一种靶向递送AIEgen用于放射治疗增强免疫治疗载体制备与抗肿瘤应用的制作方法

一种靶向递送aiegen用于放射治疗增强免疫治疗载体制备与抗肿瘤应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向递送aiegen用于放射治疗增强免疫治疗载体制备与抗肿瘤应用。


背景技术：

2.放射治疗(rt)是一种除化疗和手术治疗之外的常规肿瘤治疗手段，在大多数肿瘤的治疗中起不可替代的作用。放射治疗通过x射线损伤dna形成dna自由基，并产生活性氧簇(ros)抑制肿瘤生长。通常放射治疗的治疗效果与辐射剂量密切相关，但由于肿瘤与正常组织的物理距离相近以及对x射线的敏感性相似，在取得临床疗效的同时难免伴随着短期或长期的副作用。此外，在某些肿瘤中，其放射敏感性与正常组织相比较低，导致放射治疗的效率低下。因此，迫切需要增强肿瘤对放射治疗的敏感性以提高放射治疗的疗效。
3.截止到目前为止，已有多种策略被开发以增强肿瘤的放射治疗效果，例如借助计算机辅助技术精确照射以降低照射剂量，放射增敏剂，放射防护剂，放疗与其他治疗方式相结合的综合治疗，等等。其中，放射治疗与免疫治疗的结合可显著增强治疗效果而备受关注。并且，纳米医学的快速发展使得放射治疗的效率得到很大的提高，并且如hfo2和aguix等已获得批准作为放疗增敏剂用于临床治疗。然而，传统的显像剂和放射治疗增敏剂，往往受限于聚集诱导淬灭效应(acq)，同时缺乏辐射增敏能力，使得其放射治疗效果不甚理想。
4.2001年，由唐本忠教授发现的聚集诱导发光效应(aggregation-induced emission,aie)，由于其表现出与acq分子相反的行为，被认为是纳米医学应用领域的“全能运动员”。aie荧光生色团(aiegen)具有一系列的优势，包括更高的光稳定性，更大的斯托克斯位移，更高的信噪比和智能靶向等优点。更重要的是，aiegen在成像引导的光热治疗/光动力治疗/声动力疗法/放射动力疗法/微波动力疗法中具有更高的ros生成效率，从而实现多合一协同治疗。
5.尽管有一些aiegen能够从正常细胞中识别、区分、监测癌细胞，并在体外特异性积聚在癌细胞中而不累积于正常细胞中。然而，由于低水溶性、血液循环形成蛋白冠、aiegen生物代谢以及纳米疗法通过血液循环远端靶向递送能力和特异性的不足，当应用于体内测定治疗效果时，不可避免地要使用合适的靶向肿瘤部位的运载平台。目前，急需设计和开发合适的靶向肿瘤部位的运载平台，实现特异性高效治疗。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是如何设计和开发合适的靶向肿瘤部位的运载平台，实现特异性高效治疗。
7.为了解决上述问题，本发明提供了一种具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的药物。
8.本发明提供的具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的药物的活性成分含有vnp@
tbtp-au，所述vnp@tbtp-au由细菌和所述细菌装载的tbtp-au组成，所述tbtp-au是结构式为式1的化合物，
[0009][0010]
所述tbtp-au分子式为c
61h58
auf5n6o2s4，tbtp-au分子量为1326.3065。产率：93％。
[0011]
所述tbtp-au可通过下述方法制备。tbtp-au化合物合成路线制备见图1。
[0012]
compound 1、compound 2和yridin-4-ylboronic acid购自zhengzhou ruke biotechnology co.,ltd.。c6f5au(tht)(tht＝thiophene)合成方法参考自：uson,r.；laguna,a.；laguna,m.；briggs,d.a.；murray,h.h.；fackler jr.,j.p.,(tetrahydrothiophene)gold(i)or gold(iii)complexes.in inorganic syntheses,1989；pp 85-91.。
[0013]
1)compound 3合成方法(suzuki偶联反应)：compound 1(963mg,1.30mmol)和compound2(431mg,1.00mmol)混合于42ml thf/water(v/v:5:1)溶液中，并加入pd(pph3)4(58mg,0.05mmol)和k2co3(414mg,3.00mmol).混合液于70℃n2环境下搅拌4h，加入20ml水终止反应，利用ch2cl2(3
×
20ml)对获得的产物进行提取。提取物利用无水na2so4进行干燥和过滤提纯。最后混合液通过column chromatography(silica gel,ch2cl2/hexane＝1:1,v/v)获得浅绿色固体compound 3。compound 3的分子式为c
50h54
brn5o2s4，分子量为963.2366。产率：463mg(48％)。
[0014]
以下为质谱鉴定结果：1h nmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):8.62(s,1h),8.62(s,1h),7.41(d,j＝8hz,2h),7.14(d,j＝8hz,4h),7.00(d,j＝4hz,4h),6.88(d,j＝12hz,2h),3.83(s,6h,
–
och3),2.73(d,j＝4hz,2h),2.60(d,j＝4hz,2h),1.74(m,2h),1.37-1.27(m,18h),0.98-0.85(m,12h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3),δ(ppm):156.1,150.4,148.3,146.0,141.8,140.6,138.5,137.1,136.8,134.8,133.1,129.8,126.8,126.3,119.8,116.8,114.8,113.5,110.8,55.5(
–
och3),40.4,40.0,33.8,32.6(m),28.8,28.7,25.8,25.7,23.2,14.2(d),10.9(d).hrms(maldi-tof),m/z:calcd.for c
50h54
brn5o2s4:963.2344；found:963.2366.
