昆明假单胞菌及其应用

1.本发明涉及环保型生物采矿技术领域，具体涉及昆明假单胞菌及其应用。


背景技术：

2.稀土元素(rees)具有特殊的电子组态，特别是未充满并受到外层屏蔽的4f5d电子壳层使其包含丰富的电子能级，在成键能力、光学性质上表现出重要特性。因此，稀土对于国家安全和经济建设具有高度重要的战略意义，是重要的战略资源，也是不可再生的稀缺资源。高纯稀土是研究开发高新技术材料的核心原料，广泛应用于激光雷达、潜艇轴承、涡轮叶片、涡轮盘、风洞测温、永磁电机、等重大领域。而传统的化学法产生的富稀土尾矿一直没有得到有效利用，导致了稀土资源的严重流失和浪费。因此，为了满足绿色化学和资源可持续利用的需求，开发清洁高效的稀土分离利用新技术，以求在保证稀土元素利用率的同时尽可能减少对环境的污染，是目前稀土行业的研究重点，具有十分重大的应用价值和现实意义。
3.随着对微生物研究的不断深入，微生物与多种金属间的相互作用也被广泛报道和关注，多种土壤微生物因其特殊的金属离子吸附功能，被用于包括生物采矿、含金属废水的处理回收等领域。如野生型和基因工程微生物已被用于在温和、环境友好条件下的无机纳米材料的生物合成。目前已有报道，大肠埃希菌(escherichia coli)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)等微生物能够生物合成镧系纳米材料。但目前为止，缺乏对各种稀土离子具有较强吸附能力的新菌种。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了昆明假单胞菌及其应用。
5.本发明提供了昆明假单胞菌及其应用。本发明提供一株可通过胞外矿化稀土磷酸盐晶体回收稀土离子的昆明假单胞菌新菌株，并对该菌株进行基因改造，能够为稀土生物采矿、富稀土尾矿利用和稀土纳米颗粒生物合成提供新的选择和途径。本发明所提供的菌株培养成本低、生长速度快、吸附条件简单，且对多种稀土离子均有吸附能力，其在稀土微生物采矿、尾矿利用等方面具有较好的应用前景。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21，其保藏编号为cgmcc no.26447。
8.在本发明的一些具体实施方案中，所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21使用形式包括活菌、灭活菌体、发酵液、外泌体或代谢产物中的一种或多种。
9.本发明还提供了重组菌株的制备方法，基于所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21，通过表达如下任意项获得重组菌株：
10.(i)、分子伴侣degp、skp或sura的编码基因；和/或
11.(ii)、多磷酸激酶2的编码基因和p_mxaf强启动子。
12.在上述研究的基础上，本发明还提供了所述制备方法制得的重组菌株。
13.本发明还提供了微生物菌剂，包括如下任意项以及可接受的辅料和/或助剂：
14.(i)、所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或
15.(ii)、所述重组菌株。
16.本发明还提供了如下任意项在回收稀土离子中的应用：
17.(i)、所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或
18.(ii)、所述重组菌株；和/或
19.(ⅲ)、所述微生物菌剂。
20.在本发明的一些具体实施方案中，所述回收稀土离子的方式包括胞外矿化纳米级稀土磷酸盐或微米级稀土磷酸盐。
21.本发明还提供了如下任意项在生物采矿和/或尾矿的开发利用中应用：
22.(i)、所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或
23.(ii)、所述重组菌株；和/或
24.(ⅲ)、所述微生物菌剂。
25.在本发明的一些具体实施方案中，所述生物采矿和/或尾矿的开发利用通过提高所述重组菌株对轻稀土的吸附量以及矿化能力实现。
26.本发明还提供了如下任意项在制备稀土纳米级颗粒或微米级颗粒中的应用：
27.(i)、所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或
28.(ii)、所述重组菌株；和/或
29.(ⅲ)、所述微生物菌剂。
30.本发明还提供了如下任意项在提高稀土磷酸盐矿化物产量中的应用：
31.(i)、所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或
32.(ii)、所述重组菌株；和/或
33.(ⅲ)、所述微生物菌剂。
34.本发明还提供了如下任意项在增强特异性吸附稀土离子能力中的应用：
35.(i)、所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或
36.(ii)、所述重组菌株；和/或
37.(ⅲ)、所述微生物菌剂。
38.本发明还提供了回收稀土离子的方法，基于如下任意项回收：
39.(i)、所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或
40.(ii)、所述重组菌株；和/或
41.(ⅲ)、所述微生物菌剂。
42.在本发明的一些具体实施方案中，所述方法，基于如下任意项与稀土溶液混合吸附：
