微生物菌株在发酵制备低分子量岩藻多糖中的应用及制备方法与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及微生物菌株在发酵制备低分子量岩藻多糖中的应用，以及利用上述的微生物菌株发酵制备低分子量岩藻多糖的方法。


背景技术：

2.岩藻多糖具有天然有机活性，其生物活性与它的结构、空间构象、化学组成、分子量等密切相关。多糖分子量对生物活性有非常重要的影响，大分子量岩藻多糖因难以穿过基膜而影响它的活性，低分子量的岩藻多糖在抵抗低密度脂蛋白氧化、血糖调节和抗血栓等方面均优于大分子量的岩藻多糖，具有更好的生物活性。因此，通过适宜的降解方法得到合适分子量大小的多糖是获取高活性岩藻多糖的有效手段。
3.目前，低分子量岩藻多糖的制备方法主要包括酸/碱解法、氧化降解法和酶解法。
4.其中，化学降解法破坏性强不具选择性，因岩藻多糖结构的复杂性，又缺乏商品化的生物酶而难以实现，物理降解法的效率较低。现阶段，益生菌发酵是多糖降解的一种重要手段，微生物可产生降解大分子化合物和非营养因子的复合酶系，将底物进行生物转化，从而提高生物可利用度，如sunmin park等人发现通过黄体杆菌藻发酵转化可将大分子岩藻多糖降解为低分子量岩藻多糖，可显著提高葡萄糖耐量；hifney等在提取岩藻多糖前，通过谢瓦散囊菌发酵海藻，有效降解了大分子岩藻多糖，并提高了其抗氧化能力。
5.普通市售菌株不具备降解岩藻多糖的能力，因此，现有的用于岩藻多糖降解的微生物菌株多从海藻内生菌中分离获得，难以大规模生产应用，限制了低分子量岩藻多糖的工业化生产。


技术实现要素：

6.为了解决上述的技术问题，本发明提供了微生物菌株在发酵制备低分子量岩藻多糖中的应用及制备方法。
7.本发明所提供的微生物菌株在发酵制备低分子量岩藻多糖中的应用，具体是：将粉碎的海带加入到水中，先酶解，再依次通过酿酒酵母和植物乳杆菌发酵，钙沉、梯度醇沉，获得低分子量岩藻多糖。
8.本发明中，所述的岩藻多糖，其数均分子量≤22kda。
9.本发明中所采用的两株微生物菌，分别是酿酒酵母与植物乳杆菌，所述的酿酒酵母于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，分类命名：酿酒酵母amnb091(saccharomyces cerevisiae amnb091)；所述的植物乳杆菌于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，分类命名：植物乳杆菌lp1406
10.(lactiplantibacillus plantarum lp1406)。
11.另外，本发明以下实施例中所用的微生物菌株，若无特殊说明，均为上述的两株
菌。
12.本发明的原理是：先采用生物酶将褐藻细胞壁中的纤维素降解，使得褐藻细胞间组织中的岩藻多糖在相对较低的温度下尽可能减少损失，且尽可能多地释放出来，然后在酶解的基础上，采用酿酒酵母和植物乳杆菌进行分步发酵，将大分子物质降解为低分子量的岩藻多糖，使最终所获得的岩藻多糖的数均分子量≤22kda。
13.本发明中采用的酿酒酵母amnb091，其中富含蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等复合酶系，可进一步分解褐藻细胞壁，同时可将岩藻多糖支链中的葡萄糖、木糖等单糖水解。而植物乳杆菌lp1406则可代谢多糖分子，产生大量有机酸，可有效将大分子岩藻多糖降解为低分子量结构。
14.以上的两株菌依次对酶解物进行发酵，两者共同作用之后，所获得的岩藻多糖其分子量低，活性更优异。
15.在本发明所提供的上述的应用中，所述的酿酒酵母amnb091和植物乳酸菌lp1406的接种量均为3％。