[0015]
2)合成tbtp(suzuki偶联反应)：在42ml的dioxane/thf/water(v/v/v:3:2:1)溶液中加入compound 3(963mg,1.00mmol)、pyridin-4-ylboronic acid(160mg,1.30mmol)、pd(pph3)4(116mg,0.10mmol)和k2co3(414mg,3.00mmol)，混合溶液在70℃n2环境搅拌反应12h.加入20ml水终止反应，利用ch2cl2(3
×
20ml)萃取反应产物.提取物利用无水na2so4进行干燥和过滤提纯。最后混合液通过column chromatography(silica gel,ch2cl2/meoh＝20:1,v/v)获得黑绿色的tbtp.tbtp的分子式为c
55h58
n6o2s4，分子量为962.3515。产率为635mg(66％)。
[0016]
以下为质谱鉴定结果：1h nmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):8.85(d,j＝8hz,2h,pyridine-h),8.68(d,j＝4hz,2h),7.53(d,j＝8hz,2h,pyridine-h),7.41(d,j＝8hz,2h),
7.13(d,j＝12hz,4h),6.98(d,j＝8hz,2h),6.87(d,j＝8hz,4h),3.82(s,6h,
–
och3),2.81(d,j＝8hz,2h),2.77(d,j＝4hz,2h),1.75(br,2h),1.26(br,18h),0.88-0.84(m,12h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3),δ(ppm):156.1,151.4,151.0,150.0,148.5,147.3,146.4,140.8 140.5,138.7,137.4,137.0,135.7,129.8,126.9,126.1,119.8,114.8,113.5,110.8,55.5(
–
och3),40.5,32.5(m),28.6(d),25.8,23.1(d),14.2(d),10.9(d).hrms(maldi-tof),m/z:calcd.for c
55h58
n6o2s4:962.3504；found:962.3515.
[0017]
3)合成tbtp-au(配体交换反应)：在ch2cl2(30ml)溶液中加入c6f5au(tht)(362mg,0.40mmol)、tbtp(193mg,0.20mmol)，室温n2环境搅拌反应48h，反应结束后通过旋蒸获得粗产物，并加入ch2cl2/iced diethyl ether通过重结晶获得深绿色的tbtp-au。tbtp-au分子式为c
61h58
auf5n6o2s4，tbtp-au分子量为1326.3065。产率：93％。结构式为如下：
[0018][0019]
以下为质谱鉴定结果：1h nmr(400mhz,thf-d8),δ(ppm):8.94(d,j＝12hz,2h),8.72(d,j＝4hz,2h),7.90(d,j＝8hz,2h),7.43(d,j＝4hz,2h),7.11(d,j＝8hz,4h),6.98-6.88(m,6h),3.98(s,6h),2.93(d,j＝8hz,2h),2.81(d,j＝8hz,2h),1.73(br,2h),1.42-1.29(m,18h),0.92-0.86(m,12h).
13
c nmr(100mhz,thf-d8),δ(ppm):157.9,152.1,151.9,151.6,149.6,149.4,148.5,147.0,143.8,141.2,140.7,139.1,138.7,136.6,136.5,136.3,136.2,130.6,128.1,125.5,120.2,117.3,115.8,55.8(
–
och3),41.6,41.3,34.9,33.7(d),29.8,29.7,26.9,24.2(d),14.8,14.7,11.4,11.3.
19
f nmr(376mhz,thf-d8),δ(ppm):-116.0(m),-159.2(m),-162.8(m).hrms(maldi-tof),m/z:calcd.for c
61h58
auf5n6o2s4:1326.3090；found:1326.3065.