43.(i)、所述昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或
44.(ii)、所述重组菌株；和/或
45.(ⅲ)、所述微生物菌剂。
46.在本发明的一些具体实施方案中，回收稀土离子的方法，包括挑取所述昆明假单
胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21或所述重组菌株至lb液体培养基中过夜培养作为种子液；1％接种至lb液体培养基中培养至对数期；离心收集菌体，用无菌超纯水洗涤；将洗涤后的菌体加入至稀土溶液中吸附；收集菌体，用超纯水洗涤。
47.在本发明的一些具体实施方案中，所述培养条件为30℃，200rpm；
48.所述离心转速为8000rpm，时间为5min；
49.所述吸附条件为30℃，200rpm。
50.在本发明的一些具体实施方案中，所述稀土溶液包括十四种混合稀土溶液、la,sm混合稀土溶液；所述稀土溶液的体积为100ml。
51.本发明提供了一种通过细胞壁和细胞外聚合物(eps)的高分子聚合物(如蛋白质和多糖等)，能够在胞外吸附稀土离子并矿化产生纳米或微米级稀土盐的昆明假单胞菌，该菌株筛选于包钢选矿厂尾矿坝河床沉积泥，通过对该菌株的底盘改造，提高菌株对轻稀土的吸附量以及矿化能力，从而实现昆明假单胞菌对轻稀土的特异性吸附和矿化，能够应用于稀土矿及尾矿的开发利用，实现稀土产业的绿色可持续发展。
52.生物保藏说明
53.生物材料tr-21，分类命名:昆明假单胞菌pseudomonas kunmingensis，于2023年01月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.26447。
附图说明
54.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
55.图1示实施例1中tr-21菌株的系统发育树；
56.图2示实施例3中tr-21菌株矿化不同稀土离子的透射电镜图；
57.图3示实施例3中tr-21菌株矿化la(ⅲ)和sm(ⅲ)混合物的透射电镜图；其中，a示tr-21没有吸附稀土时细菌细胞的形态；b示吸附2h后稀土纳米颗粒的大小和形态；c示吸附19h后稀土纳米颗粒的大小和形态；d示吸附150h后稀土纳米颗粒的大小和形态；e示吸附720h后稀土纳米颗粒的大小和形态；f示稀土纳米颗粒的选区电子衍射图；g示稀土纳米颗粒的晶格条纹；h示稀土纳米粒子区域的元素；
58.图4示实施例3中tr-21菌株矿化la(ⅲ)和sm(ⅲ)混合物的扫描电镜图；其中，a示tr-21没有吸附稀土时细菌细胞表面情况；b示tr-21与la和sm相互作用360h后细菌细胞表面情况；
59.图5示实施例4中对工程化tr-21菌株表达的分子伴侣sura进行sds-page检测；
60.图6示实施例5中对工程化tr-21菌株表达的多磷酸激酶2和p_mxaf强启动子进行sds-page检测。
具体实施方式
61.本发明公开了昆明假单胞菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行
了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
62.为解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种通过细胞壁和细胞外聚合物(eps)的高分子聚合物(如蛋白质和多糖等)，能够在胞外吸附稀土离子并矿化产生纳米或微米级稀土盐的昆明假单胞菌，该菌株筛选于包钢选矿厂尾矿坝河床沉积泥，通过对该菌株的底盘改造，提高菌株对轻稀土的吸附量以及矿化能力，从而实现昆明假单胞菌对轻稀土的特异性吸附和矿化，能够应用于稀土矿及尾矿的开发利用，实现稀土产业的绿色可持续发展。
63.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
64.(1)一株昆明假单胞菌(p.kunmingensis)tr-21通过luria-bertani(lb)培养基分离于内蒙古自治区包头市包钢选矿厂尾矿坝河床沉积泥，于2023年01月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.26447，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
65.(2)将tr-21在液体lb培养基中培养至对数期(培养温度为28℃)，8000rpm离心5min收集菌体沉淀，用超纯水洗涤3次。
66.(3)将洗涤后的tr-21置于超纯水配制的十四种稀土混合溶液(除钷、钪、钇)中进行孵育(孵育温度为28℃，孵育时间为2h)，用于水相溶液中稀土离子的吸附及胞外生物矿化，8000rpm离心5min，得到负载稀土离子的细胞菌体。
67.(4)通过icp-oes检测tr-21对稀土离子的吸附能力，再通过tem-eds观察tr-21对稀土离子的胞外矿化能力。
68.(5)构建工程菌株，对tr-21进行改造。在载体质粒中插入目的基因片段，将获得的重组质粒转化导入tr-21中。通过在tr-21中表达该目的基因，上调相关蛋白质的表达水平。提高tr-21对稀土离子的吸附能力和稀土磷酸盐矿化产量，或增强tr-21对某些稀土离子(如轻稀土元素lree)的特异性吸附，有选择性地矿化并回收某些稀土离子。
