、20％-35％、25％-35％或25％-30％。
[0452]
在一些实施例中，该多肽减少sars-cov-2进入宿主细胞(例如，人宿主细胞)中。在一些实施例中，该多肽使sars-cov-2进入宿主细胞中减少至少约10％，例如至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0453]
在一些实施例中，该多肽降低宿主细胞(例如，人宿主细胞)中sars-cov-2的感染性。在一些实施例中，该多肽使宿主细胞(例如，人宿主细胞)中sars-cov-2的感染性降低至少约10％，例如至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，该多肽使人细胞中sars-cov-2的感染性降低至少约30％。
[0454]
在一些实施例中，该多肽减少宿主细胞(例如，人宿主细胞)中sars-cov-2的再感染。在一些实施例中，该多肽使宿主细胞(例如，人宿主细胞)中sars-cov-2的再感染减少至少约10％，例如至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，该多肽使人细胞中sars-cov-2的再感染减少至少约30％。
[0455]
感染性或再感染可以使用诸如假病毒中和测定或活病毒中和测定等技术进行测量(参见例如pinto等人,cross-neutralization of sars-cov-2by a human monoclonal sars-cov antibody[人单克隆sars-cov抗体进行的sars-cov-2的交叉中和],nature[自然]583:290-95(2020)，其内容通过援引并入本文)。试剂盒，例如genscript cpass
tm sars-cov-2中和抗体检测试剂盒，可以根据制造商的方案使用。
[0456]
在一些实施例中，宿主细胞选自由肺ii型肺细胞、回肠吸收性肠上皮细胞、鼻杯状分泌细胞、及其组合组成的组。
[0457]
融合蛋白
[0458]
在另一方面，本发明提供了一种包含本文所述的一种或多种多肽的融合蛋白。
[0459]
术语“融合蛋白”是指合成的、半合成的或重组的单一蛋白分子。融合蛋白可以包含通过共价键(例如，肽键)附接的两种或更多种不同蛋白质和/或多肽的全部或一部分。
[0460]
本发明的融合蛋白可以使用本领域熟知的常规方法和试剂重组或合成产生。例如，本发明的融合蛋白可以根据本领域已知的方法在合适的宿主细胞(例如，细菌)中重组产生。参见例如current protocols in molecular biology[最新分子生物学实验方法汇编],第二版,ausubel等人编,约翰
·
威利父子出版公司,1992；以及molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],第2版,sambrook等人,1989,冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)。例如，包含编码本文所述的融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子可以在合适的宿主细胞(例如，大肠杆菌)中引入和表达，并且可以使用常规方法和现成的试剂从宿主细胞(例如，在包涵体中)分离/纯化表达的融合蛋白。例如，编码不同蛋白质序列(例如，光响应型结构域、异源肽组分)的dna片段可以根据常规技术在框内连接在一起。在另一个实施例中，融合基因可以通过包括自动化dna合成器的常规技术合成。可替代地，可以使用锚定引物进行核酸片段的pcr扩增，这些锚定引物在两个连续核酸片段之间产生互补突出，这些核酸片段随后可以退火并重新扩增以生成嵌合核酸序列(参见ausubel等人,current protocols in molecular biology[最新分子生物学实验方法汇编],1992)。
[0461]
核酸、表达载体、表达宿主细胞
[0462]
在另一方面，本发明提供了一种或多种编码本文所述的任一种多肽或融合蛋白的多核苷酸。在一些实施例中，本发明的多肽或融合蛋白由单个多核苷酸编码。在一些实施例中，本发明的多肽或融合蛋白由多个多核苷酸编码。
[0463]
在一些实施例中，该多核苷酸包含针对所选宿主细胞进行密码子优化的核苷酸序列。
[0464]
在另一方面，本发明提供了一种包含本文所述的任一种或多种多核苷酸的表达载体。
[0465]
术语“表达载体”是指当表达载体转化到合适的表达宿主细胞中时可以从中表达一种或多种蛋白质的可复制核酸。
[0466]
在一些实施例中，表达载体进一步包含可操作地连接到多核苷酸的表达控制序列、编码可选标记物的多核苷酸序列、或两者。在一些实施例中，该表达控制多核苷酸序列包含启动子序列、增强子序列、或两者。在一些实施例中，该表达控制多核苷酸序列包含诱导型启动子序列。术语“启动子”是指rna聚合酶与其结合并启动基因转录的dna区域。术语“可操作地连接”意指核酸以一种方式位于重组多核苷酸(例如，载体)中，使得核酸能够在其所连接的元件(例如，启动子)的控制下表达。术语“可选标记物元件”是赋予适合人工选择的性状的元件。可选标记物元件可以是阴性或阳性选择标记物。
[0467]
在另一方面，本发明提供了一种包含本文所述的任一种或多种多核苷酸或表达载体的表达宿主细胞。
[0468]
术语“表达宿主细胞”是指可用于接收、维持、复制和/或扩增载体的细胞。
[0469]
表达宿主细胞的非限制性实例包括哺乳动物细胞诸如杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、cos细胞、人胚胎肾(hek)细胞、酵母细胞诸如毕赤酵母(pichia pastoris)细胞、或细菌细胞诸如dh5α等。
[0470]
组合物
[0471]
在另一方面，本发明提供了一种包含本文所述的任一种多肽或融合蛋白的组合物。在一些实施例中，该组合物是药物组合物。
[0472]
在一些实施例中，该组合物(例如，药物组合物)进一步包含药学上可接受的载剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂或补品(remington's pharmaceutical sciences[雷明顿的医药科学]第16版,osol,a.编(1980))。合适的药学上可接受的载剂、赋形剂、或稳定剂在采用的剂量和浓度下对受体无毒。药学上可接受的载剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂或补品的非限制性实例包括缓冲液(例如，磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸或蛋氨酸)、防腐剂、蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物、氨基酸、碳水化合物(例如，单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂(例如，edta)、糖(例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇)、形成盐的反离子(例如，钠)、金属络合物(例如，zn-蛋白络合物)；非离子型表面活性剂(例如，tween)、pluronics
tm
和聚乙二醇(peg)。
[0473]
在一些实施例中，本发明的组合物(例如，药物组合物)被配制用于合适的施用时间表和途径。施用途径的非限制性实例包括口服、直肠、粘膜、静脉内、肌肉内、皮下和局部等。在一些实施例中，本发明的组合物(例如，药物组合物)以水溶液或干燥配制品(例如，冻干)的形式储存。
[0474]
在一些实施例中，该组合物被配制成通过输注(例如，静脉内输注)施用。
[0475]
在一些实施例中，该组合物被配制成与第二治疗剂一起作为组合疗法施用。