[0020]
上述药物中，所述细菌为对数生长期的细菌。
[0021]
所述细菌可为沙门氏菌，如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)vnp20009。
[0022]
本发明提供了一种制备前文所述药物的方法。
[0023]
本发明提供的制备前文所述药物的方法，包括将细菌和tbtp-au混合，得到vnp@tbtp-au，将所述vnp@tbtp-au作为所述药物的活性成分，得到所述药物；所述vnp@tbtp-au由细菌载体和所述活性细菌载体装载的tbtp-au组成，所述tbtp-au是结构式为式1的化合物，
[0024][0025]
本发明提供了用于治疗肿瘤的产品，所述产品含有前文所述药物和产生x射线的同位素。
[0026]
所述产生x射线的同位素可为au。
[0027]
本发明还提供了前文所述的tbtp-au在制备增强前文所述的活性细菌的抗肿瘤细胞活性的药物中的应用，所述肿瘤细胞为前文所述的癌细胞。
[0028]
本发明还提供了前文所述活性细菌在制备增强前文所述的tbtp-au材料的抗肿瘤细胞活性的药物中的应用，所述肿瘤细胞为前文所述的癌细胞。
[0029]
本发明还提供了前文所述的药物在制备增强肿瘤放射治疗效果的产品中的应用。
[0030]
所述放射治疗为x射线治疗。所述产品可含有产生x射线的同位素。所述产生x射线的同位素可为au。
[0031]
本发明还提供了前文所述的tbtp-au材料在制备增强放射治疗效果的产品中的应用。
[0032]
本发明还提供了所述的tbtp-au、vnp@tbtp-au在制备具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的药物中的应用。
[0033]
本发明中，所述肿瘤可为原发型肿瘤和/或转移瘤。
[0034]
聚集诱导发光(aiegen)在增强生物成像引导的放射治疗效果和放射免疫治疗以提高肿瘤治疗效果方面具有巨大潜力，并具有良好的生物安全性。细菌作为一种天然的递送载体，在肿瘤靶向给药和穿透进入肿瘤方面显示出巨大的优势。
[0035]
在本研究中，我们构建了一个以沙门氏菌vnp20009作为活性细菌载体，负载预先制备的tbtp-au(vnp@tbtp-au)，通过生成活性氧展现出优异的放射动力学疗效。vnp@tbtp-au可以靶向肿瘤并将tbtp-au滞留在肿瘤组织，并且可将tbtp-au特异性的递送到深部肿瘤组织，在x线的照射下会产生大量ros，通过cgas-sting信号通路诱导免疫原性细胞死亡，从而实现对原发肿瘤的有效放射免疫治疗，具备良好的生物安全性。更重要的是，vnp@tbtp-au的放射免疫治疗形成了良好的远隔效应，能够抑制远处肿瘤的生长。通过以上策略，将细菌和影像引导放射治疗与免疫治疗有机结合以获得更好的治疗效果奠定了基础。
附图说明
[0036]
图1为tbtp-au合成路线图。
[0037]
图2为vnp@tbtp-au的表征。a)tbtp-au，vnp20009以及vnp@tbtp-au的tem图像；b)vnp@tbtp-au clsm图像；c)dls分析粒径大小；d)dls分析zeta电位；e)uv-vis光谱分析；f)以dmpo为自旋捕捉剂，在不同剂量的x射线照射下，测定了tbtp-au(10μg/ml)和ddh2o产生
·
oh的esr光谱；g)在不同剂量的x射线照射(tbtp-au溶解于1％dmso溶液)下，与所示配方相关的产生1o2的abda分解率；h)在不同剂量的x射线照射下(tbtp-au溶解在1％dmso溶液
中)，与指定配方相关的
·
oh生成诱导mb分解率。
[0038]
图3为vnp20009、tbtp-au和vnp@tbtp-au的荧光光谱。
[0039]
图4为不同数量vnp20009中tbtp-au的浓度水平。
[0040]
图5为通过测定od
600
值，测定tbtp-au作用后vnp20009细胞的增殖率。
[0041]
图6为为负载tbtp-au前后lb平板上的vnp20009 cfu。
[0042]
图7为通过测定不同剂量照射后vnp20009细胞的od
600
值，观察vnp20009细胞的增殖率。
[0043]
图8为vnp@tbtp-au的体外作用。a)不同浓度vnp20009的溶血试验(n＝5)；b)不同浓度vnp@tbtp-au的溶血试验(n＝5)；c)-e)用不同类型和浓度的纳米材料处理24h后293t细胞c)、hela细胞d)和b16f10细胞e)细胞的相对存活率(n＝4)；f)b16f10癌细胞与不同纳米粒子结合并以不同剂量的x射线后的细胞存活率(n＝4)；g)用不同纳米粒子结合x射线照射处理的b16f10癌细胞的calcein-am/pi染色。
