一种用于肿瘤靶向成像的近红外荧光探针的制备法与应用的制作方法

1.本发明属于生物成像与抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种用于肿瘤靶向成像的荧光探针及其制备方法。


背景技术：

2.随着环境污染等外源性因素增多的影响，恶性肿瘤发病率已呈逐年上升的态势，这表明恶性肿瘤已逐渐成为严重威胁人类健康的主要重大慢性疾病之一。目前，治疗恶性肿瘤主要依靠手术疗法、放射疗法、化学药物疗法和分子靶向药疗法等方式，其中手术治疗作为目前最有效和最普遍的方法之一，具有技术成熟和原发/转移病灶清除彻底的特点，可应用于大多数的实体瘤，尤其是早、中期的癌症患者。以手术治疗辅以靶向治疗(或放疗等辅助方式)可最大限度延长患者生存期或实现完全治愈。
3.在恶性肿瘤手术疗法中，精准探知病灶与界定病灶组织边界是手术的关键。考虑到功能和患者生存质量，应当尽可能多地保留体内器官或组织，同时随着女性对自身形象重视程度的提升，对于乳腺癌这类影响外观的疾病，患者也希望尽可能保持原有组织的完整性。但如无法彻底切除肿瘤又将导致肿瘤切缘的阳性率升高，进一步引起肿瘤的复发甚至体内扩散。目前术前影像诊断如ct、pet、mri等技术已十分完善，但这些技术不具有实时性，术中判断肿瘤病灶部位仍然依靠肉眼定位和触诊。这导致术前术中存在时空差异性，术中对肿瘤组织的经验性判断易出现偏差，对树根样浸润性生长的肿瘤(即肿瘤组织和正常组织交错生长)和微小转移灶难以识别，小肿瘤被遗漏概率上升，易导致术后复发。相较而言，荧光分子影像技术基于对比剂在特定组织中的富集，可同时实现体内病灶检测、实时术中导航、多模态治疗等多重功能，具有安全无创、设备简单和操作方便等特点。
4.目前荧光成像技术较多使用的罗丹明类、荧光素类和bodipy类常规荧光染料最大吸收波长都在紫外-可见区(＜650nm)，其组织穿透深度低、光毒性强和易受生物组织自发荧光干扰等缺点都大大降低检测的灵敏度和准确度，导致在生物成像领域应用受限。近红外荧光(700-1100nm)极大克服了传统荧光(400-700nm)面临的组织吸收、散射及自发荧光干扰问题，在活体成像中可实现更高的组织穿透深度(mm级)和空间分辨率，使其成为最具潜力的下一代活体荧光影像技术。在近红外成像领域，吲哚菁绿(icg)具有相对较低的组织吸收和较高的量子产率，是目前临床医学上最广泛使用的近红外荧光对比剂，但由于其缺乏肿瘤靶向性、光稳定性差、易与体内蛋白结合而改变发光性质等缺点，只能指导肝癌等极少数的肿瘤手术切除。因此适用于其他各类肿瘤切除术的近红外荧光探针需要具有主动靶向性，以增加靶向的稳定性和各种肿瘤切除术的普适性。
5.叶酸-叶酸受体组合的肿瘤靶向策略是靶向药物研发的常用方法，在荧光分子影像手术导航领域，传统的花菁类近红外荧光分子偶联叶酸配体的方案已在靶向类荧光显影剂的开发中初见成效，但是该方案的主要缺点是(1)其荧光团部分普遍使用的花菁类近红外荧光分子光稳定性差，体内环境易聚集发生聚集荧光淬灭(acq)效应而严重影响其光学性质；(2)荧光发光峰值小于800nm，组织穿透性较弱，且不匹配目前国内使用的主流荧光成
像设备(国内大部分带荧光成像频道的手术辅助设备均匹配icg，发光波长在820-830nm)，需额外配置成像设备，显著提高医疗机构使用成本；(3)叶酸受体作为广谱靶点，靶向效果欠佳，叶酸受体在部分正常细胞中也有表达，具有一定的假阳性概率。
6.综上所述，设计一种绝对亮度高、光/化学稳定性好、靶向结合针对性强且发射波长≥820nm的近红外荧光分子探针并应用于肿瘤荧光手术导航具有明确应用前景和重大现实意义。
7.《与用于使肿瘤靶向成像的化合物缀合的氨基酸连接基的合成和组合物》(专利申请号为201380074692.8)，其所申请化合物otl-38的性能是：其荧光发射峰值对应波长793nm，采用蝶酰基缀合物作为靶向配体。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题是提供一种用于肿瘤靶向成像的近红外荧光探针的制备方法与应用，即提供一种用于肿瘤靶向成像的以苯并吲哚七甲川花菁为发光团的荧光探针及其制备方法。
9.本发明的首要目的在于提供一种可用于肿瘤靶向成像的近红外荧光探针。
10.本发明的另一重要目的在于提供新型肿瘤靶向策略。
11.本发明的另一目的在于提供上述靶向荧光探针的制备方法。
12.本发明的再一目的在于提供用于优化荧光染料发光波长的方法，所述荧光染料的激发和发射波长均优化至》800nm，其中发射波长在820-830nm。在实施例中，本发明涉及的荧光染料包含苯并吲哚基七甲川骨架，修饰基团通过哌嗪基与其他基团连接。
13.本发明的其他目的包括提供用于改进荧光染料光学稳定性的方法：通过哌嗪基、酰胺键等连接多支链烷烃和金刚烷等空间体积较大的基团。在一些实施例中，修饰基团的引入不仅增加了染料分子的化学稳定性，也增加了染料分子的空间体积，有效削弱在体液环境中的分子堆积导致的荧光减弱或淬灭现象。
14.本发明的其他目的包括提供染料分子与多肽配体偶联的方法，所述染料分子中羧基先通过活化成为琥珀酰亚胺酯，再与多肽配体的n端通过酰胺键连接。
15.本发明的其他目的包括提供上述荧光分子在制备荧光成像手术导航光敏剂中的应用。
16.本发明所涉及的用于肿瘤靶向成像的化合物，所述化合物可用于研究、诊断、治疗目的。在其他实施方案中，本技术提供包含成像化合物在内的其他组合物，其中其他成分是药学上可应用的载体、掺入物、稀释剂或者无机盐等。
17.为了解决上述技术问题，本发明提供的方案具体如下：
18.本发明提供了一种用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针，命名为eco-xx系列，其化学结构如式(ⅰ)所示：
[0019][0020]
通式中，
[0021]
x是i-、br-或pf
6-；
[0022]
z是k
+
、na
+
、h
+
或nh
4+
；
[0023]
y是多肽序列，选自-ysaypdsvpmms、-ffgysaypdsvpmms或-eeeysaypdsvpmms中的一种，其结构如下：
[0024]
[0025]
n为0-5中的任一整数；
[0026]
r选自以下结构：
[0027][0028]
作为本发明的进一步优选：
[0029]
x是br-或pf
6-；
[0030]
z是k
+
，na
+
；
[0031]
y是多肽序列，选自-ysaypdsvpmms、-ffgysaypdsvpmms或-eeeysaypdsvpmms；
[0032]
n取1；
[0033]
r选自以下结构：
[0034]
作为本发明进一步的优选，根据需要合适的波长范围与荧光亮度对照，在上述荧光团分子筛选出了一系列具有合适波长范围(≥820nm)和较强荧光亮度的荧光团分子，其中具有代表性的为eco-6bc0，eco-6bc2，eco-6bc3，结构式分别为：
[0035][0036]
采用这三种萤光团分子分别都与-ysaypdsvpmms、-ffgysaypdsvpmms、
[0037]-eeeysaypdsvpmms三种多肽结合得到一系列近红外荧光探针，综合对比荧光效果