[0476]
使用方法
[0477]
在另一方面，本发明提供了一种降低受试者的sars-cov-2感染的可能性的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载剂和作为活性成分的本文所述的任一种多肽或融合蛋白。
[0478]
在一些实施例中，受试者的sars-cov-2感染的可能性降低至少约10％，例如至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0479]
在一些实施例中，在该多肽存在下受试者的sars-cov-2感染的可能性相对于在该多肽不存在下的可能性是约1％-90％，例如约：2％-90％、2％-85％、3％-85％、3％-80％、4％-80％、4％-75％、5％-75％、5％-70％、6％-70％、6％-65％、7％-65％、7％-60％、8％-60％、8％-55％、9％-55％、9％-50％、10％-50％、10％-45％、15％-45％、15％-40％、20％-40％、20％-35％、25％-35％或25％-30％。
[0480]
术语“受试者”或“患者”是指动物(例如，哺乳动物)。根据本文所述的方法进行治疗的受试者可以是已被诊断患有特定病症(例如，covid-19)的人或具有发展此类病症的风险的人。诊断可以通过本领域已知的任何方法或技术进行。本领域技术人员将理解，有待根据本披露治疗的受试者可能已经进行了标准测试，或者可能无需检查已经被鉴定为由于存在与疾病或病症相关联的一个或多个风险因素而具有风险的受试者。
[0481]
在一些实施例中，该受试者患有covid-19。在一些实施例中，受试者已经被诊断为患有covid-19。在其他实施例中，该受试者具有发展covid-19的风险。
[0482]
在一些实施例中，该受试者是哺乳动物。在一些实施例中，该受试者是选自下组的哺乳动物，该组由以下组成：狗、猫、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、马、猪、羊、牛、黑猩猩、猕猴、食
蟹猴、和人类。在一些实施例中，该受试者是灵长类动物。在一些实施例中，该受试者是人。
[0483]
在一些实施例中，该受试者患有心脏病。在一些实施例中，该受试者患有选自下组的心脏病，该组由以下组成：先天性心脏病、冠状动脉疾病、高血压心脏病、炎症性心脏病、肺源性心脏病、风湿性心脏病、瓣膜性心脏病、心肌病、心力衰竭、及其组合。在一些实施例中，该受试者患有充血性心力衰竭。在一些实施例中，该受试者患有选自下组的炎症性心脏病，该组由以下组成：心内膜炎、心脏增大、心肌炎、及其组合。
[0484]
在一些实施例中，该受试者患有糖尿病。
[0485]
在一些实施例中，该受试者患有肺病。肺病的非限制性实例包括急性呼吸窘迫综合征、哮喘、支气管炎、copd、肺气肿、肺肿瘤、胸膜腔疾病(例如，胸膜间皮瘤或张力性气胸)、肺血管疾病(例如，栓塞、水肿、动脉高血压或出血)、呼吸道感染(例如，肺炎或其他上呼吸道或下呼吸道感染)。
[0486]
在一些实施例中，该受试者是吸烟者。
[0487]
在一些实施例中，该受试者是免疫受损的(例如，具有潜在的障碍或正在接受免疫抑制疗法)。
[0488]
在一些实施例中，该受试者的年龄是40岁或更大，例如至少：45、50、55、60、65、70、75、80、85、90岁。
[0489]“治疗有效量”、“有效量”或“有效剂量”是在剂量和必需的时间段内有效实现所需治疗结果(例如，治疗、愈合、抑制或改善生理应答或病症等)的量。完全治疗作用不一定通过施用一个剂量而发生，并且可能仅在施用一系列剂量之后发生。因此，治疗有效量可以在一次或多次施用中施用。治疗有效量可以根据诸如哺乳动物的疾病状态、年龄、性别和体重、施用模式以及治疗剂或治疗剂的组合在个体中引发所需应答的能力等的因素而变化。
[0490]
有待施用的药剂的有效量可以由本领域普通技术人员使用本文提供的指导和本领域已知的其他方法确定。相关因素包括给定的药剂、药物配制品、施用途径、疾病或障碍的类型、受试者的身份(例如，年龄、性别、体重)或被治疗的宿主等。例如，合适剂量可以是从约0.001mg/kg至约100mg/kg、从约0.01mg/kg至约100mg/kg、从约0.01mg/kg至约10mg/kg、从约0.01mg/kg至约1mg/kg体重/治疗。确定特定药剂、受试者和疾病的剂量完全在本领域技术人员的能力范围内。优选地，该剂量不引起或产生最小的不良副作用。
[0491]
所需应答或所需结果包括细胞水平、组织水平或临床结果的影响。由此，“治疗有效量”或其同义词取决于其应用的背景。例如，在一些实施例中，它是与不施用组合物而获得的应答相比，足以实现治疗应答的组合物的量。在其他实施例中，它是与对照相比在受试者中产生有益或所需结果的量。如本文所定义，本披露的组合物的治疗有效量可以由普通技术人员通过本领域已知的常规方法容易地确定。剂量方案和施用途径可以调整以提供最佳的治疗应答。
[0492]
在一些实施例中，该方法用于预防性疗法。在一些实施例中，该有效剂量足以防止受试者感染sars-cov-2。
[0493]
在一些实施例中，该方法用于治疗sars-cov-2感染。术语“治疗(treating或treatment)”是指对受试者进行的旨在提高、改善、稳定(即，不恶化)、预防或治愈疾病、病理状况或障碍(诸如本文例示的特定适应症)的医疗管理。该术语包括活性治疗(旨在改善疾病、病理状况或障碍的治疗)、病因治疗(针对相关联的疾病、病理状况或障碍的原因的治
疗)、姑息治疗(旨在缓解症状的治疗)、预防性治疗(旨在最大程度减少或部分或完全抑制相关联的疾病、病理状况或障碍发展的治疗)；以及支持治疗(用于补充另一疗法的治疗)。治疗还包括削减疾病或病症的程度；预防疾病或病症的传播；延迟或减缓疾病或病症的进展；改善或减轻疾病或病症；以及缓解(不管是部分缓解还是完全缓解)，不管是可检测的还是不可检测的。“改善”或“减轻”疾病或病症意指与治疗不存在的程度或时间进程相比，该疾病、障碍、或病症的程度和/或不希望的临床表现减少和/或进展的时间进程被减缓或加长。“治疗”还可以意指与如果不接受治疗的预期存活期相比，延长的存活期。需要治疗的那些包括已经患有病症或障碍的那些，以及易于患有病症或障碍的那些，或其中要预防病症或障碍的那些。
[0494]
在一些实施例中，有效剂量足以减少受试者的病毒载量。在一些实施例中，病毒载量的减少是至少约10％，例如至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，病毒载量的减少是约10％-99％，例如约：10％-98％、15％-98％、15％-97％、20％-97％、20％-96％、25％-96％、25％-95％、30％-95％、30％-94％、35％-94％、35％-93％、40％-93％、40％-92％、45％-92％、45％-91％、50％-91％、50％-90％、55％-90％、55％-85％、60％-85％、60％-80％、65％-80％、65％-75％、或70％-75％。
[0495]
在一些实施例中，该有效剂量足以抑制病毒与其靶蛋白、靶细胞、或两者的结合。在一些实施例中，结合的减少是至少约10％，例如至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，结合的减少是约10％-99％，例如约：10％-98％、15％-98％、15％-97％、20％-97％、20％-96％、25％-96％、25％-95％、30％-95％、30％-94％、35％-94％、35％-93％、40％-93％、40％-92％、45％-92％、45％-91％、50％-91％、50％-90％、55％-90％、55％-85％、60％-85％、60％-80％、65％-80％、65％-75％、或70％-75％。
[0496]