69.本发明所提供的菌株培养成本低、生长速度快、吸附条件简单，且对多种稀土离子均有吸附能力，其在稀土微生物采矿、尾矿利用等方面具有较好的应用前景。
70.本发明所用序列如下：
71.seq id no.1：27f:5'-agrgtttgatyntggctcag-3'
72.seq id no.2：1492r:5'-tasgghtaccttgttasgactt-3'
73.载体质粒pcm62(seq id no.3)：
74.gaccctttccgacgctcaccgggctggttgccctcgccgctgggctggcggccgtctatggccctgcaaacgcgccagaaacgccgtcgaagccgtgtgcgagacaccgcggccgccggcgttgtggatacctcgcggaaaacttggccctcactgacagatgaggggcggacgttgacacttgaggggccgactcacccggcgcggcgttgacagatgaggggcaggctcgatttcggccggcgacgtggagctggccagcctcgcaaatcggcgaaaacgcctgattttacgcgagtttcccacagatgatgtggacaagcctggggataagtgccctgcggtattgacacttgaggggcgcgactactgacagatgaggggcgcgatccttgacacttgaggggcagagtgctgacagatgaggggcgcacctattgacatttgaggggctgtccacaggcagaaaatccagcatttgcaagggtttccgcccgtttttcggccaccgctaacctgtcttttaacctgcttttaaaccaatatttataaaccttgtttttaaccagggctgcgccctgtgcgcgtgaccgcgcacgc
cgaaggggggtgcccccccttctcgaaccctcccggcccgctaacgcgggcctcccatccccccaggggctgcgcccctcggccgcgaacggcctcaccccaaaaatggcagccaagctgaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagcaccctttctcggtccttcaacgttcctgacaacgagcctccttttcgccaatccatcgacaatcaccgcgagtccctgctcgaacgctgcgtccggaccggcttcgtcgaaggcgtctatcgcggcccgcaacagcggcgagagcggagcctgttcaacggtgccgccgcgctcgccggcatcgctgtcgccggcctgctcctcaagcacggccccaacagtgaagtagctgattgtcatcagcgcattgacggcgtccccggccgaaaaacccgcctcgcagaggaagcgaagctgcgcgtcggccgtttccatctgcggtgcgcccggtcgcgtgccggcatggatgcgcgcgccatcgcggtaggcgagcagcgcctgcctgaagctgcgggcattcccgatcagaaatgagcgccagtcgtcgtcggctctcggcaccgaatgcgtatgattctccgccagcatggcttcggccagtgcgtcgagcagcgcccgcttgttcctgaagtgccagtaaagcgccggctgctgaacccccaaccgttccgccagtttgcgtgtcgtcagaccgtctacgccgacctcgttcaacaggtccagggcggcacggatcactgtattcggctgcaactttgtcatgattgacactttatcactgataaacataatatgtccaccaacttatcagtgataaagaatccgcgcgttcaatcggaccagcggaggctggtccggaggccagacgtgaaacccaacatacccctgatcgtaattctgagcactgtcgcgctcgacgctgtcggcatcggcctgattatgccggtgctgccgggcctcctgcgcgatctggttcactcgaacgacgtcaccgcccactatggcattctgctggcgctgtatgcgttggtgcaatttgcctgcgcacctgtgctgggc
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gtctggaaggcagtacaccttgataggtgggctgcccttcctggttggcttggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccggctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaaggatggatataccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaagatccgtc
75.载体质粒pcm66(seq id no.4)：