和动物实验结果，得到其中具有代表性的eco-11，eco-32，eco-70三种荧光探针分子，其结构式分别为：
[0038]
[0039][0040]
本发明的用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针(eco-xx系列荧光分子)的具体制备路线如下：
[0041][0042]
本发明的可用于肿瘤靶向成像的近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0043]
(1)制备化合物1：
[0044]
将1,1,2-三甲基-1h-苯并吲哚-7-磺酸盐和卤代羧酸加入烧瓶中，加入邻二氯苯为溶剂，120-150℃反应15-20h；
[0045]
1,1,2-三甲基-1h-苯并吲哚-7-磺酸盐与3-碘丙酸或5-溴戊酸的摩尔比为1：1.5-4.0；
[0046]
反应所得物进行纯化后得到化合物1；
[0047][0048]
(2)制备化合物2：
[0049]
将化合物1、2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛与醋酸钠加入烧瓶中，加入乙醇，升温50-100℃反应2-10小时；
[0050]
化合物1、2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛与醋酸钠的摩尔比为2：1：2；
[0051]
反应所得物进行纯化后得到化合物2；
[0052]
即，所得的反应液用乙酸乙酯进行沉降，并用柱层析分离得到化合物2；
[0053][0054]
(3)制备化合物3：
[0055]
将化合物2与哌嗪加入烧瓶中，加入溶剂n,n-二甲基甲酰胺与缚酸剂三乙胺，在20-50℃(例如为室温)下搅拌2-5小时；
[0056]
化合物2、哌嗪与三乙胺的摩尔比为1：4：2；
[0057]
反应所得物进行纯化后得到化合物3；
[0058]
即，反应完成后冷却至室温，减压除去溶剂，柱层析分离得到化合物3；
[0059][0060]
(4)制备化合物4：
[0061]
化合物4的制备包括以下两种方式：
[0062]
①
将化合物3与酰氯类化合物加入烧瓶中，加入溶剂n,n-二甲基甲酰胺与缚酸剂三乙胺，在室温下搅拌1-10小时；
[0063]
化合物3、酰氯类化合物与三乙胺的摩尔比为1：3：3；
[0064]
反应所得物进行纯化后得到化合物4；
[0065]
②
将化合物3与卤代烷烃加入烧瓶中，加入溶剂n,n-二甲基甲酰胺与缚酸剂三乙胺，40
±
10℃下搅拌5
±
1小时；
[0066]
化合物3、卤代烷烃与三乙胺的摩尔比为1：10：2；
[0067]
反应所得物进行纯化后得到化合物4；
[0068][0069]
(5)制备化合物5：
[0070]
将化合物4与六氟磷酸钾加入到烧瓶中，并加入溶剂丙酮与甲醇，在室温下搅拌反应2-8小时；
[0071]
化合物4与六氟磷酸钾的摩尔比为1：2；
[0072]
反应所得物进行纯化后得到化合物5；
[0073]
即，反应完成后，将反应液用丙酮进行沉降，过滤得到产物5；
[0074]
该步骤可跳过，即将化合物4直接投入化合物6的合成中。
[0075][0076]
(6)制备化合物eco-xx：
[0077]
将化合物4或化合物5加入到烧瓶中，并用n,n-二甲基甲酰胺溶解，加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)与二环己基碳二亚胺(dcc)，然后在闭光环境下搅拌5-12小时，过滤除去不溶杂质后，在上清液中加入多肽序列-ysaypdsvpmms、-ffgysaypdsvpmms或-eeeysaypdsvpmms中的一种，随后用n,n-二异丙基乙胺(dipea)调节ph至9，保持室温搅拌约10-30小时；
[0078]
化合物5(或化合物4)、n-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺与多肽的摩尔比为1：3：3：3；
[0079]
反应所得物进行纯化后得到用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针产物eco-xx。
[0080]
此步骤，可用高效液相色谱(hplc)分离。
[0081][0082]
作为本发明制备方法的进一步改进：
[0083]
化合物1的合成，1,1,2-三甲基-1h-苯并吲哚-7-磺酸盐的摩尔量与邻二氯苯的体积比为1mmol：(2-6)ml。
[0084]
化合物2的合成中，化合物1的摩尔量与乙醇的体积比为1mmol：(10-30)ml。
[0085]
化合物3的合成中，化合物2的摩尔量与n,n-二甲基甲酰胺的体积比为1mmol：(5-20)ml。
[0086]
化合物4的合成方式
①
中，化合物3的摩尔量与n,n-二甲基甲酰胺的体积比为1mmol：(15-30)ml。
[0087]
化合物4的合成方式
②
中，化合物3的摩尔量与n,n-二甲基甲酰胺的体积比为1mmol：(5-30)ml。
[0088]
化合物5的合成中，化合物4的摩尔量、甲醇的体积与丙酮的体积比为1mmol：(20-30)ml：(50-150)ml。
[0089]
化合物eco-xx的合成中，化合物5(或化合物4)的摩尔量与n,n-二甲基甲酰胺的体积比为1mmol：(150-400)ml。
[0090]
本发明的荧光探针主要由(i)具有近红外发射能力的荧光染料分子(ii)用于靶向
结合受体蛋白的多肽配体两部分组成。荧光染料分子与多肽配体的连接方式为酰胺键，荧光分子提供羧基，多肽配体提供氨基，两者缩合实现偶联。
[0091]
本发明的荧光探针，该化合物具有700nm至900nm的最大吸收和发射。化合物对表达受体蛋白的肿瘤细胞具有高度选择性和强大结合力，可特异性靶向此类肿瘤细胞。该化合物通过体内血液循环，在特定组织富集后，经激发光照射呈现荧光。
[0092]
本发明还同时提供了上述用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针的用途，为以下任一：
[0093]
制备用于测定靶细胞与多肽配体结合力的试剂，所述试剂能够结合靶细胞表达的受体蛋白，所述靶细胞为肿瘤细胞；
[0094]
制备用于患者病灶显影和指导手术切除的试剂，所述试剂能够结合靶细胞表达的受体蛋白，所述靶细胞为肿瘤细胞；
[0095]
制备手术中对患者实施荧光影像导航的试剂，在指定手术区域使用大于700nm的近红外光激发，使其发出荧光，所述疾病为癌症。
[0096]
作为本发明用途的改进：手术中的激发和成像使用带有荧光成像频道的内窥镜、腹腔镜、膀胱镜以及光学导管、红外检测器、显示屏等手术辅助设备或光学成像平台来完成。
[0097]
本发明的eco-xx系列荧光探针分子，与现有技术相比有如下优点和有益效果：
[0098]
(1)通过苯并吲哚七甲川花菁骨架结构的修改与基团的引入，调整优化发射波长≥820nm，不仅高于普遍使用的ir-786等七甲川花菁类荧光染料(780-800nm)，具有更强的组织穿透性，而且匹配针对吲哚菁绿(icg)的目前大部分带有荧光成像频道的手术辅助设备，降低了临床应用中仪器更换改装的成本。
[0099]