在一些实施例中，该有效剂量足以抑制病毒介导的与靶细胞的融合。在一些实施例中，融合的减少是至少约10％，例如至少约：15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，融合的减少是约10％-99％，例如约：10％-98％、15％-98％、15％-97％、20％-97％、20％-96％、25％-96％、25％-95％、30％-95％、30％-94％、35％-94％、35％-93％、40％-93％、40％-92％、45％-92％、45％-91％、50％-91％、50％-90％、55％-90％、55％-85％、60％-85％、60％-80％、65％-80％、65％-75％、或70％-75％。
[0497]
在一些实施例中，有效剂量足以干扰细胞感染性所必需的病毒包膜蛋白的构象变化。
[0498]
本文所述的治疗剂可以经由多种施用途径施用，包括例如口服、饮食、局部、经皮、直肠、肠胃外(例如，动脉内、静脉内、肌肉内、皮下注射、皮内注射)、静脉内输注和吸入(例如，支气管内、鼻内或口服吸入、鼻内滴剂)施用途径，这取决于化合物和有待治疗的特定疾病。根据指示，施用可以是局部的或全身的。优选的施用方式可以根据所选择的特定化合物而变化。
[0499]
在一些实施例中，本文披露的多肽、组合物、或药物组合物与一种或多种额外的治
疗剂组合(例如，与一种或多种额外的治疗剂同时或顺序)施用于受试者。在一些实施例中，受试者在施用本文披露的多肽、组合物、或药物组合物之前已经用一种或多种治疗剂进行治疗。在一些实施例中，该方法进一步包括在施用本文披露的多肽、组合物、或药物组合物的同时或之后向受试者施用治疗有效量的一种或多种额外的治疗剂。
[0500]
额外的治疗剂的非限制性实例包括抗生素(例如，阿奇霉素)、抗体或其抗原结合片段(例如，其他sars-cov-2-刺突蛋白结合肽)、抗疟疾剂(例如，氯喹或羟氯喹)、抗病毒剂(例如，法匹拉韦、洛匹那韦和/或利托那韦)、细胞因子(例如，1型干扰素，诸如干扰素β-1a)、核苷酸类似物(例如，瑞德西韦)、蛋白酶抑制剂(例如，达诺瑞韦(danoprevir))、肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂(例如，ace2抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂(arb))。
[0501]
在一些实施例中，抗病毒剂选自下组，该组由以下组成：金刚烷胺、法匹拉韦、洛匹那韦、奥司他韦(达菲)、普康那利(pleconaril)、金刚乙胺、利托那韦、sars-cov-2的反义rna、sars-cov-2的sirna、额外的抗sars-cov-2单克隆抗体、及其组合。
[0502]
在一些实施例中，额外的抗sars-cov-2单克隆抗体靶向sars-cov-2的s蛋白的rbd。在一些实施例中，额外的抗sars-cov-2单克隆抗体是中和单克隆抗体。抗sars-cov-2单克隆抗体的非限制性实例包括巴尼韦单抗(bamlanivimab，ly-cov555或ly3819253)、埃特司韦单抗(etesevimab，ly-cov016或ly3832479)、卡斯瑞韦单抗(casirivimab，regn10933)、和依米得韦单抗(imdevimab，regn10987)。参见例如www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/therapies/anti-sars-cov-2-antibody-products/anti-sars-cov-2-monoclonal-antibodies。
[0503]
在一些实施例中，ace2抑制剂选自下组，该组由以下组成：ace2的rnai、ace2的sirna、基于crispr的ace2抑制剂、可溶性ace2、可溶性ace2变体、抗ace2抗体、疫苗及其组合。在一些实施例中，该抗生素是阿奇霉素。在一些实施例中，该抗疟疾剂包括氯喹或羟氯喹。在一些实施例中，该疫苗是核酸疫苗或灭活病毒疫苗。在一些实施例中，该疫苗是mrna-1273、bnt162、ino-4800、azd1222、ad5-ncov、picovacc、nvx-cov2373、或其组合。
[0504]
施用两种或更多种治疗剂涵盖以基本上同时的方式，诸如以药物组合的方式共同施用治疗剂。可替代地，这种施用涵盖在多个容器或单独容器(例如，胶囊、粉末、和液体)中共同施用每种治疗剂。这种施用还涵盖在大约相同时间或不同时间以顺序方式使用每种类型的治疗剂。本文所述的组合物和第二治疗剂可以经由相同的施用途径或经由不同的施用途径施用。
[0505]
在另一方面，本发明提供了一种预防受试者的sars-cov-2感染的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载剂和作为活性成分的本文所述的任一种多肽或融合蛋白。
[0506]
在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者的sars-cov-2感染的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载剂和作为活性成分的本文所述的任一种多肽或融合蛋白。
[0507]
在另一方面，本发明提供了一种减少受试者的sars-cov-2的病毒载量的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载剂和作为活性成分的本文所述的任一种多肽或融合蛋白。
[0508]
在另一方面，本发明提供了一种抑制sars-cov-2与靶细胞结合的方法，该方法包
括使该靶细胞与有效量的本文所述的任一种多肽或融合蛋白接触。
[0509]
在另一方面，本发明提供了一种抑制sars-cov-2与靶细胞上的靶蛋白结合的方法，该方法包括使该靶细胞与有效量的本文所述的任一种多肽或融合蛋白接触。
[0510]
在另一方面，本发明提供了一种抑制病毒介导的与靶细胞融合的方法，该方法包括使该靶细胞与有效量的本文所述的任一种多肽或融合蛋白接触。
[0511]
除非另外定义，否则本文所用的所有本领域技术、符号和其他科学术语或专门用语均旨在具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文中定义了具有通常所理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定被解释为表示与本领域中通常理解的内容的实质性差异。还将理解，诸如常用字典中定义的那些的术语应被解释为具有与其在相关领域的含义一致和/或如本文另外定义的含义。
[0512]
本文所用的专门用语仅出于描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。
[0513]
除非上下文另外明确指示，否则如本文所用，不定冠词“一个/一种(a/an)”和“该(the)”应理解为包括复数引用。
[0514]
贯穿本说明书及其后的权利要求书，除非上下文另外要求，否则词语“包含(包括)(comprise)”以及变型诸如“包含(包括)(comprises)”或“包含(包括)(comprising)”将被理解为是指包含例如一个提及的整体或步骤或者多个整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者多个整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含(包括)(comprising)”可以被术语“含有(containing)”或“包括(including)”代替。
[0515]
如本文所用，“由
…
组成(consisting of)”不包括权利要求元素中未指定的任何元件、步骤、或成分。当在本文中使用时，“基本上由