76.gaccctttccgacgctcaccgggctggttgccctcgccgctgggctggcggccgtctatggccctgcaaacgcgccagaaacgccgtcgaagccgtgtgcgagacaccgcggccgccggcgttgtggatacctcgcggaaaacttggccctcactgacagatgaggggcggacgttgacacttgaggggccgactcacccggcgcggcgttgacagatgaggggcaggctcgatttcggccggcgacgtggagctggccagcctcgcaaatcggcgaaaacgcctgattttacgcgagtttcccacagatgatgtggacaagcctggggataagtgccctgcggtattgacacttgaggggcgcgactactgacagatgaggggcgcgatccttgacacttgaggggcagagtgctgacagatgaggggcgcacctattgacatttgaggggctgtccacaggcagaaaatccagcatttgcaagggtttccgcccgtttttcggccaccgctaacctgtcttttaacctgcttttaaaccaatatttataaaccttgtttttaaccagggctgcgccctgtgcgcgtgaccgcgcacgccgaaggggggtgcccccccttctcgaaccctcccggcccgctaacgcgggcctcccatccccccaggggctgcgcccctcggccgcgaacggcctcaccccaaaaatggcagccaagctgaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgt
gaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagcaccctttctcggtccttcaacgttcctgacaacgagcctccttttcgccaatccatcgacaatcaccgcgagtccctgctcgaacgctgcgtccggaccggcttcgtcgaaggcgtctatcgcggcccgcaacagcggcgagagcggagcctgttcaacggtgccgccgcgctcgccggcatcgctgtcgccggcctgctcctcaagcacggccccaacagtgaagtagctgattgtcatcagcgcattgacggcgtccccggccgaaaaacccgcctcgcagaggaagcgaagctgcgcgtcggccgtttccatctgcggtgcgcccggtcgcgtgccggcatggatgcgcgcgccatcgcggtaggcgagcagcgcctgcctgaagctgcgggcattcccgatcagaaatgagcgccagtcgtcgtcggctctcggcaccgaatgcgtatgattctccgccagcatggcttcggccagtgcgtcgagcagcgcccgcttgttcctgaagtgccagtaaagcgccggctgctgaacccccaaccgttccgccagtttgcgtgtcgtcagaccgtctacgccgacctcgttcaacaggtccagggcggcacggatcactgtattcggctgcaactttgtcatgattgacactttatcactgataaacataatatgtccaccaacttatcagtgataaagaatccgcgcgttcaatcggaccagcggaggctggtccggaggccagacgtgaaacccaacatacccctgatcgtaattctgagcactgtcgcgctcgacgctgtcggcatcggcctgattatgccggtgctgccgggcctcctgcgcgatctggttcactcgaacgacgtcaccgcccactatggcattctgctggcgctgtatgcgttggtgcaatttgcctgcgcacctgtgctgggcgcgctgtcggatcgtttcgggcggcggccaatcttgctcgtctcgctggccggcgccactgtcgactacgccatcatggcgacagcgcctttcctttgggttctctatatcgggcggatcgtggccggcatcaccggggcgactggggcggtagccggcgcttatattgccgatgacctgcaggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttcccccccccccctgcaggtccgacacggggatggatggcgttcccgatcatggtcctgcttgcttcgggtggcatcggaatgccggcgctgcaagcaatgttgtccaggcaggtggatgaggaacgtcaggggcagctgcaaggctcactggcggcgctcaccagcctgacctcgatcgtcggacccctcctcttcacggcgatctatgcggcttctataacaacgtggaacgggtgggcatggattgcaggcgctgccctctacttgctctgcctgccggcgctgcgtcgcgggctttggagcggcgcagggcaacgagccgatcgctgatcgtggaaacgataggcctatgccatgcgggtcaaggcgacttccggcaagctatacgcgccctagaattgtcaattttaatcctctgtttatcggcagttcgtagagcgcgccgtgcgtcccgagcgatactgagcgaagcaagtgcgtcgagcagtgcccg