(2)在七甲川花菁骨架结构中间引入环己烯刚性桥，使染料分子具有良好的光学与化学稳定性。
[0100]
(3)通过引入哌嗪基连接金刚烷等较大空间体积基团拓展了染料分子的空间体积，抑制了分子堆积，有效削弱在体液环境中由于分子堆积导致的荧光减弱或淬灭现象，保证了较高的体内绝对荧光亮度，使荧光成像边界清晰，信噪比高。
[0101]
(4)促红细胞生成素产生肝细胞(erythropoietin-producing human hepatocellular，eph)受体是受体酪氨酸激酶(rtk)家族中最大的亚家族。eph受体与其配体作为细胞黏附与排斥的关键调节因子，是建立、维持与重塑细胞组织形态的基础，在调控细胞增殖、分化、迁移，胚胎发育与器官形成，神经生长导向等生理过程中起重要作用。epha2作为eph受体家族中一个被广泛研究的重要亚型，可通过信号转导引起肿瘤发生、发展、转移侵袭和血管生成，同时研究证明，在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌和恶性黑色素瘤等多种实体瘤中均可发现epha2的高表达，是极具前景的肿瘤治疗新靶点。染料-配体偶合物通常可由癌细胞epha2受体介导的胞吞作用摄入细胞内，引入针对这些特定癌细胞中高表达的epha2受体蛋白靶向相结合的多肽配体，相比缺乏肿瘤靶向性的吲哚菁绿(icg)和靶向效果欠佳的叶酸-荧光团组合探针，靶向特异性更高，假阳性概率低。
[0102]
本发明可应用于生物体荧光成像与手术导航领域，合成便捷，原料易得，成本相对其他靶向类药物低，具有广泛的应用前景。本发明还包含制备和使用所述化合物的方法和组合物。
[0103]
本发明的近红外荧光探针与otl-38的区别点在于：本发明采用苯并吲哚七甲川花菁为骨架结构，多肽序列为靶向配体，并引入哌嗪基连接金刚烷等较大空间体积基团；本发明的性能优势在于：
①
发射波长≥820nm，具有更强的组织穿透性，且更为匹配针对吲哚菁绿(icg)的目前大部分带有荧光成像频道的手术辅助设备。
②
通过引入哌嗪基连接金刚烷等较大空间体积基团拓展了染料分子的空间体积，抑制了分子堆积，有效削弱在体液环境中由于分子堆积导致的荧光减弱或淬灭现象，保证了较高的体内绝对荧光亮度。
③
引入且可同时连接两条针对特定癌细胞中高表达的epha2受体蛋白靶向相结合的多肽配体，相较叶酸-荧光团组合探针otl-38靶向特异性更高，假阳性概率低。
附图说明
[0104]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0105]
图1为实施例1制备的eco-6bc2的高分辨质谱图；
[0106]
图2为实施例2制备的eco-6bc3的高分辨质谱图；
[0107]
图3为实施例3制备的eco-6bc0的lc-ms质谱图；
[0108]
图4为实施例1制备的eco-70的高分辨质谱图；
[0109]
图5为实施例2制备的eco-11的lc-ms质谱图；
[0110]
图6为实施例3制备的eco-32的lc-ms质谱图；
[0111]
图7为实施例1制备的eco-6bc2的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0112]
图8为实施例2制备的eco-6bc3的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0113]
图9为实施例3制备的eco-6bc0的紫外吸收、荧光发射光谱；
[0114]
图10为eco-70、eco-11荧光探针与各类细胞的结合曲线。
[0115]
图11为pc-3皮下瘤模型成像图；
[0116]
图12为pc-3皮下瘤模型心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图；
[0117]
图13为4t1皮下瘤模型成像图；
[0118]
图14为4t1皮下瘤模型心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图；
[0119]
图15为mc38皮下瘤模型成像图；
[0120]
图16为mc38皮下瘤模型心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图；
[0121]
图17为表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型成像图；
[0122]
图18为表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图；
[0123]
图19为表达a549皮下非小细胞癌模型成像图；
[0124]
图20为施用eco-70的动物的离体组织生物分布。
具体实施方式
[0125]
以下用实施例对本发明较佳的实施方案进行描述。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的改变、简化、修饰、组合、替代，均应为等效的置换方式，均落
在本技术权利要求的范围内。正如上文所提到的在合成了一系列分子后通过波长范围及荧光强度的筛选，本发明优选出了三个化合物：eco-6bc3、eco-6bc0、eco-6bc2，为了进一步评估这三个分子在生物体内的性能，本发明分别将其与多肽结合得到了一系列荧光探针并优选出了性能最优的三个荧光探针分子，分别为eco-11、eco-32、eco-70，其合成步骤如下。
[0126]
实施例1：化合物eco-70的制备，合成路线如下：
[0127][0128]
步骤一，化合物1的合成：
[0129]
向反应瓶中加入5.03g(15.30mmol)1,1,2-三甲基-1h-苯并吲哚-7-磺酸钾与
9.20g(45.9mmol)3-碘丙酸，随后加入50ml邻二氯苯，升温至120℃反应15h。此时已反应完全，直接将反应液在300ml乙酸乙酯中沉降，过滤后所得滤饼为5.64g化合物1(式1，灰色固体)，收率70％。
[0130]
步骤二，化合物2的合成：
[0131]
向反应瓶中加入5.00g(9.48mmol)实施例1中步骤一所得化合物1(式1)、820.21mg(4.74mmol)2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛与777.39mg(9.48mmol)醋酸钠，氮气球保护后加入200ml乙醇，升温90℃反应4h。此时已反应完全，反应液直接过滤，得到4.08g化合物2(式2，绿色固体)，收率81％。
[0132]
步骤三，化合物3的合成：
[0133]
向反应瓶中加入3.33g(3.13mmol)实施例1中步骤二所得化合物2(式2)与1.08g(12.5mmol)哌嗪，氮气球保护后加入30ml n,n-二甲基甲酰胺，室温反应2h。此时已反应完全，减压旋蒸除去n,n-二甲基甲酰胺，所得粗产物进行柱层析(内装200-300目的硅胶约60g)，用800ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
dcm
：v
meoh