16.所述的微生物菌的发酵条件为：酿酒酵母amnb091在28～32℃，以180～220r/min的转速下发酵24～48h；植物乳杆菌lp 1406在30～37℃下，静置发酵24～48h。
17.优选的，所述的酿酒酵母amnb091于30℃，以200r/min的转速下发酵48h；所述的植物乳杆菌lp1406在37℃下，静置发酵48h。
18.上述的应用中，所述的钙沉步骤是在发酵结束后，将发酵产物离心，加氯化钙，过滤去沉淀，收集上清液ⅰ，氯化钙加入量为海带质量的25～40wt％。
19.所述的梯度醇沉步骤中，将钙沉所得的上清液ⅰ浓缩后离心，除去沉淀，在上清液ⅰ中加至乙醇醇沉，离心收集沉淀得岩藻多糖粗品，将岩藻多糖粗品复溶，加入氯化钙溶液，离心去沉淀，获得上清液ⅱ；在所得的上清液ⅱ中加入乙醇醇沉，离心去沉淀，获得上清液ⅲ；再在上清液ⅲ中加入乙醇醇沉，离心，取沉淀冻干，得岩藻多糖。
20.优选的，所述的梯度醇沉步骤中，将钙沉所得的上清浓缩ⅰ至1/30～1/20体积，离心除去沉淀，在上清液ⅰ中加入体积分数为70％的乙醇醇沉，离心，收集沉淀得岩藻多糖粗品，将岩藻多糖粗品复溶，加入4m氯化钙溶液，离心去沉淀，获得上清液ⅱ，再次在所得的上清液ⅱ中加入30％的乙醇醇沉，离心去沉淀，获得上清液ⅲ，最后在上清液ⅲ中加入70％的乙醇醇沉，离心，取沉淀，冷冻干燥3～5d得岩藻多糖。
21.优选的，将海带粉碎至80～100目，然后将粉碎的海带按料液比1：30～50的重量比加入到水中。
22.上述的应用中，所述的酶解，采用分步酶解法，先利用1～5wt％的酸性纤维素酶、0.1～1wt％的酸性果胶酶对粉碎后的海带与水的混合物进行酶解，酶解液灭酶后，再采用0.2～1wt％的碱性果胶酶对酶解液进行二次酶解，灭酶，获得最终的酶解液；以上比例是以海带的重量为基准为计的。
23.进一步的，本发明所提供的利用微生物菌株在发酵制备低分子量岩藻多糖的方法，包括以下的步骤：
24.(1)将粉碎的海带加入到水中，酶解；
25.(2)依次通过酵母菌和乳酸菌发酵；发酵的具体条件如下：所述的酿酒酵母在28～32℃，以180～220r/min的转速发酵24～48h；所述的植物乳杆菌在30～37℃，静置发酵24～
48h；
26.(3)钙沉、梯度醇沉，获得低分子量岩藻多糖；所述的岩藻多糖，其数均分子量≤22kda；
27.所述的钙沉和醇沉的条件为：将钙沉所得的上清浓缩ⅰ至1/30～1/20体积，离心除去沉淀，在上清液ⅰ中加入70％的乙醇醇沉，离心，收集沉淀得岩藻多糖粗品，将岩藻多糖粗品复溶，加入4m氯化钙溶液，离心去沉淀，获得上清液ⅱ，再次在所得的上清液ⅱ中加入30％的乙醇醇沉，离心去沉淀，获得上清液ⅲ，最后在上清液ⅲ中加入70％的乙醇醇沉，离心，取沉淀，冷冻干燥3～5d得岩藻多糖。
28.本发明的有益效果在于：
29.(1)本发明重点解决了普通市售菌株不具备降解岩藻多糖的能力这一技术困难，将酿酒酵母amnb091和植物乳酸菌lp1406联用，以分步发酵的方式，最终获得了数均分子量仅为22kda左右的岩藻多糖，其分子量低，生物活性更优异，尤其是对肝癌细胞(hepg2)具有更好的抑制能力，细胞存活率为55％；
30.(2)本发明中在采用微生物菌株发酵之前，先对原料进行生物酶解，实现褐藻细胞间组织中的岩藻多糖的在相对较低的温度下释放，尽可能多的保留了活性成分岩藻多糖，再采用酿酒酵母amnb091和植物乳酸菌lp1406进行分级发酵，将大分子物质降解为低分子量岩藻多糖，生物酶法与微生物法联合使用，获得了分子量更低、活性更好的岩藻多糖产品；
31.(3)本发明的方法步骤较简单，实用性强，易于推广。
附图说明