…
组成(consisting essentially of)”并不排除对权利要求的基本特征和新颖特征没有实质影响的材料或步骤。术语“包含(包括)(comprising)”、“含有(containing)”、“包括(including)”、和“具有”中的任一个，无论何时在本文中用于本发明的某个方面或实施例的上下文中，都可以在一些实施例中替换为术语“由
…
组成”或“基本上由
…
组成”来改变本披露的范围。
[0516]
如本文所用，多个所列举元素之间的结合术语“和/或”被理解为涵盖单个和组合选项两者。例如，当两个元素由“和/或”连接时，第一选项是指没有第二元素的第一元素的适用性。第二选项是指没有第一元素的第二元素的适用性。第三选项是指第一元素和第二元素一起的适用性。这些选项中的任一个都被理解为落在该含义内，并且因此满足本文所用的术语“和/或”的要求。多于一个选项的同时适用性也被理解为落在该含义内，并且因此满足本文所用的术语“和/或”的要求。
[0517]
在呈现列表时，除非另外说明，否则应理解，此清单的每个个体元素以及此清单的每一个组合都是一个单独的实施例。例如，呈现为“a、b、或c”的实施例列表应被解释为包括实施例“a”、“b”、“c”、“a或b”、“a或c”、“b或c”、或“a、b、或c”。
[0518]
例示
[0519]
实例1.抗原结合分子与sars-cov-2-刺突蛋白的s1亚基受体结合结构域(rbd)之间的直接结合
[0520]
对感兴趣的分子进行重组表达、纯化、和定量。用1μg/ml在pbs中的商业sars-cov-2 rbd对elisa板涂覆过夜。然后在自动板洗涤器上用200μl的pbs-t将板洗涤3x，并且然后
在37℃下用在pbs中的5％ bsa封闭1小时以阻断非特异性结合。然后在自动板洗涤器上用200μl的pbs-t将板洗涤3x，并且将感兴趣的分子在elisa板中以稀释系列滴定并在37℃下温育1小时。然后在自动板洗涤器上用200μl的pbs-t将板洗涤3x，并且将对靶分子具有特异性的二级抗体(与hrp缀合)以固定稀释度添加到板中。将板在37℃下温育1小时。然后在自动板洗涤器上用200μl的pbs-t将板洗涤3x，并且通过将tmb底物添加到感兴趣的孔中来探测结合。在5-10分钟之后，用酸性终止溶液使反应停止，并且通过在读板器上测量450nm处的吸光度来对信号进行定量。阳性信号对应于阴性对照(典型地是抗体同位素对照)的背景吸光度读数。通过评估在靶分子的较大稀释度下的结合强度，可以推断出对结合的半定量理解。理论上，与较弱的结合剂相比，对sars-cov-2 rbd具有较大亲和力的候选分子应在较大的稀释度下显示较大的信号。
[0521]
实例2.抗原结合分子与人ace2(hace2)竞争体外与rbd结合。
[0522]
对感兴趣的分子进行重组表达、纯化、和定量。用1μg/ml在pbs中的商业sars-cov-2 rbd对elisa板涂覆过夜。然后在自动板洗涤器上用200μl的pbs-t将板洗涤3x，并且然后在37℃下用在pbs中的5％ bsa封闭1小时以阻断非特异性结合。然后在自动板洗涤器上用200μl的pbs-t将板洗涤3x，并且将感兴趣的分子在elisa板中以稀释系列滴定。同时，将固定浓度的商业hace2(生物素化)与候选分子共温育。固定浓度的hace2对应于在此测定形式中根据经验确定与sars-cov-2 rbd的最大结合的50％的浓度。将板在37℃下温育1小时。然后在自动板洗涤器上用200μl的pbs-t将板洗涤3x，并且将对生物素化的hace2具有特异性的二级抗体(与hrp缀合的链霉亲和素)以固定稀释度添加到板中。将板在37℃下温育1小时。然后在自动板洗涤器上用200μl的pbs-t将板洗涤3x，并且通过将tmb底物添加到感兴趣的孔中来探测结合。在5-10分钟之后，用酸性终止溶液使反应停止，并且通过在读板器上测量450nm处的吸光度来对信号进行定量。阳性信号对应于与没有高于阴性对照(典型地是抗体同位素对照)的背景的候选分子的孔相比，具有候选分子的孔的吸光度降低。通过评估在靶分子的较大稀释度下的hace2结合的总体降低，可以推断出对靶分子与hace2竞争的能力的半定量理解。理论上，与具有较弱能力的分子相比，具有与hace2竞争sars-cov-2 rbd的较大能力的候选分子应在较大的稀释度下显示较大的信号。
[0523]
实例3.抗原结合分子与hace2竞争与细胞表面上的rbd结合。
[0524]
对感兴趣的分子进行重组表达、纯化、和定量。培养以野生型水平表达hace2的细胞系，收获而不进行胰蛋白酶消化(以防止表面蛋白破坏)，并进行计数。将固定数量的细胞添加到96孔板中，并与以稀释系列滴定的感兴趣的分子一起温育。同时，将固定浓度的商业sars-cov-2(生物素化)与候选分子共温育。固定浓度的sars-cov-2对应于在此测定形式中根据经验确定与细胞上的hace2的最大结合的50％的浓度。将细胞的板在4℃下在黑暗中温育1小时。将板在400xg下离心5分钟，抽吸上清液，并且将细胞用在pbs中的0.2％ bsa洗涤。将此过程再重复2次，总计洗涤3次。将对生物素化的sars-cov-2具有特异性的二级抗体(与alexa fluor 488缀合的链霉亲和素)以固定稀释度添加到板中。将细胞的板在4℃下在黑暗中温育1小时。将板在400xg下离心5分钟，抽吸上清液，并且将细胞用在pbs中的0.2％ bsa洗涤。然后将细胞重悬浮在固定体积的在pbs中的0.2％ bsa中并进行流式细胞术。通过fit-c通道的中位荧光强度(mfi)分析sars-cov-2 rbd的总结合。阳性信号对应于与没有高于阴性对照(典型地是抗体同位素对照)的背景的候选分子的孔相比，具有候选分子的孔的
mfi降低。通过评估在靶分子的较大稀释度下的sars-cov-2rbd mfi的总体降低，可以推断出对与sars-cov-2 rbd竞争的能力的半定量理解。理论上，与具有较弱能力的分子相比，具有与sars-cov-2 rbd竞争hace2的较大能力(其也可以被认为是对于sars-cov-2 rbd的亲和力)的候选分子应在较大的稀释度下显示较大的信号。
[0525]
实例4.抗体设计的酵母展示表征
[0526]
将抗体格式化为单链可变片段(scfv)，并使用酵母展示测试结合。将与c-myc表位标签融合的scfv构建体合成为dna片段(twist biosciences公司)，具有用于克隆到酵母展示载体中的突出。将dna插入片段和消化载体转化到酵母中，并且通过同源重组在体内生成完整质粒。诱导细胞进行scfv表达并在酵母细胞表面上展示。针对与生物素化的sars-cov-2受体结合结构域(rbd)抗原(百普赛斯集团(acro biosystems))或sars-cov rbd(金斯瑞生物科技公司(genscript))和抗c-myc(exalpha公司)的结合对诱导细胞进行染色，以用于scfv表达。对于显示结合的克隆，通过对不同浓度的sars-cov-2rbd或sars-cov抗原进行滴定曲线来评价平衡解离常数(kd)。所有结合sar-cov-2rbd的克隆也表现出与sars-cov rbd的交叉反应性结合。结合特异性和kd值在表2中总结。
[0527]
实例5.全长igg的产生
[0528]
通过使用常规方法将可变重(vh)链和可变轻(vl)链亚克隆到含有对应恒定域的哺乳动物表达载体中，将scfv构建体重新格式化为全长人免疫球蛋白1(igg1)。通过每条链使用一个表达质粒生成抗体，该质粒含有用于驱动表达的cmv启动子和用于促进完全折叠的igg分泌到上清液中的信号肽。使用基于阳离子脂质的瞬时转染方法和补料分批生产程序，采用哺乳动物表达宿主系统(诸如中国仓鼠卵巢-cho s细胞系)进行蛋白质表达。使用基于亲和捕获的纯化方法纯化表达的可溶性全长igg，该方法使用蛋白a亲和树脂(诸如mabselect sure树脂，通用电气医疗公司(ge healthcare))和水性缓冲液进行纯化。在低ph(诸如ph 3.5)的酸性条件下进行洗脱，并且然后使用2m tris碱中和至ph 7.5。将纯化的抗体进一步在水性缓冲液(诸如含有nacl的基于组氨酸的缓冲液)中稳定，以用于长期储存/冷冻。