＝5：1(dcm为二氯甲烷，meoh为甲醇)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压(以-0.1mpa的压力)旋蒸除去溶剂，最终得2.40g化合物3(式3，蓝色固体)，收率96.5％。
[0134]
步骤四，化合物4的合成：
[0135]
向反应瓶中加入1.68g(1.50mmol)实施例1中步骤三所得化合物3(式3)、895.5mg(4.5mmol)1-金刚烷甲酰氯与454.5mg(4.5mmol)三乙胺，氮气球保护后加入30ml n,n-二甲基甲酰胺，室温反应1h。此时已反应完全，减压旋蒸除去n,n-二甲基甲酰胺，所得粗产物进行柱层析(内装200-300目的硅胶约50g)，用600ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
dcm
：v
meoh
＝5：1(dcm为二氯甲烷，meoh为甲醇)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压(以-0.1mpa的压力)旋蒸除去溶剂，最终得1.55g化合物4(式4，蓝绿色固体)，收率82％。
[0136]
步骤五，化合物eco-6bc2的合成：
[0137]
向反应瓶中加入255.20mg(0.20mmol)实施例1中步骤四所得化合物4(式4)与73.6mg(0.40mmol)六氟磷酸钾，随后加入由25ml丙酮和5ml甲醇组成的混合溶液，室温反应3h。此时已反应完全，减压(以-0.1mpa的压力)旋蒸除去丙酮、甲醇混合溶液，用600ml二氯甲烷进行萃取并用400ml水洗涤有机相，收集有机相并用8g无水硫酸镁干燥过滤，减压(以-0.1mpa的压力)旋蒸除去溶剂后得到206.88mg蓝绿色固体化合物eco-6bc2，收率80％。
[0138]
eco-6bc2的高分辨质谱如图1所示。
[0139]
eco-6bc2的紫外吸收、荧光发射光谱如图7所示，其中荧光发射波长为821nm。
[0140]
步骤六，eco-70的合成：
[0141]
向反应瓶中加入9.95mg(7.7μmol)实施例1中步骤五所得化合物eco-6bc2、2.6mg(23.1μmol)n-羟基琥珀酰亚胺和4.8mg(23.1μmol)二环己基碳二亚胺，随后加入3ml无水n,n-二甲基甲酰胺，闭光反应5h以制备活化的羧基。此时已反应完全，反应液用滤膜(滤径为50mm)除去沉淀，收集上清液，加入31.1mg(23.1μmol)多肽序列-ffgysaypdsvpmms的3ml n,n-二甲基甲酰胺溶液，用n,n-二异丙基乙胺(dipea)调节ph至9，室温反应15h。此时已反应完全，反应液通过高效液相色谱(hplc)纯化，得到19.35mg蓝色固体化合物eco-70，收率54％。
[0142]
所述高效液相色谱(hplc)纯化具体为：使用甲醇(含0.05％的三氟乙酸)与水(含
0.05％的三氟乙酸)作为洗脱液，洗脱梯度依次为70％水+30％甲醇，12min；40％水+60％甲醇，4min；100％甲醇，6min；70％水+30％甲醇，4min。流速为8ml/min，收集保留时间为21.9min的洗脱液放入冰箱冷冻结冰，随后放入冻干机减压升华(-55℃、92pa的压力)为eco-70固体。
[0143]
eco-70的高分辨质谱如图4所示。
[0144]
实施例2：化合物eco-11的制备，合成路线如下：
[0145][0146]
步骤一，化合物5的合成：
[0147]
向反应瓶中加入1.68g(1.50mmol)实施例1中步骤三所得化合物3(式3)、351.02mg(4.50mmol)乙酰氯与454.45mg(4.50mmol)三乙胺，随后加入20ml n,n-二甲基甲酰胺，室温反应1h。此时已反应完全，减压旋蒸除去n,n-二甲基甲酰胺，所得粗产物进行柱层析(内装
200-300目的硅胶约60g)，用750ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
dcm
：v
meoh
＝5：1(dcm为二氯甲烷，meoh为甲醇)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压(以-0.1mpa的压力)旋蒸除去溶剂，最终得1.20g化合物5(式5，蓝绿色固体)，收率70％。
[0148]
步骤二，化合物eco-6bc3的合成：
[0149]
向反应瓶中加入231.02mg(0.20mmol)实施例2中步骤一所得化合物5(式5)与73.6mg(0.40mmol)六氟磷酸钾，随后加入由30ml丙酮和5ml甲醇组成的混合溶液，室温反应3h。此时已反应完全，减压旋蒸除去丙酮、甲醇混合溶液，加入500ml水、600ml二氯甲烷进行萃取，收集有机相并用8g无水硫酸镁干燥过滤，减压(以-0.1mpa的压力)旋蒸除去溶剂后得到199.41mg蓝绿色固体化合物eco-6bc3，收率85％。
[0150]
eco-6bc3的高分辨质谱如图2所示。
[0151]
eco-6bc3的紫外吸收、荧光发射光谱如图8所示，其中荧光发射波长为820nm。
[0152]
步骤三，eco-11的合成：
[0153]
向反应瓶中加入10mg(8.5μmol)实施例2中步骤二所得化合物eco-6bc3、2.69mg(25.5μmol)n-羟基琥珀酰亚胺和5.3mg(25.5μmol)二环己基碳二亚胺，随后加入3ml无水n,n-二甲基甲酰胺，闭光反应5h以制备活化的羧基。此时已反应完全，反应液用滤膜(滤径为50mm)除去沉淀，收集上清液，加入34.3mg(25.5μmol)多肽序列-ysaypdsvpmms的3ml n,n-二甲基甲酰胺溶液，用n,n-二异丙基乙胺(dipea)调节ph至9，室温反应15h。此时已反应完全，反应液通过高效液相色谱(hplc)纯化，得到18.56mg蓝黑色固体化合物eco-11，收率57％。
[0154]
所述高效液相色谱(hplc)纯化具体为：使用甲醇(含0.05％的三氟乙酸)与水(含0.05％的三氟乙酸)作为洗脱液，洗脱梯度依次为70％水+30％甲醇，12min；40％水+60％甲醇，4min；100％甲醇，6min；70％水+30％甲醇，4min。流速为8ml/min，收集保留时间为20.3min的洗脱液放入冰箱冷冻结冰，随后放入冻干机减压升华(-55℃、92pa的压力)为eco-11固体。
[0155]
eco-11的lc-ms质谱如图5所示。
[0156]
实施例3：化合物eco-32的制备，合成路线如下：
[0157][0158]
步骤一，化合物6的合成：
[0159]
向反应瓶中加入5.03g(16.08mmol)1,1,2-三甲基-1h-苯并吲哚-7-磺酸钠与9.20g(60.1mmol)3-溴丙酸，随后加入50ml邻二氯苯，升温120℃反应15h。此时已反应完全，直接将反应液在400ml乙酸乙酯中沉降，过滤后滤饼得到5.59g化合物6(式6，灰绿色固体)，收率75％。
[0160]
步骤二，化合物7的合成：
[0161]