cttgttcctgaaatgccagtaaagcgctggctgctgaacccccagccggaactgaccccacaaggccctagcgtttgcaatgcaccaggtcatcattgacccaggcgtgttccaccaggccgctgcctcgcaactcttcgcaggcttcgccgacctgctcgcgccacttcttcacgcgggtggaatccgatccgcacatgaggcggaaggtttccagcttgagcgggtacggctcccggtgcgagctgaaatagtcgaacatccgtcgggccgtcggcgacagcttgcggtacttctcccatatgaatttcgtgtagtggtcgccagcaaacagcacgacgatttcctcgtcgatcaggacctggcaacgggacgttttcttgccacggtccaggacgcggaagcggtgcagcagcgacaccgattccaggtgcccaacgcggtcggacgtgaagcccatcgccgtcgcctgtaggcgcgacaggcattcctcggccttcgtgtaataccggccattgatcgaccagcccaggtcctggcaaagctcgtagaacgtgaaggtgatcggctcgccgataggggtgcgcttcgcgtactccaacacctgctgccacaccagttcgtcatcgtcggcccgcagctcgacgccggtgtaggtgatcttcacgtccttgttgacgtggaaaatgaccttgttttgcagcgcctcgcgcgggattttcttgttgcgcgtggtgaacagggcagagcgggccgtgtcgtttggcatcgctcgcatcgtgtccggccacggcgcaatatcgaacaaggaaagctgcatttccttgatctgctgcttcgtgtgtttcagcaacgcggcctgcttggcctcgctgacctgttttgccaggtcctcgccggcggtttttcgcttcttggtcgtcatagttcctcgcgtgtcgatggtcatcgacttcgccaaacctgccgcctcctgttcgagacgacgcgaacgctccacggcggccgatggcgcgggcagggcagggggagccagttgcacgctgtcgcgctcgatcttggccgtagcttgctggaccatcgagccgacggactggaaggtttcgcggggcgcacgcatgacggtgcggcttgcgatggtttcggcatcctcggcggaaaaccccgcgtcgatcagttcttgcctgtatgccttccggtcaaacgtccgattcattcaccctccttgcgggattgccccgactcacgccggggcaatgtgcccttattcctgatttgacccgcctggtgccttggtgtccagataatccaccttatcggcaatgaagtcggtcccgtagaccgtctggccgtccttctcgtacttggtattccgaatcttgccctgcacgaataccagctccgcgaagtcgctcttcttgatggagcgcatggggacgtgcttggcaatcacgcgcaccccccggccgttttagcggctaaaaaagtcatggctctgccctcgggcggaccacgcccatcatgaccttgccaagctcgtcctgcttctcttcgatcttcgccagcagggcgaggatcgtggcatcaccgaaccgcgccgtgcgcgggtcgtcggtgagccagagtttcagcaggccgcccaggcggcccaggtcgccattgatgcgggccagctcgcggacgtgctcatagtccacgacgcccgtgattttgtagccctggccgacggccagcaggtaggcctacaggctcatgccggccgccgccgccttttcctcaatcgctcttcgttcgtctggaaggcagtacaccttgataggtgggctgcccttcctggttggcttggtttcatcagccatccgcttgccctcatctgttacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcaggattcccgttgagcaccgccaggtgcgaataagggacagtgaagaaggaacacccgctcgcgggtgggcctacttcacctatcctgcccggctgacgccgttggatacaccaaggaaagtctacacgaaccctttggcaaaatcctgtatatcgtgcgaaaaaggatggatataccgaaaaaatcgctataatgaccccgaagcagggttatgcagcggaaaagatccgtc
77.p_mxaf强启动子的基因序列(seq id no.5)：