[0529]
实例6.全长igg的结合动力学和亲和力
[0530]
使用fortebio octet red96e仪器通过生物层干涉技术(bli)测量结合动力学和亲和力。将抗体捕获到抗人fc(ahc)生物传感器上。然后将生物传感器与sars-cov-2rbd(百普赛斯集团)的系列稀释液一起温育以进行缔合和解离。代表性数据在表3中示出。
[0531]
实例7.材料和方法
[0532]
全长igg的表达
[0533]
使用金门组装(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州(new england biolabs,ipswich,ma))合成(twist公司)编码设计抗体的vh和vl序列的反向翻译dna，并将其克隆到含有cmv启动子序列、信号肽和对应恒定区的人g1+k conta同种型载体中。遵循制造商的方法(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州(thermo fisher scientific,inc.,waltham,ma))在expicho细胞中表达igg蛋白，并根据制造商的方法使用mabselect sure蛋白a亲和树脂(思拓凡公司，马尔伯勒，马萨诸塞州(cytiva,marlborough,ma))通过亲和色谱法纯化。在蛋白a亲和纯化后，遵循制造商推荐的方法，使用superdex200树脂(思拓凡公司，马尔伯勒，马萨诸塞州)通过尺寸排阻色谱法进一步纯化抗体。
[0534]
中和测定
[0535]
将预先滴定量的rvsv-sars-cov-2与系列稀释的单克隆抗体在37℃下温育1小时，之后在96孔板中添加到汇合的vero(atcc ccl-81)单层中。感染在37℃下在5％ co2中进行16-18小时，之后将细胞固定在4％多聚甲醛中并用10μg/ml hoechst染色。使用cellinsight cx5成像仪对细胞进行成像，并且通过自动计数总细胞和表达绿色荧光蛋白(gfp)的那些细胞来定量感染。将感染归一化至感染与人igg同种型对照一起温育的rvsv-sars-cov-2的平均细胞数。
[0536]
wt和突变体sars-cov-2刺突蛋白的生成
[0537]
使用hexapro背景(含有胞外结构域的残基14-1208(基因库：mn908947)，六个脯氨酸取代(f817p、a892p、a899p、a942p、k986p、v987p)以及与北欧溢出/溢回相关联的所有/大多数变体中建立的d614g突变，以及将切割位点残基682-685(“rrar”)(seq id no:53)替换为“gsas”(seq id no:54))生成刺突蛋白，以用于表位分仓(epitope binning)研究和结构生物学。将所得的刺突蛋白变体克隆到含有n末端高斯荧光素酶信号序列(mgvkvlfaliciavaea(seq id no:55))和c末端折叠子三聚体化结构域，接着是hrv-3c切割位点和twin-strep-标签的phcmv哺乳动物表达载体中。将质粒转化到恒星感受态细胞(stellar competent cell)中，并使用质粒中提试剂盒(凯杰公司，希尔登，德国(qiagen,hilden,germany))进行分离。
[0538]
将sars-cov-2hexapro刺突蛋白瞬时转染到freestyle 293-f或expicho-s细胞(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中。两种细胞系均根据制造商的方案进行维持和转染。简而言之，将293-f细胞生长至2.0x 106个细胞/ml的密度，并在转染当天(第0天)稀释至1.0x 106个细胞/ml。将质粒dna和聚乙烯亚胺在opti-mem(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中混合，温育25分钟，然后添加到细胞中。将细胞在37℃、8％ co2和120rpm下温育并在第5天收获。对于expicho培养物，使用制造商的“高滴度”方案。简而言之，将细胞生长至1x 107个细胞/ml的密度，并在转染当天(第0天)稀释至6x 106个细胞/ml。根据制造商的说明书将质粒dna和expifectamine在opti-pro sfm(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)中混合，并且添加到细胞中。在第1天，根据建议的方案用制造商提供的饲料和增强剂喂养细胞，并且然后将培养物在32℃、5％ co2和115rpm下温育。在第7天收获expicho培养物。将所有培养物均通过离心澄清，接着添加biolock(iba lifesciences公司，哥廷根，德国(iba lifesciences,germany))，并且将上清液流过0.22μm无菌过滤器，并使用用tbs缓冲液(25mm tris ph 7.6，200mm nacl，0.02％ nan3)平衡的5ml streptrap-hp柱在kta go(思拓凡公司，马尔伯勒，马萨诸塞州)上纯化，并且在增补5mm d-脱硫生物素(西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州(sigma-aldrich,st.louis,mo))的tbs缓冲液中洗脱。使用hrv-3c蛋白酶切割strep-标签，并且通过尺寸排阻色谱法(sec)在tbs中的superdex 6增加10/300柱(通用电气医疗公司，芝加哥，伊利诺伊州(ge healthcare,chicago,il))上进一步纯化蛋白质。
[0539]
高通量表面等离子体共振(ht-spr)表位分仓
[0540]
在配备cmdp传感器芯片的carterra lsa spr仪器上，在25℃下且在hbste-bsa运行缓冲液(10mm hepes ph 7.4，150mm nacl，3mm edta，0.05％tween-20，增补0.5mg/ml bsa)中用夹心测定形式进行表位分仓。使用两个微流体模块(96通道打印头(96ph)和单流
通池(sfc))将样品递送到传感器芯片上。用25mm mes(ph 5.5)和0.05％ tween-20作为运行缓冲液进行表面准备。使用sfc在0.1m mes(ph 5.5)中用新鲜制备的130mm 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)+33mm n-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)溶液激活芯片。在稀释到10mm乙酸钠(ph 4.25)中的10μg/ml下，使用96ph将抗体固定10分钟。使用sfc注射1m乙醇胺-hcl(ph 8.5)7分钟来淬灭非反应性酯。在此阵列上进行分仓分析，该阵列具有作为运行缓冲液的hbste-bsa缓冲液和样品稀释液。在每个循环中以50nm(1.3μg/ml)注射rbd抗原4分钟，并且接着立即以30μg/ml(igg构建体为200nm)注射分析物抗体4分钟。每个循环用10mm甘氨酸(ph 2.0)的双脉冲(每个脉冲17秒)再生表面。使用表位工具软件(carterra公司，盐湖城，犹他州(carterra,salt lake city,ut))处理和分析数据。
[0541]
octet亲和力测量
[0542]
使用fortebio octet red96e仪器通过生物层干涉技术(bli)测量结合动力学和亲和力。在1x动力学缓冲液中将抗体归一化至100nm，并捕获到抗人fc(ahc)生物传感器上。然后将生物传感器与sars-cov-2rbd(百普赛斯集团，纽瓦克，特拉华州)的系列稀释液一起温育以确定缔合速率和解离速率。