向反应瓶中加入5.00g(10.78mmol)实施例3中步骤一所得化合物6(式6)、932.47mg(5.39mmol)2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛与883.96mg(10.78mmol)醋酸钠，氮气球保护后加入200ml乙醇，升温90℃反应4h。此时已反应完全，直接将反应液过滤，得到3.07g化合物7(式7，绿色固体)，收率58％。
[0162]
步骤三，化合物8的合成：
[0163]
向反应瓶中加入3.33g(3.38mmol)实施例3中步骤二所得化合物7(式7)与1.16g(13.52mmol)哌嗪，氮气球保护后加入30ml n,n-二甲基甲酰胺，室温反应2h。此时已反应完全，减压旋蒸除去n,n-二甲基甲酰胺，所得粗产物进行柱层析(内装200-300目的硅胶约70g)，用600ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
dcm
：v
meoh
＝4：1(dcm为二氯甲烷，meoh为甲醇)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压(以-0.1mpa的压力)旋蒸除去溶剂，最终得1.87g化合物8(式8，蓝色固体)，收率53.4％。
[0164]
步骤四，化合物eco-6bc0的合成：
[0165]
向反应瓶中加入1.50g(1.45mmol)实施例3中步骤三所得化合物8(式8)、2.06g(14.5mmol)碘甲烷与292.90mg(2.9mmol)三乙胺，氮气球保护后加入10ml n,n-二甲基甲酰胺，升温40℃反应5h。此时已反应完全，减压旋蒸除去n,n-二甲基甲酰胺，所得粗产物进行柱层析(内装200-300目的硅胶约50g)，用500ml的洗脱剂进行洗脱，所述洗脱剂由v
dcm
：v
meoh
＝5：1(dcm为二氯甲烷，meoh为甲醇)混合而得，收集全部的洗脱液，对洗脱液进行减压(以-0.1mpa的压力)旋蒸除去溶剂，最终得0.98g蓝黑色固体化合物eco-6bc0，收率65％。
[0166]
eco-6bc0的lc-ms质谱如图3所示。
[0167]
eco-6bc0的紫外吸收、荧光发射光谱如图9所示，其中荧光发射波长为824nm。
[0168]
步骤五，eco-32的合成：
[0169]
向反应瓶中加入10mg(9.54μmol)实施例3中步骤四所得化合物eco-6bc0、3.29mg(28.62μmol)n-羟基琥珀酰亚胺和5.89mg(28.62μmol)二环己基碳二亚胺，随后加入3ml无水n,n-二甲基甲酰胺，闭光反应5h以制备活化的羧基。此时已反应完全，反应液用滤膜(滤径为50mm)除去沉淀，收集上清液，加入50.00mg(28.62μmol)多肽序列-eeeysaypdsvpmms的3ml n,n-二甲基甲酰胺溶液，用n,n-二异丙基乙胺(dipea)调节ph至9，室温反应15h。此时已反应完全，反应液通过高效液相色谱(hplc)纯化，得到27.79mg蓝色固体化合物eco-32，收率65％。
[0170]
所述高效液相色谱(hplc)纯化具体为：使用甲醇(含0.05％的三氟乙酸)与水(含0.05％的三氟乙酸)作为洗脱液，洗脱梯度依次为70％水+30％甲醇，12min；40％水+60％甲醇，4min；100％甲醇，6min；70％水+30％甲醇，4min。流速为8ml/min，收集保留时间为19.3min的洗脱液放入冰箱冷冻结冰，随后放入冻干机减压升华(-55℃、92pa的压力)为eco-32固体。
[0171]
eco-32的lc-ms质谱如图6所示。
[0172]
光学性质测试
[0173]
紫外测定：使用的仪器为岛津uv-1900i紫外光谱仪，待测物浓度为50μm，吸收波长扫描范围：900nm～500nm；记录范围：0abs～2.5abs；扫描速度：高速；数据间隔：0.2nm；记录方式：覆盖。测定结果如图7～图9所示。
[0174]
荧光测定：使用的仪器为岛津rf-6000荧光光谱仪，待测物浓度为10μm，激发波长设定为待测物的最大吸收波长，发射光谱波长范围：730nm～900nm；狭缝宽度(nm)：ex＝5，em＝5；灵敏度：low；数据间隔：1.0nm；扫描速度：2000nm/min；响应时间：自动。测定结果如图7～图9所示。
[0175]
细胞与生物实验
[0176]
为了评估这一系列分子与肿瘤细胞的结合能力，本发明建立细胞实验模型，应用上述靶向近红外荧光探针中具有代表性的eco-11与eco-70进行体外药理学研究，以下用实验例对较佳的实验方案进行描述。eco-32的性能效果略不如eco-11与eco-70，故已筛选。
[0177]
实验1：eco-11与eco-70的体外药理学研究。
[0178]
1.材料与仪器
[0179]
鼠4t1乳腺癌细胞和人平滑肌细胞(smc)购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。细胞在含有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素的dmem培养基中于37℃在含有5％co2的潮湿环境中生长，并定期检查支原体污染。
[0180]
2.实验方法
[0181]
将超表达eph2a的小鼠乳腺癌细胞(4t1)，人前列腺癌细胞(pc-3)，人非小细胞肺癌(a549)，小鼠结肠癌细胞(mc-38)和非超表达eph2a的人平滑肌细胞(smc)分别接种入5个24孔(105个细胞/孔，100μl)培养板，使其在48小时形成单层。将每种细胞所在培养板的孔中已培育消耗的培养基分别用递增浓度(0.1nm-1.5μl)的eco-11测试制品与eco-70测试制品在新鲜培养基(0.6ml)取代，两种测试制品各12孔，在37℃下保温培育1.5h，并用用溶于1％sds水溶液的新鲜培养基(100μl/孔)冲洗细胞冲洗细胞(3
×
0.6ml)以洗脱除去未与细胞结合的荧光染料，随后转移至石英比色皿中，通过使用tecan多功能微孔板检测仪和荧光光度计测定对应荧光染料采用最大激发光得到的最大荧光发射强度，并使用graphpad prism 9绘制两种荧光染料测试制品荧光发射单位与染料浓度关系的示意图，计算得到受体-配体复合物平衡解离常数(kd)。
[0182]
3.实验结果
[0183]
如图10所示，在4t1细胞、pc-3细胞、a549细胞、mc38细胞和对照组平滑肌细胞(smc)实验中，eco-70组相比eco-11组均具有更小的受体-配体复合物平衡解离常数(kd)，表现出显著更强的受体亲和力。
[0184]
为了评估这一系列分子在能否指导肿瘤切除手术，本发明建立动物实验模型，应用上述靶向近红外荧光探针中具有代表性的eco-11与eco-70分别特异性的与几种典型且存在epha2高表达的癌细胞(乳腺癌细胞，前列腺癌细胞，结肠癌细胞，肺癌细胞)进行靶向结合，观察荧光成像分布、代谢与手术导航效果，以下用实验例对较佳的实验方案进行描述。
[0185]
实验2：eco-11与eco-70在移植人前列腺癌细胞(pc-3)皮下瘤的小鼠体内的组织荧光成像与生物分布。
[0186]
1.材料与仪器
[0187]
(1)仪器
[0188]
合成的多肽分子通过lumtech hplc(germany)系统使用c18rp柱分离和纯化，meoh和含有0.1％tfa的水作为洗脱剂。合成产物的结构由lcms-2020(shimadzu系统)联合nmr光