78.agggatgaggccgatcatctctcccccttggttcccccgccgggcgctcatcctgagatacttttggccctgcttgggttacccctcgccgctgtagggtacgctgtgcgtacctttccaacccccgatggtacgcacagcgcaccctacagttaaaaaaaggaacttttcccgactcacacggaaaagccatatacaggaatttttcttttcgatttttcggattttttcctagccgaattacaggtttattccgtaacgcccgcctctcccgctcggctaccatgtcgcttgctcggatccgcgcttcggtacccctgtgaacgttttgatcaagaaggccgaatccaattttaccgaggcgccggatccaggcttttcaaattcagccaataaagacaacccttggagggggaattt
79.本发明提供的昆明假单胞菌及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
80.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
81.实施例1：pseudomonas kunmingensis tr-21菌株的分离与鉴定
82.(1)菌株的分离
83.取1g保存于-20℃冰箱中的内蒙古自治区包头市包钢选矿厂尾矿坝河床沉积泥，用10ml无菌pbs缓冲液重悬。在超净工作台中使用接种环，采用四区划线法将样品重悬溶液涂布于lb固体培养基，30℃恒温培养。连续观察10天，将形态特征不同的单菌落用接种环接种到新的lb固体培养基上进行纯化，至培养基上只有单一菌株(约纯化四次)。用封口膜封口后，保存于4℃冰箱中。挑取单菌落至lb液体培养基中过夜培养，将培养菌株保存于25％(v/v)浓度的甘油溶液中，置于-80℃超低温冰箱保存。
84.(2)菌株的鉴定
85.将上述分离得到的菌株用lb液体培养基培养至对数生长期，8000rpm离心5min收集菌体沉淀，提取菌体dna，采用通用引物扩增菌体基因组dna中的16s rrna序列进行测序，将测序结果与ncbi中的菌株序列进行对比，利用mega11构建系统发育树(如图1)，确定菌株tr-21为昆明假单胞菌。
86.通用引物序列：
87.27f:5'-agrgtttgatyntggctcag-3'。(seq id no.1)
88.1492r:5'-tasgghtaccttgttasgactt-3'。(seq id no.2)
89.实施例2：tr-21菌株吸附稀土离子能力测定
90.(1)十四种混合稀土溶液吸附能力测定
91.从固体培养基上挑取纯化后的tr-21单菌落至4ml lb液体培养基中，于30℃200rpm过夜培养作为种子液。1％接种至lb液体培养基中，于30℃200rpm培养至对数期。8000rpm离心5min收集菌体，用无菌超纯水洗涤3次。将洗涤后的菌体加入至100ml十四种混合稀土溶液中，置于30℃，200rpm恒温震荡摇床中吸附1h。收集菌体，用超纯水洗涤3次后称重，保存于4℃。使用icp-oes表征菌体中的rees含量。结果显示(如表1)，tr-21对sm的吸附量最多(597.95μg/g)，而对la的吸附量最少(156.32μg/g)。
92.十四种混合稀土元素母液的配制：称取镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥无水氯化物或水合氯化物，配制浓度为1mol/l的母液，过0.22微米pes膜后保存在超净工作台。取100ml超纯水，将上述十四种稀土母液各加入10μl，得到稀土离子终浓度为0.1mmol/l的混合稀土溶液。
93.表1 tr-21菌株对十四种稀土离子的吸附量
94.稀土元素tr-21的吸附量(μg/g)la156.32ce240.78pr261.53nd321.67sm597.95eu553.57gd357.57tb558.08dy468.29ho366.79
er324.62tm428.11yb450.21lu502.14
95.(2)la,sm混合稀土溶液吸附能力测定
96.菌体处理同上述混合吸附过程。将洗涤后的菌体加入100ml la，sm混合稀土溶液中，置于30℃，200rpm恒温震荡摇床中吸附。收集菌体，用无菌超纯水洗涤3次后称重，保存于4℃。使用icp-oes测定菌体中的稀土元素含量。结果显示，tr-21对la和sm的回收率分别为72％和89％。
97.la,sm混合稀土溶液配制：取100ml超纯水，上述1mol/l la、sm稀土母液各加入10μl，得到la、sm终浓度为0.1mmol/l的混合稀土溶液。
98.实施例3：tr-21菌株胞外矿化稀土离子能力测定
99.(1)按实施例2(1)中的方法进行吸附，吸附时间延长至30天，收集洗涤后用超纯水将菌体重悬得tr-21悬液。将100μl的tr-21菌悬液滴加到放在蜡盘上的200目碳膜覆盖铜制电镜载网上，待细菌沉降15min后，从蜡盘中夹取铜制电镜载网放在滤纸片上进行干燥，干燥20min后完成透射电镜制样。利用100kv透射电子显微镜进行观察，并利用高分辨tem-eds对其中高电子密度点进行元素分析。