[0543]
参考抗体衍生序列的人源化
[0544]
因为参考抗体衍生抗体是基于抗cov1鼠抗体生成的，因此所得的序列含有鼠框架。对具有所需结合特性的所选抗体进行人源化程序，由此将其cdr片段转移到人框架上。
[0545]
更具体地，使用计算方法来评估所需cdr序列与经过治疗验证的人框架数据库之间的兼容性。在鉴定这些最优框架后，该算法接下来对框架提出调整建议，并在必要时提出一些cdr位置，以进一步改善兼容性。产生对应的人源化抗体并进行表征，例如对它们的结合亲和力和动力学特性进行表征。
[0546]
实例8.igg1分子在体外中和sars-cov-2
[0547]
将九种igg1 ab提交给冠状病毒免疫治疗联合会进行中和研究。所有九种igg1分子均显示阻断假和真wt病毒的vero单层感染的能力。(表4)。
[0548]
选择一种抗体ab-8进行进一步研究，以确定cov-2rbd中新突变的易感性。使用携带在多种人类和水貂变体中发现的点突变的假病毒进行假病毒中和研究。如图5所示，ab-8对大多数突变具有抗性，如通过在-2.5与2.5之间的ic
50
倍数变化所指示。
[0549]
实例9.表位和亲和力
[0550]
研究了单克隆抗体针对可溶性g614 hexapro刺突蛋白胞外结构域和单体rbd的亲和力。使用高通量表面等离子体共振分析，将与rbd反应的抗体分选到11个不同的“群落”中。rbd群落被定义为同一群落的两个成员之间无法制造spr夹心对，指示有共同的表位进行结合。发现ab-1至ab-9聚集成“rbd群落5”，这是一个独特的“rbd群落”表位仓(数据未示出)。如表4所示，这些抗体对靶抗原g614 hexapro刺突蛋白胞外结构域或单体rbd显示nm亲和力。
[0551]
实例10.igg1多肽的人源化
[0552]
使用材料和方法中概述的计算方法对所选的克隆进一步人源化。为了确认人源化并没有消除结合cov-2rbd的亲和力或倾向，使用生物层干涉技术评估新人源化序列针对亲本“种子”的亲和力。如图6和图7中概述，克隆的人源化并没有去除原始种子序列结合cov-2rbd的能力。octet动力学数据在表5中总结。
[0553]
表1.氨基酸序列
[0554]
[0555]
[0556]
[0557]
[0558][0559]
表2.酵母展示亲和力测量
[0560][0561]
表3.全长igg对于sars-cov-2rbd的结合动力学和亲和力
[0562]
克隆kd(nm)k
on
(1/ms)k
off
(1/s)ab-1396.2x 1042.4x 10-3
[0563]
表4.全长igg1抗体的亲和力和中和
[0564]
[0565][0566]
表位群落(rbd)：5
19infection.lancet infect dis.:s1473-3099(20)30195-x.doi:10.1016/s1473-3099(20)30195-x.[epub ahead of print].
[0570]
2.lindsey r.baden and eric j.rubin(2020)covid-19-the search for effective therapy,n engl j med.,doi:10.1056/nejme2005477.
[0571]
3.ziegler et al.(2020)sars-cov-2receptor ace2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues,cell,doi:10.1016/j.cell.2020.04.035[journal pre-proof].
[0572]
所有专利、公开的申请以及本文引用的参考文献的传授内容都通过援引以其全文并入。
[0573]
虽然示例性实施例已进行了具体显示和描述，但本领域的技术人员应理解，在不偏离由所附权利要求涵盖的实施例范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的各种改变。

技术特征：
1.一种多肽，该多肽特异性结合严重急性呼吸综合征冠状病毒2刺突糖蛋白(sars-cov-2-刺突蛋白)，该多肽包含与选自以下的抗体的互补位相同的互补位：包含seq id no:4和seq id no:13的抗体；包含seq id no:5和seq id no:13的抗体；包含seq id no:6和seq id no:13的抗体；包含seq id no:7和seq id no:14的抗体；包含seq id no:8和seq id no:15的抗体；包含seq id no:9和seq id no:13的抗体；包含seq id no:10和seq id no:13的抗体；包含seq id no:41和seq id no:13的抗体；包含seq id no:42和seq id no:13的抗体；包含seq id no:43和seq id no:47的抗体；包含seq id no:44和seq id no:48的抗体；或包含seq id no:45和seq id no:49的抗体。2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包含免疫球蛋白重链可变区(v
h
)和免疫球蛋白轻链可变区(v
l
)。3.一种多肽，该多肽特异性结合严重急性呼吸综合征冠状病毒2刺突糖蛋白(sars-cov-2-刺突蛋白)，该多肽包含：a)免疫球蛋白重链可变区(v
h
)，该免疫球蛋白重链可变区包含分别与seq idno:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45的重链互补决定区1(hcdr1)、重链互补决定区2(hcdr2)和重链互补决定区3(hcdr3)相同的hcdr1、hcdr2和hcdr3；和b)免疫球蛋白轻链可变区(v
l
)，该免疫球蛋白轻链可变区包含分别与seq idno:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq idno:49的轻链互补决定区1(lcdr1)、轻链互补决定区2(lcdr2)和轻链互补决定区3(lcdr3)相同的lcdr1、lcdr2和lcdr3。4.如权利要求3所述的多肽，该多肽包含选自以下的抗体的hcdr1、hcdr2和hcdr3以及lcdr1、lcdr2和lcdr3：包含seq id no:4和seq id no:13的抗体；包含seq id no:5和seq id no:13的抗体；包含seq id no:6和seq id no:13的抗体；包含seq id no:7和seq id no:14的抗体；包含seq id no:8和seq id no:15的抗体；包含seq id no:9和seq id no:13的抗体；包含seq id no:10和seq id no:13的抗体；包含seq id no:41和seq id no:13的抗体；包含seq id no:42和seq id no:13的抗体；包含seq id no:43和seq id no:47的抗体；
包含seq id no:44和seq id no:48的抗体；或包含seq id no:45和seq id no:49的抗体。5.如权利要求3或4所述的多肽，该多肽进一步包含与包含以下的抗体的互补位相同的互补位：seq id no:4和seq id no:13；seq id no:5和seq id no:13；seq id no:6和seq id no:13；seq id no:7和seq id no:14；seq id no:8和seq id no:15；seq id no:9和seq id no:13；seq id no:10和seq id no:13；seq id no:41和seq id no:13；seq id no:42和seq id no:13；seq id no:43和seq id no:47；seq id no:44和seq id no:48；或seq id no:45和seq id no:49。6.一种多肽，该多肽特异性结合严重急性呼吸综合征冠状病毒2刺突糖蛋白(sars-cov-2-刺突蛋白)，该多肽包含含有seq id no:2的免疫球蛋白重链可变区(v