32.图1为本发明的实施例1中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
33.图2为本发明的实施例2中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
34.图3为本发明的实施例3中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
35.图4为本发明的实施例4中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
36.图5为本发明的对比例1中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
37.图6为本发明的对比例2中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
38.图7为本发明的对比例3中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
39.图8为本发明的对比例4中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
40.图9为本发明的对比例5中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
41.图10为本发明的对比例6中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图；
42.图11为本发明的对比例7中所制备的岩藻多糖的凝胶色谱图。
具体实施方式
43.为了能使本领域技术人员更好地理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
44.本发明所采用的酶购自如下的厂家：
45.酸性纤维素酶：沧州夏盛酶生物技术有限公司；
46.酸性果胶酶：济南圣和化工有限公司；
47.碱性果胶酶：济南圣和化工有限公司；其它的原料若无特殊说明，则为市售普通产品。
48.实施例1
49.1.1制备岩藻多糖。
50.(1)海带粉碎至100目，将粉碎后的海带加入到水中，海带与水的重量体积比为1：35，然后先加入酸性纤维素酶3wt％、酸性果胶酶0.5wt％，酶解120min，之后加入碱性果胶酶0.6wt％，酶解90min；
51.(2)将(1)中的酶解液灭菌后，先采用酿酒酵母于30℃，以200r/min的转速发酵48h，将一步发酵液灭菌后，然后再采用植物乳杆菌在37℃，静置发酵48h；
52.(3)钙沉、醇沉，获得低分子量岩藻多糖，具体步骤如下：
53.在发酵结束后，将发酵产物离心，加入占海带质量30wt％的氯化钙，过滤去沉淀，收集上清液ⅰ；
54.将钙沉所得的上清液ⅰ浓缩至1/20体积去沉淀，在上清液ⅰ中加入体积分数为70％的乙醇醇沉，离心，去沉淀得岩藻多糖粗品，再在岩藻多糖粗品中加入4m氯化钙溶液，离心去沉淀，获得上清液ⅱ，再次在所得的上清液ⅱ中加入30％的乙醇醇沉，离心去沉淀，获得上清液ⅲ，最后在上清液ⅲ中加入70％的乙醇醇沉，离心，取沉淀，冷冻干燥得岩藻多糖。
55.1.2岩藻多糖的检测。
56.色谱条件：agilent凝胶色谱仪，配有激光检测器和示差检测器；
57.色谱柱:安捷伦agilent pl aquagel-oh水相gpc/sec分析柱，4.6
×
250mm，柱温：25℃；
58.流速：1.0ml/min；
59.流动相:10mm nah2po4+0.2m nano3(ph＝7)。
60.检测结果见附图1所示。
61.从图1的高效液相色谱图中可以看出，采用本实施例的方法所制备出的岩藻多糖的分子量仅为22kda，即本发明的方法实现了小分子量的岩藻多糖的制备。