谱(bruker arx 400nmr)确定。紫外可见吸收光谱和荧光光谱分别在岛津uv-1900i紫外光谱仪和岛津rf-6000荧光谱仪上记录。在体内成像系统(xenogen ivis lumina ii系统)上获得荧光和持续发光图像。
[0189]
(2)材料
[0190]
2-氯三苯甲基氯树脂(1.0-1.2mmol/g)和其他fmoc-氨基酸购自gl biochem(中国上海)，o-苯并三唑-n,n,n',n'-四甲基-铝-六氟磷酸盐(hbtu)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，双环己基碳二亚胺(dcc)，硼酸钠和三氟乙酸(tfa)从heowns(中国天津)购买。所有的实验小鼠由北京维通利华实验技术有限公司提供，所有动物实验操作均在动物保护及使用委员会批准下进行。
[0191]
(3)细胞培养
[0192]
鼠4t1乳腺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。细胞在含有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素的dmem培养基中于37℃在含有5％co2的潮湿环境中生长，并定期检查支原体污染。
[0193]
2.实验方法
[0194]
(1)建立pc-3皮下肿瘤模型
[0195]
为了建立荷pc-3皮下肿瘤模型，实验使用健康的雌性balb/c小鼠(18～22g)，在小鼠右侧腋下脱毛处理后，注射50μl的pc-3细胞悬浮液(1x107个细胞)。17天后当肿瘤体积达到约95-116mm2时，开始活体荧光成像实验和生物分布实验。
[0196]
(2)配制注射液
[0197]
通过称重称取eco-70、eco-11、icg固体粉末，溶于pbs缓冲液中，配置成5μmol/l的母液，取部分溶液通过生理盐水稀释配置成50nmol/l的溶液。
[0198]
(3)给药并成像
[0199]
已建立pc-3皮下瘤模型的balb/c小鼠随机分成3组，每组2只，通过尾静脉给药，将配制好的3组同浓度(50nmol/l)的eco-70、eco-11、icg溶液注射到小鼠体内，每只100μl。
[0200]
24小时后，用异氟烷麻醉，使用小动物近红外成像系统(ivis lumina ii)扫描拍摄并分析(ex：800nm、ex：785nm)。在成像过程中，始终给予3％的异氟烷，通过鼻锥系统麻醉小鼠。根据荧光指导，进行皮下瘤切除，随后将小鼠颈椎脱臼法处死，收集心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图片。
[0201]
3.实验结果
[0202]
如图11所示，在pc-3皮下瘤模型荧光成像图中，icg由于缺乏靶向结合力，主要富集在肝脏部位，在肿瘤病灶中几乎观察不到荧光，而eco-70组和eco-11组在病灶部位均有较强的荧光辐射强度，这表明eco-70和eco-11均在pc-3皮下瘤组织出现显著富集，且成像边界清晰。其中eco-70组的平均亮度又高于eco-11组，这表明eco-70与pc-3皮下瘤病灶组织受体靶向结合力强于eco-11，与细胞层面的实验结果一致。导航条件下根据荧光切除肿瘤，术后荧光成像基本无病灶组织残留，说明肿瘤组织几乎已彻底清除。
[0203]
如图12所示，在pc-3皮下瘤模型实验eco-70与eco-11的离体组织生物分布对比图中，除肝脏部位有一定的荧光残留外，只有肿瘤部位呈现较强的荧光，其余组织或器官几乎观测不到荧光或只有极微弱的荧光，可见两者对肿瘤部位均有高度的特异性。eco-70组肝脏部位荧光强度显著低于eco-11组，与此同时，eco-70组分离出的肿瘤组织荧光强度又显
著高于eco-11组，这表明eco-70相比eco-11靶向能力更佳，若将肝脏的荧光强度作为背景荧光，eco-70的成像信噪比将远远高于eco-11。
[0204]
实验3：eco-11与eco-70在移植小鼠乳腺癌细胞(4t1)皮下瘤的小鼠体内的组织荧光成像与生物分布。
[0205]
1.材料与仪器
[0206]
材料与仪器同实验1。
[0207]
2.实验方法
[0208]
(1)建立4t1皮下肿瘤模型
[0209]
为了建立荷4t1皮下肿瘤模型，实验使用健康的雌性balb/c小鼠(18～22g)，在小鼠右侧腋下脱毛处理后，注射50μl的4t1细胞悬浮液(1x107个细胞)。15天后当肿瘤体积达到约89-110mm2时，开始活体荧光成像实验和生物分布实验。
[0210]
(2)配制注射液
[0211]
通过称重称取eco-70、eco-11、icg固体粉末，溶于pbs缓冲液中，配置成5μmol/l的母液，取部分溶液通过生理盐水稀释配置成50nmol/l的溶液。
[0212]
(3)给药并成像
[0213]
已建立4t1皮下瘤模型的balb/c小鼠随机分成3组，每组2只，通过尾静脉给药，将配制好的3组同浓度(50nmol/l)的eco-70、eco-11、icg溶液注射到小鼠体内，每只100μl。
[0214]
24小时后，用异氟烷麻醉，使用小动物近红外成像系统(ivis lumina ii)扫描拍摄并分析(ex：800nm、ex：785nm)。在成像过程中，始终给予3％的异氟烷，通过鼻锥系统麻醉小鼠。根据荧光指导，进行皮下瘤切除，随后将小鼠颈椎脱臼法处死，收集心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图片。
[0215]
3.实验结果
[0216]
如图13所示，在4t1皮下瘤模型荧光成像图中，icg由于缺乏靶向结合力，在肿瘤病灶中几乎观察不到荧光，而eco-70组和eco-11组在病灶部位均呈现较强的荧光，这表明eco-70和eco-11均在4t1皮下瘤组织出现显著富集，且成像边界清晰。其中eco-70组的平均亮度又高于eco-11组，这表明eco-70与4t1皮下瘤组织的靶向结合力强于eco-11，与细胞层面的实验结果相互印证。导航条件下根据荧光切除肿瘤，术后荧光成像基本无病灶组织残留，说明肿瘤组织几乎已彻底清除。
[0217]
如图14所示，在4t1皮下瘤模型实验eco-70与eco-11的离体组织生物分布对比图中，除肝脏部位有一定的荧光残留外，只有肿瘤部位呈现较强的荧光，其余组织或器官几乎观测不到荧光或只有极微弱的荧光，可见两者对肿瘤部位均有高度的特异性。eco-70组肝脏部位荧光强度显著低于eco-11组，与此同时，eco-70组分离出的肿瘤组织荧光强度又显著高于eco-11组，这表明eco-70相比eco-11靶向能力更佳，信噪比更高。
[0218]
实验4：eco-11与eco-70在移植小鼠结肠癌细胞(mc-38)的小鼠体内的组织荧光成像与生物分布。
[0219]
1.材料与仪器
[0220]
材料与仪器同实验1。
[0221]
2.实验方法
[0222]
(1)建立mc-38皮下肿瘤模型
[0223]
为了建立荷mc-38皮下肿瘤模型，实验使用健康的雌性balb/c小鼠(18～22g)，在小鼠右侧腋下脱毛处理后，注射50μl的mc-38细胞悬浮液(1x107个细胞)。15天后当肿瘤体积达到约93-119mm2时，开始活体荧光成像实验和生物分布实验。