h
)，其中：x1不是t；x2不是r；x3不是s；x4不是t；x5不是t；x6不是l；x7不是l；x8不是r；x9不是t；x
10
不是l；或者x
11
不是y，或前述内容的任何组合。7.如权利要求6所述的多肽，该多肽进一步包含含有seq id no:11的免疫球蛋白轻链可变区(v
l
)，其中：x
12
不是s；x
13
不是l；或者x
14
不是v，或前述内容的任何组合。8.一种多肽，该多肽特异性结合严重急性呼吸综合征冠状病毒2刺突糖蛋白(sars-cov-2-刺突蛋白)，该多肽包含含有seq id no:2的免疫球蛋白重链可变区(v
h
)，其中：x1是t或s；
x2是r或w；x3是s或g；x4是t、q或n；x5是t或k；x6是l或k；x7是l或t；x8是r或n；x9是t或s；x
10
是l或f；或者x
11
是y或v，或前述内容的任何组合。9.如权利要求8所述的多肽，其中：x1是s；x2是w；x3是g；x4是q或n；x5是k；x6是k；x7是t；x8是n；x9是s；x
10
是f；或者x
11
是v，或前述内容的任何组合。10.如权利要求6所述的多肽，该多肽进一步包含含有seq id no:11的免疫球蛋白轻链可变区(v
l
)，其中：x
12
是s或g；x
13
是l或q；或者x
14
是v或l，或前述内容的任何组合。11.如权利要求10所述的多肽，其中：x
12
是g；x
13
是q；或者x
14
是l，或前述内容的任何组合。12.如权利要求6-11中任一项所述的多肽，其中该v
h
包含分别与seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq idno:10、seq id no:41或seq id no:42的重链互补决定区1(hcdr1)、重链互补决定区2(hcdr2)和重链互补决定区3(hcdr3)相同的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
13.如权利要求6-12中任一项所述的多肽，其中该v
l
包含分别与seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15的轻链互补决定区1(lcdr1)、轻链互补决定区2(lcdr2)和轻链互补决定区3(lcdr3)相同的lcdr1、lcdr2和lcdr3。14.一种多肽，该多肽特异性结合严重急性呼吸综合征冠状病毒2刺突糖蛋白(sars-cov-2-刺突蛋白)，该多肽包含含有seq id no:46的免疫球蛋白重链可变区(v
h
)，其中：x1是e或q；x2是p或s；x3是a或e；x4是l或v；x5是i或v；x6是s或t；x7是a或m；x8是k或q；x9是g或s；x
10
是n、q或r；x
11
是a或s；x
12
是p或q；x
13
是k或s；x
14
是q或r；x
15
是l或m；x
16
是s或t；x
17
是a或v；x
18
是k或t；x
19
是s或t；x
20
是l或m；x
21
是e或q；x
22
是l或w；x
23
是n或s；x
24
是r或s；x
25
是k或r；x
26
是a或s；x
27
是d或s；x
28
是m或v；x
29
是f或y；x
30
是n或r；或者x
31
是v或y，或前述内容的任何组合。15.如权利要求14所述的多肽，该多肽进一步包含含有seq id no:50的免疫球蛋白轻链可变区(v
l
)，其中：
x
32
是d或e；x
33
是q或v；x
34
是l或m；x
35
是g或s；x
36
是s或t；x
37
是a或l；x
38
是p或v；x
39
是d或e；x
40
是a或v；x
41
是i或l；x
42
是s或t；x
43
是e或g；x
44
是a、n或s；x
45
是l或y；x
46
是e或g；x
47
是k或q；x
48
是k或r；x
49
是s或t；x
50
是a或q；x
51
是s或t；x
52
是i或v；x
53
是d或s；x
54
是r或s；x
55
是e或q；x
56
是t或v；x
57
是l或q；或者x
58
是l或v，或前述内容的任何组合。16.如权利要求6-15中任一项所述的多肽，其中该多肽包含与选自以下的v
h/vl
组合的互补位相同的互补位：seq id no:4/seq id no:13、seq id no:5/seq id no:13、seq id no:6/seq id no:13、seq id no:7/seq id no:14、seq id no:8/seq id no:15、seq id no:9/seq id no:13、seq id no:10/seq id no:13、seq id no:41/seq id no:13、seq id no:42/seq id no:13、seq id no:43/seq id no:47、seq id no:44/seq id no:48或seq id no:45/seq id no:49。17.如权利要求2-16中任一项所述的多肽，其中该v
h
与以下具有至少85％同一性：seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45、或前述内容的组合。18.如权利要求2-17中任一项所述的多肽，其中该v
h
相对于以下包含约1-10个氨基酸取
代：seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq idno:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44或seq id no:45、或前述内容的组合。19.如权利要求2-18中任一项所述的多肽，其中该v
l
与以下具有至少85％同一性：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49、或前述内容的组合。20.如权利要求2-19中任一项所述的多肽，其中该v
l
相对于以下包含约1-10个氨基酸取代：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:47、seq id no:48或seq id no:49、或前述内容的组合。21.如权利要求18或20所述的多肽，其中这些氨基酸取代是保守取代。22.如权利要求21所述的多肽，其中这些氨基酸取代是高度保守取代。23.如权利要求2-22中任一项所述的多肽，其中：a)该v
h
包含seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:41或seq id no:42；并且b)该v
l
包含seq id no:13。24.如权利要求2-22中任一项所述的多肽，其中：a)该v
h
包含seq id no:7；并且b)该v
l
包含seq id no:14。25.如权利要求2-22中任一项所述的多肽，其中：a)该v
h
包含seq id no:8；并且b)该v
l
包含seq id no:15。26.如权利要求2-25中任一项所述的多肽，其中该v
h
和v
l
被人源化、含有人框架区、或其组合。27.如权利要求2-22中任一项所述的多肽，其中：a)该v
h
包含seq id no:43；并且b)该v
l
包含seq id no:47。28.如权利要求2-22中任一项所述的多肽，其中：a)该v
h
包含seq id no:44；并且b)该v
l