62.实施例2～4
63.在实施例1的基础上调整岩藻多糖的制备工艺参数，各实施例的条件如下表1所示。
64.表1实施例2-4岩藻多糖制备的工艺参数
[0065] 实施例2实施例3实施例4发酵时间24h+24h24h+48h48h+48h乙醇的体积分数70％70％60％
[0066]
对实施例1-4所获得的岩藻多糖的分子量进行检测，结果见下表2。
[0067]
表2实施例1-4中岩藻多糖的分子量
[0068]
实施例分子量(kda)实施例122实施例265实施例334实施例497
[0069]
本发明中在对酶解的条件进行优化之后，进一步探究了微生物的不同发酵时间以及梯度醇沉时乙醇的体积分数对岩藻多糖分子量大小的影响情况。本发明的实施例1-3结果显示，微生物菌株的发酵时间在一定程度上影响着微生物对岩藻多糖降解的是否充分，较长的发酵时间有利于降低岩藻多糖的分子量。此外，梯度醇沉时的乙醇体积分数同样对所获得的岩藻多糖产品的分子量大小有不可忽视的影响，采用较低体积分数的乙醇进行梯度醇沉，即便是在相同的发酵时间下，所获得的岩藻多糖分子量也较高，可能的原因是，不同极性的溶液中岩藻多糖的溶解度不同，当梯度醇沉的乙醇体积分数为70％时，效果最好。
[0070]
对比例1-7
[0071]
在实施例1的基础上，分别采用不同的微生物菌对海带进行发酵来制备岩藻多糖，所获得的岩藻多糖的分子量如下表3所示。
[0072]
表3各对比例发酵所制备的岩藻多糖的分子量
[0073][0074]
本发明上述的对比例1-7中所制备出的岩藻多糖产品的分子量的情况，可以看出：
[0075]
其一，仅采用市售的酵母、市售的乳杆菌等单一的菌株进行发酵，即便是在完全相同的酶解工艺，甚至后续操作的工艺也完全相同时，所获得的岩藻多糖的分子量均较高，如本发明的对比例1-2中所示的，岩藻多糖的分子量甚至高达1803kda，而较高的分子量在一定程度上限制了岩藻多糖的生理活性。
[0076]
其二，虽然在一定程度上，将市售的酵母与乳杆菌进行组合发酵，如本发明的对比例3中所示的情况，所获得的岩藻多糖的分子量也高达1134kda，依旧难以达到较好的效果，所以即便是复合发酵可能有利于降低岩藻多糖的分子量，但是如何才能使得分子量出现较为显著的降低，这并不是普通菌株的简单复合就能够获得的。
[0077]
其三，本发明的对比例4-5中，分别采用本发明筛选的，经过特殊保藏的两种菌株，即酿酒酵母amnb091与植物乳杆菌lp1406，结果显示，发酵后所获得的岩藻多糖的分子量得到了极为显著的降低，仅是普通市售的同类微生物菌株发酵获得岩藻多糖分子量的1/8～1/6，这无疑是一个显著的改善，而这对于岩藻多糖生物活性的提高意义重大。
[0078]
此外，本发明的对比例7中，与实施例1不同的是，仅不添加酶制剂对多糖进行预处理，结果显示，即便是采用相同的菌株进行发酵，发酵效果也远不如本发明的实施例1，该对
比例中，岩藻多糖的分子量达到816kda，而本发明的实施例1中仅为22kda，因而，本发明中要实现低分子量的岩藻多糖的制备，必须辅以酶解，外加特殊保藏的微生物菌等多重因素共同作用才能够实现，缺少其中的任一环也难以达到本发明的技术效果。
[0079]
本发明中先采用纤维素酶、酸性和碱性果胶酶对海带进行酶解，将褐藻细胞壁中的纤维素降解，使得褐藻细胞间组织中的岩藻多糖在相对较低的温度下尽可能减少损失，且尽可能多地释放出来，然后在酶解的基础上，采用酿酒酵母amnb091与植物乳杆菌lp1406进行分步发酵，将大分子物质降解为低分子量的岩藻多糖，使最终所获得的岩藻多糖的数均分子量≤22kda。
[0080]
试验例1
[0081]
为了验证本发明中实施例及对比例中的产品的抗癌效果，本发明人进行了以下的实验：