100.结果如图2所示，经过30天的生物合成，tr-21可以利用la(iii)、ce(iii)、pr(iii)和nd(iii)在细胞外形成性能稳定的纳米级稀土盐。其中，tr-21使用la(iii)、ce(iii)和pr(iii)矿化出的晶体，长度在500-900nm之间，宽度在50nm左右，形状类似于纳米线。在hrtem下可以观察到清晰的晶格结构，la、ce和pr的晶格间距分别为0.3125nm、0.3060nm和0.3081nm。将晶格间距与jcpds标准卡进行对比，这三种晶体是单斜相lapo4(120)＝0.3127nm，cepo4(200)＝0.3040nm和prpo4(120)＝0.3085nm。tr-21用nd(iii)在细胞外矿化的晶体长度在300-400nm之间，宽度在20-30nm之间，形状也类似于纳米线。与la(iii)、ce(iii)和pr(iii)矿化的晶体相比，tr-21使用nd(iii)矿化的晶体较小，但在hrtem下仍然可以观察到清晰的晶格结构。其晶格间距为0.3022nm，与jcpds标准卡对比显示，该晶体为单斜系ndpo4(200)＝0.3020nm。tr-21利用sm(iii)、eu(iii)和gd(iii)在细胞外矿化的稀土盐有两种形式：一种是类似于la(iii)的纳米线状晶体，长度在300-500nm之间，宽度在20-30nm之间，晶格条纹平面间距分别为0.3040nm、0.3033nm和0.3025nm。他们的晶格条纹平面间距与jcpds标准卡进行了对比，结果显示这三种晶体为单斜相smpo4(120)＝0.3043nm，eupo4(-120)＝0.3034nm和gdpo4(120)＝0.3024nm。另一种是细线形状，其长度在300-500nm之间，宽度太细无法测量，在hrtem下无法观察到明显的晶格结构。然而，tr-21使用tb(iii)、dy(iii)和ho(iii)在细胞外矿化的稀土盐都是细线形状，长度约为100nm，使用er(iii)、tm(iii)、yb(iii)和lu(iii)在细胞外形成片状或水凝胶状生物合成。在hrtem下没有观察到明显的晶格结构。通过hrtem-eds对tr-21矿化的所有纳米线、细线和片状/水凝胶状稀土矿物的元素分析表明，在矿化产物区有ree(ⅲ)、p、o和c。这进一步表明，ree(ⅲ)在与细菌表面的po
43-结合后，以矿物相的形式与po
43-共存。也就是说，合成的稀土盐是reepo4。
101.为了验证tr-21对混合稀土元素也保持这种生物合成形式，本发明选择la和sm元
素进行混合吸附。吸附2h后，每个细菌的表面都出现了一个直径约为50nm，边缘相对光滑的稀土纳米颗粒(如图3所示的b所示)。19h后，颗粒的大小和形态没有明显变化，但每个细菌的表面上出现了两个或更多的颗粒(如图3所示的c所示)。150h后，颗粒的边缘呈现出针状结构，大小约为100nm(如图3所示的d所示)。720h后，颗粒的最大尺寸约为250nm(如图3所示的e所示)。图3所示的f和图3所示的g所示的hrtem图像清楚地显示了颗粒的晶格和晶格条纹，其平面间距为0.3120nm和0.3037nm，这与jcpds卡的标准卡一致，即单斜相lapo4(120)＝0.3127nm和单斜相smpo4(120)＝0.3043nm。hrtem-eds结果显示，稀土纳米粒子区域的元素含有la、sm、o和p(如图3所示的h所示)。所有上述结果表明，由tr-21矿化的稀土纳米颗粒拥有良好的结晶度，其核心的主要成分是lapo4和smpo4。
102.(2)按照实施例2(1)中的方法进行吸附，360h后收集并洗涤tr-21，用2.5％的戊二醛重悬tr-21，进行过夜固定；将固定好的菌悬液5000g离心3min，弃上清；加入超纯水洗2次，再加入新鲜的超纯水混匀；将洗好混匀菌液滴100μl于盖玻片中央，沉降2h；吸上清，进行梯度脱水，采用50％，70％，80％，90％各1次，100％乙醇脱水2次，每次10min；再用100％叔丁醇置换100％乙醇3次，每次10分钟，共30min。30min后干燥(本发明选择自然干燥)；样品喷金，完成扫描电镜制样。利用扫描电镜对样品进行观察，结果如图4所示，当tr-21没有吸附稀土时，细菌细胞是表面光滑的椭圆形。如图4所示的a所示，细菌的边缘更加清晰。当tr-21与la和sm相互作用360h后，细菌细胞之间的聚集更加严重，表面上出现了更多的圆形纳米颗粒，大小约为100nm(如图4所示的b所示)。这一结果表明，tr-21对rees的生物合成发生在细菌细胞的表面。
103.实施例4：利用基因工程技术提高tr-21表面稀土磷酸盐矿化物产量
104.(1)在载体质粒中插入目的基因片段
105.从dna序列数据库(genbank，美国国家生物技术信息中心)中获得分子伴侣degp(nc_000913.3(180884..182308))、skp(nc_000913.3(200482..200967))和sura(nc_000913.3(53416..54702,complement))的dna序列分别作为目的基因，它们参与外膜蛋白的合成过程。用限制酶(pcm62：hindiii和xbai；pcm66：xbai和bamhi)切割存在于假单胞菌中的载体质粒pcm62(seq id no.3)或pcm66(seq id no.4)，同时用该限制酶切割作为目的基因的分子伴侣degp(nc_000913.3(180884..182308))、skp(nc_000913.3(200482..200967))或sura(nc_000913.3(53416..54702,complement))，使目的基因产生相同的黏性末端。加入适量dna连接酶，将目的基因片段插入质粒切口，形成带有目的基因的重组质粒。为了方便检测目的基因是否能在tr-21细胞中表达，可同时在质粒上插入一段6
×