包含seq id no:48。29.如权利要求2-22中任一项所述的多肽，其中：a)该v
h
包含seq id no:45；并且b)该v
l
包含seq id no:49。30.如权利要求1-29中任一项所述的多肽，其中该多肽是抗体或其抗原结合片段。31.如权利要求30所述的多肽，其中该抗原结合片段选自fab、f(ab’)2、fab’、scfv、或fv。32.如权利要求30所述的多肽，该多肽进一步包含抗体重链恒定区序列、抗体轻链恒定区序列、或抗体重链恒定区序列和抗体轻链恒定区序列两者。33.如权利要求30所述的多肽，其中该抗体重链恒定区选自由iga恒定区、igd恒定区、ige恒定区、igg恒定区和igm恒定区组成的组。
34.如权利要求33所述的多肽，其中该抗体重链恒定区是igg1重链恒定区。35.如权利要求32-34中任一项所述的多肽，该多肽进一步包含选自由κ恒定区或λ恒定区组成的组的抗体轻链恒定区。36.如权利要求35所述的多肽，其中该抗体轻链恒定区是κ轻链恒定区。37.如权利要求1-36中任一项所述的多肽，其中该多肽缀合至异源部分。38.如权利要求37所述的多肽，其中该异源部分是治疗剂、诊断剂或其组合。39.如权利要求37所述的多肽，其中该异源部分选自下组，该组由以下组成：聚乙二醇(peg)、十六酸、水凝胶、脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、和异源多肽序列、或其组合。40.如权利要求39所述的多肽，其中该聚合物纳米颗粒包括聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)。41.如权利要求37所述的多肽，其中该异源多肽序列包括载剂多肽。42.如权利要求41所述的多肽，其中该载剂多肽是白蛋白或fc多肽。43.如权利要求1-42中任一项所述的多肽，其中该多肽：a)以10μm或更小的k
d
结合sars-cov-2；b)减少sars-cov-2与血管紧张素转换酶2(ace2)的结合；或c)降低人细胞中sars-cov-2的感染性，或前述内容的任何组合。44.如权利要求43所述的多肽，其中该sars-cov-2是包含t19r、156del、157del、r158g、l452r、t478k、d614g、p681r和d950n，并且任选地进一步包含g142d的变体。45.如权利要求43或44所述的多肽，其中该多肽以100nm或更小的k
d
结合sars-cov-2。46.如权利要求43-45中任一项所述的多肽，其中该多肽使sars-cov-2与ace2的结合减少至少约30％。47.如权利要求43-46中任一项所述的多肽，其中该ace2是灵长类动物ace2。48.如权利要求47所述的多肽，其中该灵长类动物ace2是人ace2(geneid59272；示例性蛋白质序列np_001358344.1)。49.如权利要求47所述的多肽，其中该灵长类动物ace2是选自下组的非人灵长类动物ace2，该组由以下组成：黑猩猩ace2、猕猴ace2、食蟹猴ace2及其组合。50.如权利要求43所述的多肽，其中该多肽使人细胞中sars-cov-2的感染性降低至少约30％。51.一种融合蛋白，该融合蛋白包含如权利要求1-50中任一项所述的多肽。52.一种多核苷酸，该多核苷酸包含编码如权利要求1-44中任一项所述的多肽或如权利要求51所述的融合蛋白的序列。53.一种表达载体，该表达载体包含如权利要求52所述的多核苷酸。54.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求47所述的多核苷酸或如权利要求53所述的表达载体。55.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-50中任一项所述的多肽或如权利要求54所述的融合蛋白。56.如权利要求55所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种药用赋形剂、稀释剂、或载剂。
57.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如权利要求55或56所述的组合物。58.一种抑制受试者中sars-cov-2-刺突蛋白与细胞之间的融合的方法，该方法包括使该细胞与有效量的如权利要求55或56所述的组合物接触。59.如权利要求57或58所述的方法，其中该受试者患有covid-19。60.如权利要求57或58所述的方法，其中该受试者具有发展covid-19的风险。61.如权利要求57-60中任一项所述的方法，其中该受试者是人。62.如权利要求57-61中任一项所述的方法，其中该受试者患有心脏病。63.如权利要求62所述的方法，其中该心脏病选自下组，该组由以下组成：充血性心脏病、冠状动脉疾病、高血压心脏病、炎症性心脏病、肺源性心脏病、风湿性心脏病、瓣膜性心脏病、心肌病、心力衰竭、及其组合。64.如权利要求63所述的方法，其中该心力衰竭是充血性心力衰竭。65.如权利要求63所述的方法，其中该炎症性心脏病选自下组，该组由以下组成：心内膜炎、心脏增大、心肌炎、及其组合。66.如权利要求57-65中任一项所述的方法，其中该受试者患有糖尿病。67.如权利要求57-66中任一项所述的方法，其中该受试者患有肺病。68.如权利要求67所述的方法，其中该肺病选自下组，该组由以下组成：急性呼吸窘迫综合征、哮喘、支气管炎、copd、肺气肿、肺肿瘤、胸膜腔疾病、肺血管疾病、呼吸道感染、及其组合。69.如权利要求68所述的方法，其中：a)该呼吸道感染是上呼吸道感染、下呼吸道感染、或肺炎；b)该胸膜腔疾病是胸膜间皮瘤或张力性气胸；c)该肺血管疾病是栓塞、水肿、动脉高血压或出血；或d)其组合。70.如权利要求57-69中任一项所述的方法，其中该受试者是吸烟者。71.如权利要求57-70中任一项所述的方法，其中该受试者是免疫受损的。72.如权利要求71所述的方法，其中该受试者正在接受免疫抑制疗法。73.如权利要求57-72中任一项所述的方法，其中该受试者的年龄是40岁或更大。74.如权利要求57-73中任一项所述的方法，该方法进一步包括向该受试者施用治疗有效量的额外的治疗剂。75.如权利要求74所述的方法，其中该额外的治疗剂选自下组，该组由以下组成：抗病毒剂、ace2抑制剂、额外的sars-cov-2-刺突蛋白结合抗体、抗生素、抗疟疾剂、疫苗、及其组合。76.如权利要求75所述的方法，其中：a)该额外的sars-cov-2-刺突蛋白结合抗体选自下组，该组由以下组成：巴尼韦单抗、埃特司韦单抗、卡斯瑞韦单抗、依米得韦单抗、及其组合；b)该抗病毒剂选自下组，该组由以下组成：奥司他韦(达菲)、法匹拉韦、金刚烷胺、瑞德西韦、金刚乙胺、普康那利、sars-cov-2的反义rna、sars-cov-2的sirna、及其组合；c)该ace2抑制剂选自下组，该组由以下组成：ace2的rnai、ace2的sirna、基于crispr的
ace2抑制剂、可溶性ace2、可溶性ace2变体、抗ace2抗体、及其组合；d)该抗生素包括阿奇霉素；e)该抗疟疾剂包括氯喹；f)该疫苗是核酸疫苗或灭活病毒疫苗；或g)其组合。77.如权利要求76所述的方法，其中该疫苗是mrna-1273、bnt162、ino-4800、azd1222、ad5-ncov、picovacc、nvx-cov2373、或其组合。

技术总结
在各种实施例中，本发明提供了与严重急性呼吸综合征冠状病毒的刺突糖蛋白(例如，SARS-CoV-2-刺突蛋白)特异性结合的多肽。在各种实施例中，本发明还提供了包含这些多肽中的一种或多种的融合蛋白、编码这些多肽的多核苷酸、适用于表达这些多肽的载体和宿主细胞、以及用于治疗病毒感染(例如，COVID-19)的方法。19)的方法。


技术研发人员：G
受保护的技术使用者：旗舰开拓创新六世公司
技术研发日：2021.07.06
技术公布日：2023/8/5