[0082]
hepg2细胞存活率的检测：以实施例1～4以及对比例1-7获得的岩藻多糖作为检测的样品，具体的检测步骤如下：
[0083]
用mtt比色法检测岩藻多糖对人肝癌hepg2细胞的抑制作用。
[0084]
采用96孔平板培养细胞，当hepg2细胞密度约为80％时，加入胰酶消化细胞后，离心后弃上清取沉淀，重新加入5ml新鲜培养液重悬沉淀制备细胞悬液，将处于对数生长期的hepg2细胞接种于96孔微量培养板内，每孔100μl。
[0085]
在37℃、5％的co2浓度的培养箱中培养12～24h后吸去旧培养基，分别加入不同浓度含岩藻多糖的新鲜培养基100μl，使多糖终浓度为1、10、50、100、400、800、1000μg/ml，每个浓度设置6个平行孔，对照组加空白培养基，37℃、5％ co2以及饱和湿度的培养箱中培养24h后，每孔加入20μl mtt(5mg/ml)溶液，继续培养4h后终止培养，弃上清，每孔加入100μl dmso避光振荡10min，使mtt还原产物完全溶解，在570nm处用酶标仪测定各孔吸光度(od)值，按下列公式计算被测物对人肝癌hepg2细胞生长的抑制率。
[0086]
细胞存活率(％)＝样品组od值-空白组od值/对照组od值-空白组od值
×
100％。
[0087]
上述的实施例1-4以及对比例1-7所获得的岩藻多糖产品对癌细胞抑制情况或者细胞存活率情况见下表4。
[0088]
表4实施例及对比例产品的细胞存活率情况
[0089]
实施例细胞存活率(％)对比例细胞存活率(％)实施例155对比例1105实施例267对比例2102实施例358对比例396实施例472对比例487
ꢀꢀ
对比例585
ꢀꢀ
对比例6103
ꢀꢀ
对比例789
[0090]
从上述的对比结果中看出：本发明所制备的低分子量的岩藻多糖，其对于肝癌hepg2细胞具有较为显著的抑制作用，特别是实施例1中所制备的分子量为22kda的岩藻多糖，其应用于hepg2细胞时，细胞的存活率仅有55％；反观本发明的对比例1-7中所获得的岩藻多糖，其对于该癌症细胞的抑制率远不如各实施例，即岩藻多糖分子量的大小直接决定
了其活性的强弱，采用本发明的方法能够获得分子量较低的岩藻多糖，对于岩藻多糖生理活性的充分发挥重大意义。

技术特征：
h；（3）钙沉、梯度醇沉，获得低分子量岩藻多糖；所述的岩藻多糖，其数均分子量≤22 kda；所述的钙沉和醇沉的条件为：将钙沉所得的上清ⅰ浓缩至1/30~1/20体积，离心除去沉淀，在上清液ⅰ中加入体积分数为70%的乙醇醇沉，离心，收集沉淀得岩藻多糖粗品，将岩藻多糖粗品复溶，加入4 m氯化钙溶液，离心去沉淀，获得上清液ⅱ，再次在所得的上清液ⅱ中加入体积分数为30%的乙醇醇沉，离心去沉淀，获得上清液ⅲ，最后在上清液ⅲ中加入体积分数为70%的乙醇醇沉，离心，取沉淀，冷冻干燥3~5 d得岩藻多糖。

技术总结
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及微生物菌株在发酵制备低分子量岩藻多糖中的应用及制备方法。本发明的应用具体是将粉碎的海带加入到水中，先酶解，再依次通过微生物菌株进行发酵，钙沉、梯度醇沉，获得低分子量岩藻多糖；所述的微生物菌株为酿酒酵母和植物乳杆菌。采用本发明的方法所获得的岩藻多糖的分子量低，数均分子量最低为22 kDa，且应用的步骤较简单，实用性强，易于推广。易于推广。易于推广。


技术研发人员：岳秋林 李昆仑 赵晨 赵林 李宝君 李福佳 刘咏轩 苏乐 张松 孙欣 奥兰多
受保护的技术使用者：元碳环保科技（山东）有限公司 山东晨彰生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/8/9