[0224]
(2)配制注射液
[0225]
通过称重称取eco-70、eco-11、icg固体粉末，溶于pbs缓冲液中，配置成5μol/l的母液，取部分溶液通过生理盐水稀释配置成50nmol/l的溶液。
[0226]
(3)给药并成像
[0227]
已建立mc-38皮下瘤模型的balb/c小鼠随机分成3组，每组2只，通过尾静脉给药，将配制好的3组同浓度(50nmol/l)的eco-70、eco-11、icg溶液注射到小鼠体内，每只100μl。
[0228]
24小时后，用异氟烷麻醉，使用小动物近红外成像系统(ivis lumina ii)扫描拍摄并分析(ex：800nm、ex：785nm)。在成像过程中，始终给予3％的异氟烷，通过鼻锥系统麻醉小鼠。根据荧光指导，进行皮下瘤切除，随后将小鼠颈椎脱臼法处死，收集心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图片。
[0229]
3.实验结果
[0230]
如图15所示，在mc38皮下瘤模型荧光成像图中，icg由于缺乏靶向结合力，在肿瘤病灶中几乎观察不到荧光，而eco-70组和eco-11组在病灶部位均呈现较强的荧光，这表明eco-70和eco-11均体现出与mc38皮下瘤组织出现显著富集，且成像边界清晰，适于手术导航。其中eco-70组的平均辐射亮度又高于eco-11组，这表明eco-70靶向能力和成像信噪比优于eco-11。导航条件下根据荧光切除肿瘤，说明肿瘤组织几乎已彻底清除。
[0231]
如图16所示，在mc38皮下瘤模型实验eco-70与eco-11的离体组织生物分布对比图中，除肝脏部位有一定的荧光残留外，只有肿瘤部位呈现较强的荧光，其余组织或器官几乎观测不到荧光或只有极微弱的荧光，可见两者对肿瘤部位均有高度的特异性。eco-70组分离出的肿瘤组织荧光强度又显著高于eco-11组，同样证明了eco-70相比eco-11靶向能力更佳，信噪比更高。
[0232]
实验5：eco-11与eco-70在移植表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤的小鼠体内的组织荧光成像与生物分布。
[0233]
1.材料与仪器
[0234]
材料与仪器同实验1。
[0235]
2.实验方法
[0236]
(1)建立表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型
[0237]
为了建立荷表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型，实验使用健康的雌性balb/c小鼠(18～22g)，给予小鼠腹腔注射100μl的表达萤火虫素酶的4t1细胞悬浮液(3x105个细胞)。第7天先腹腔注射150mg/ml的萤火虫素酶底物100μl后再开始活体荧光成像实验和生物分布实验。
[0238]
(2)配制注射液
[0239]
通过称重称取eco-70、eco-11、icg固体粉末，溶于pbs缓冲液中，配置成5μmol/l的母液，取部分溶液通过生理盐水稀释配置成50nmol/l的溶液。
[0240]
(3)给药并成像
[0241]
已建立表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型的balb/c小鼠随机分成3组，每组2
只，通过尾静脉给药，将配制好的3组同浓度(50nmol/l)的eco-70、eco-11、icg溶液注射到小鼠体内，每只100μl。
[0242]
24小时后，注射150mg/ml的萤火虫素酶底物100μl，全程麻醉下打开腹腔，使用ivis lumina ii小动物活体成像仪进行观察，判断探针荧光信号能否准确对应表达萤火虫素酶的4t1肿瘤生物自发光所产生的信号，从而检测化合物的荧光信号对肿瘤识别的准确性。随后，借助荧光的导航性能，手术清除肿瘤，与裸眼手术清除肿瘤进行比较，验证探针导航对于小于5mm的肿瘤的有效识别率，所清除的肿瘤通过ivis lumina ii生物自发光成像来判断是否清除的即为肿瘤组织。随后将小鼠颈椎脱臼法处死，收集心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图片。
[0243]
3.实验结果
[0244]
如图17所示，在表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型荧光成像图中，icg由于缺乏靶向结合力，部分残留在肝脏部位，在肿瘤病灶中几乎观察不到荧光，而eco-70组和eco-11组在病灶部位均呈现较强的激发荧光，同时与肿瘤细胞的自发荧光基本吻合，这表明eco-70和eco-11均可特异性靶向肿瘤组织，而非正常组织。相比而言，eco-70组激发荧光与自发荧光的重合程度又显著高于eco-11，表明eco-70相比eco-11具有更佳的靶向能力，靶向更精准。导航条件下根据荧光切除肿瘤(除肝脏有一定荧光)，术后荧光成像基本无病灶组织残留，说明肿瘤组织几乎已彻底清楚。
[0245]
如图18所示，在表达萤火虫素酶的4t1腹腔转移瘤模型实验eco-70与eco-11的离体组织生物分布对比图中，除肝脏部位有一定的荧光残留外，只有肿瘤部位呈现较强的荧光，其余组织或器官几乎观测不到荧光或只有极微弱的荧光(肾脏)，可见两者对肿瘤部位均有高度的特异性。此外，从动物体分离的肿瘤组织中，激发荧光与自发荧光都能完全对应重合，进一步验证了靶向的准确性。
[0246]
实验6：eco-11与eco-70在移植人非小细胞肺癌(a549)皮下瘤的小鼠体内的组织荧光成像与生物分布。
[0247]
1.材料与仪器
[0248]
材料与仪器同实验1。
[0249]
2.实验方法
[0250]
(1)建立a549皮下肿瘤模型
[0251]
为了建立荷a549皮下肿瘤模型，实验使用健康的雌性balb/c小鼠(18～22g)，在小鼠右侧腋下脱毛处理后，注射50μl的a549细胞悬浮液(1x107个细胞)。18天后当肿瘤体积达到约95-196mm2时，开始活体荧光成像实验和生物分布实验。
[0252]
(2)配制注射液
[0253]
通过称重称取eco-70、eco-11、icg固体粉末，溶于pbs缓冲液中，配置成5μmol/l的母液，取部分溶液通过生理盐水稀释配置成50nmol/l的溶液。
[0254]
(3)给药并成像
[0255]
已建立a549皮下瘤模型的balb/c小鼠随机分成3组，每组2只，通过尾静脉给药，将配制好的3组同浓度(50nmol/l)的eco-70、eco-11、icg溶液注射到小鼠体内，每只100μl。
[0256]
24小时后，用异氟烷麻醉，使用小动物近红外成像系统(ivis lumina ii)扫描拍摄并分析(ex：800nm、ex：785nm)。在成像过程中，始终给予3％的异氟烷，通过鼻锥系统麻醉
小鼠。根据荧光指导，进行皮下瘤切除，随后将小鼠颈椎脱臼法处死，收集心、肝、脾、肺、肾，清洗后通过ivis lumina ii成像系统获取荧光图片。
[0257]
3.实验结果