his标签基因作为标记基因，便于检测目的基因是否能在tr-21细胞中表达。
106.(2)将重组质粒转化导入tr-21中表达
107.tr-21菌株经过cacl2处理，形成感受态细胞。将重组的载体质粒与感受态细胞共同孵育，目的基因和标记基因会随着质粒被转化导入细胞中。并用sds-page检测目的基因是否表达，结果如图5所示，这表明目的基因已成功导入tr-21细胞内，并可在tr-21内维持稳定并表达。通过实施例2的方法，检测工程化的tr-21菌株对稀土的吸附能力。结果如表2所示，重组质粒的导入，提高了tr-21菌株的吸附能力，从而也提高了稀土磷酸盐的矿化量。
108.表2工程化的tr-21菌株(sura)对十四种稀土离子的吸附量
[0109][0110][0111]
实施例5：利用基因工程技术增强tr-21对某些稀土离子的特异性
[0112]
从dna序列数据库中获取多磷酸激酶2(ppk2,nc_000962.3(3608870..3609757,complement))和p_mxaf强启动子的基因序列(seq id no.7)共同作为目的基因，ppk2参与并催化多聚磷酸盐(polyp)的合成，同时选定6
×
his基因作为标签，便于检测目的基因是否能在tr-21细胞中表达。按照实施例4(1)的方法，将此目的基因和标记基因插入载体质粒pcm62或pcm66中。接着，根据实施例4(2)所述，将重组质粒转化导入tr-21中，并通过sds-page检测目的基因是否表达，结果如图6所示，这表明目的基因已成功导入tr-21细胞内，并可在tr-21内维持稳定并表达。通过实施例2的方法，检测工程化的tr-21菌株对稀土的特异性吸附能力。结果如表3所示，重组质粒的导入，提高了tr-21菌株对轻、中稀土元素的特异性吸附能力，显著降低了工程化的tr-21菌株对重稀土的吸附量(p＜0.05)。
[0113]
表3工程化的tr-21菌株对十四种稀土离子的特异性吸附能力检测
[0114][0115]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21，其特征在于，其保藏编号为cgmcc no.26447。2.如权利要求1所述的昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21，其特征在于，其使用形式包括活菌、灭活菌体、发酵液、外泌体或代谢产物中的一种或多种。3.重组菌株的制备方法，其特征在于，基于如权利要求1或2所述的昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21，通过表达如下任意项获得重组菌株：(i)、分子伴侣degp、skp或sura的编码基因；和/或(ii)、多磷酸激酶2的编码基因和p_mxaf强启动子。4.如权利要求3所述的制备方法制得的重组菌株。5.微生物菌剂，其特征在于，包括如下任意项以及可接受的辅料和/或助剂：(i)、如权利要求1或2所述的昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或(ii)、如权利要求4所述的重组菌株。6.如下任意项在回收稀土离子中的应用：(i)、如权利要求1或2所述的昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或(ii)、如权利要求4所述的重组菌株；和/或(ⅲ)、如权利要求5所述的微生物菌剂。7.如下任意项在生物采矿和/或尾矿的开发利用中应用：(i)、如权利要求1或2所述的昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或(ii)、如权利要求4所述的重组菌株；和/或(ⅲ)、如权利要求5所述的微生物菌剂。8.如下任意项在制备稀土纳米级颗粒或微米级颗粒中的应用：(i)、如权利要求1或2所述的昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或(ii)、如权利要求4所述的重组菌株；和/或(ⅲ)、如权利要求5所述的微生物菌剂。9.回收稀土离子的方法，其特征在于，基于如下任意项回收：(i)、如权利要求1或2所述的昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或(ii)、如权利要求4所述的重组菌株；和/或(ⅲ)、如权利要求5所述的微生物菌剂。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，基于如下任意项与稀土溶液混合吸附：(i)、如权利要求1或2所述的昆明假单胞菌(pseudomonas kunmingensis)tr-21；和/或(ii)、如权利要求4所述的重组菌株；和/或(ⅲ)、如权利要求5所述的微生物菌剂。

技术总结
本发明涉及环保型生物采矿技术领域，具体涉及昆明假单胞菌及其应用。本发明提供一株可通过胞外矿化稀土磷酸盐晶体回收稀土离子的昆明假单胞菌新菌株，并对该菌株进行基因改造，能够为稀土生物采矿、富稀土尾矿利用和稀土纳米颗粒生物合成提供新的选择和途径。本发明所提供的菌株培养成本低、生长速度快、吸附条件简单，且对多种稀土离子均有吸附能力，其在稀土微生物采矿、尾矿利用等方面具有较好的应用前景。应用前景。


技术研发人员：刘凯 马超 崔惠敬 张欣 张洪杰
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/9