[0258]
如图19所示，在a549皮下瘤模型荧光成像图中，icg由于缺乏靶向结合力，主要富集在肝脏部位，在肿瘤病灶中荧光强度很低，而eco-70组和eco-11组在病灶部位均比icg组表现出显著更强的平均辐射亮度，这表明eco-70和eco-11均体现出与a549皮下瘤病灶组织受体显著的靶向结合力。其中eco-70组的平均辐射亮度又高于eco-11组，这表明eco-70与a549皮下瘤病灶组织受体靶向结合力强于eco-11。
[0259]
如图20所示：在a549皮下瘤模型实验eco-70的离体组织生物分布对比图中，只有肿瘤部位呈现较强的荧光，其余组织或器官几乎观测不到荧光，可见eco-70对肿瘤部位均有高度的特异性。
[0260]
总体结果
[0261]
eco-70与eco-11在注射24小时后在肿瘤部位均有显著富集，eco-70富集更为显著。icg在肿瘤部位未见富集。表明eco-70与eco-11优选化合物对epha2阳性肿瘤均具有靶向性，均可应用于肿瘤近红外光学成像，其中化合物eco-70对肿瘤细胞的结合力更强，靶向效率更高，边界更为清晰，肿瘤成像更加精准。
[0262]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

技术特征：
1.用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针，其特征在于：主要由具有近红外发射能力的荧光染料分子和用于靶向结合受体蛋白的多肽配体两部分组成。2.根据权利要求1所述的用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针，其特征在于：荧光染料分子与多肽配体的连接方式为酰胺键，荧光分子提供羧基，多肽配体提供氨基，两者缩合实现偶联。3.一种用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针，其特征在于，其化学结构如式(ⅰ)所示：通式中，x是i-、br-或pf
6-；z是k
+
、na
+
、h
+
或nh
4+
；y是多肽序列，选自-ysaypdsvpmms、-ffgysaypdsvpmms或-eeeysaypdsvpmms；n为0-5中的任一整数；r选自以下结构：4.根据权利要求3所述的用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针，其特征在于为以下任一：
5.如权利要求1～4任一所述的用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备化合物1：将1,1,2-三甲基-1h-苯并吲哚-7-磺酸盐和卤代羧酸加入容器中，加入溶剂，120-150℃反应15-20h后，反应所得物经后处理，得到化合物1；
(2)将化合物1、2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛与醋酸钠加入容器中，加入乙醇，升温50-100℃反应2-10小时，反应所得物经后处理，得到化合物2；(3)将化合物2与哌嗪加入容器中，加入溶剂n,n-二甲基甲酰胺与缚酸剂三乙胺，在20-50℃下搅拌2-5小时，反应所得物经后处理，得到化合物3；(4)利用化合物3制备化合物4；(5)将化合物4与六氟磷酸钾加入到容器中，并加入溶剂丙酮与甲醇，室温搅拌反应2-8小时，反应所得物经后处理，得到产物5；
(6)将化合物5或者化合物4加入到容器中，并用n,n-二甲基甲酰胺溶解，加入n-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺，然后在避光环境下搅拌5-12小时，过滤除去不溶杂质后，在上清液中加入多肽序列-ysaypdsvpmms、-ffgysaypdsvpmms或
–
eeeysaypdsvpmms中的一种，随后用n,n-二异丙基乙胺调节ph至9，保持室温搅拌10-30小时，经后处理，得到产物eco-xx。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)为以下任一：方式一、将化合物3与酰氯类化合物加入容器中，加入溶剂n,n-二甲基甲酰胺与缚酸剂三乙胺，在室温下搅拌1-10小时；反应所得物进行后处理，得到化合物4；方式二、将化合物3与卤代烷烃加入容器中，加入溶剂n,n-二甲基甲酰胺与缚酸剂三乙胺，40
±
10℃下搅拌5
±
1小时；反应所得物进行后处理，得到化合物4。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)的化合物1的合成中，1,1,2-三甲基-1h-苯并吲哚-7-磺酸盐与卤代羧酸的摩尔比为1：1.5-4.0；步骤(2)的化合物2的合成中，化合物1、2-氯-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯-1-甲醛与醋酸钠的摩尔比为2：1：2；步骤(3)的化合物3的合成中，化合物2、哌嗪与三乙胺的摩尔比为1：4：2；步骤(4)的方式一中：化合物3、酰氯类化合物与三乙胺的摩尔比为1：3：3；步骤(4)的方式二中：化合物3、卤代烷烃与三乙胺的摩尔比为1：10：2。8.根据权利要求5～7任一所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的溶剂为邻二氯苯。9.如权利要求1～4任一所述的用于肿瘤靶向成像的苯并吲哚七甲川花菁荧光探针的用途，其特征在于为以下任一：制备用于测定靶细胞与多肽配体结合力的试剂，所述试剂能够结合靶细胞表达的受体蛋白，所述靶细胞为肿瘤细胞；制备用于患者病灶显影和指导手术切除的试剂，所述试剂能够结合靶细胞表达的受体蛋白，所述靶细胞为肿瘤细胞；制备手术中对患者实施荧光影像导航的试剂，在指定手术区域使用大于700nm的近红外光激发，使其发出荧光，所述疾病为癌症。10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：手术中的激发和成像使用带有荧光成像频道的内窥镜、腹腔镜、膀胱镜以及光学导管、红外检测器、显示屏等手术辅助设备或光学成像平台来完成。

技术总结
本发明属于生物成像与抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种用于肿瘤靶向成像的荧光探针及其制备方法。本发明公开了一种用于肿瘤靶向成像的以苯并吲哚七甲川花菁为发光团的荧光探针，主要由具有近红外发射能力的荧光染料分子和用于靶向结合受体蛋白的多肽配体两部分组成。荧光染料分子与多肽配体的连接方式为酰胺键，荧光分子提供羧基，多肽配体提供氨基，两者缩合实现偶联。本发明可应用于生物体荧光成像与手术导航领域，合成便捷，原料易得，成本相对其他靶向类药物低，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。


技术研发人员：宋哲刚 斯云 张焕民 金健飞 骆晨希
受保护的技术使用者：浙江义氪生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/8/9