[0044]
图9为体外实验验证基于tbtp-au增强放射治疗的分子机制。a)ros探针染色荧光图像；b)不同处理后的b16f10细胞γ-h2a.x(s139)染色；c)不同处理后克隆形成图像；d)不同治疗后crt免疫荧光染色成像；e)对应b)中γ-h2a.x(s139)的定量研究；f)对应c)中克隆形成率量化；g)对应d)中crt免疫荧光染色的平均荧光强度；h)蛋白质的相对表达；i)不同治疗后cgamp水平(n＝4)；j)不同处理后atp释放水平(n＝4)；k)不同处理后b16f10癌细胞中ifn-γ水平(n＝4)；l)不同处理后b16f10癌细胞中tnfα水平(n＝4)；m)不同治疗后b16f10癌细胞il-12水平(n＝4)；数据以平均值
±
sem表示。p值通过单向方差分析计算*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0045]
图10为ros探针的mfi。
[0046]
图11为1o2探针的荧光图像。
[0047]
图12为o
2-探针的荧光图像
[0048]
图13为免疫印迹显示cgas-sting通路和γ-h2a.x的蛋白水平。
[0049]
图14为vnp@tbtp-au体内靶向性和生物分布的测定。a)tbtp-au或vnp@tbtp-au处理小鼠体内不同时间点的荧光图像；b)注射后24小时主要器官和肿瘤的荧光图像he：心脏，lv：肝脏，sp：脾脏，lu：肺，ki：肾脏，tu：肿瘤；c)lb琼脂平板涂板用于评估tbtp-au和vnp@tbtp-au处理24h后在不同组织中积累；d)对应于a)的辐射效率(n＝3)；e)b16f10癌细胞荷瘤小鼠不同器官在不同时间点的荧光辐射效率对应于b)；f)对应于c)的不同组织克隆的量化。
[0050]
图15为为期16天的体内抗肿瘤免疫治疗研究。a)肿瘤体积生长曲线；b)体重曲线；c)治疗后第16天的肿瘤图像，x：死亡，o：无肿瘤；d)不同治疗后小鼠的生存分析；e)肿瘤重量分析；f)不同治疗后ros水平(红色：ros，蓝色：dapi)和细胞凋亡的代表性图像(红色：凋亡细胞，蓝色：dapi)，h&e染色和不同治疗后的肿瘤切片；g)各种免疫细胞亚群的荧光成像，即m1巨噬细胞：cd11b+/f4/80+/cd80+，m2巨噬细胞：cd11b+/f4/80+/cd86+，总t细胞：cd3+，cd4t细胞：cd4+，以及细胞毒t细胞：cd3+cd8+，肿瘤浸润性nk细胞：cd3-/cd49b+/cd45+。数据采用均值
±
扫描电镜(mean
±
sem)表示。用单因素方差分析计算p值。*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001and****p《0.0001。
[0051]
图16为脾脏中cd4
+
和cd8
+
t细胞的荧光图像。
[0052]
图17为各种治疗16天后的血液学数据wbc、rbc、hgb、mcv、mchc、plt、hct和mch。g1(简称1)：对照组，g2(简称2):vnp，g3(简称3):tbtp-au，g4(简称4)：vnp@tbtp-au，g5(简称5)：对照组+rt，g6(简称6)：vnp+rt，g7(简称7)：tbtp-au+rt，8(简称8)：vnp@tbtp-au+rt。
[0053]
图18为各种治疗16天后的血液生化数据包括alt、ast、tp、glb、tbil、urea、crea、alb。g1(简称1)：对照组，g2(简称2):vnp，g3(简称3):tbtp-au，g4(简称4)：vnp@tbtp-au，g5(简称5)：对照组+rt，g6(简称6)：vnp+rt，g7(简称7)：tbtp-au+rt，8(简称8)：vnp@tbtp-au+rt。
[0054]
图19为用h&e染色法评价不同处理方式对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等主要器官的毒理学效应。
[0055]
图20为vnp@tbtp-au联合rt治疗介导的远处肿瘤抑制。a)vnp@tbtp-au与rt相结合的放射免疫治疗示意图；b)原发肿瘤体积曲线；c)远处肿瘤体积曲线；d)原发肿瘤重量；e)远处肿瘤重量；f)各种免疫细胞亚群的荧光成像，即m1巨噬细胞：cd11b
+
/f4/80
+
/cd80
+
，m2巨噬细胞：cd11b
+
/f4/80
+
/cd86
+
，总t细胞：cd3
+
，cd4 t细胞：cd4
+
，细胞毒性t细胞：cd3
+
cd8
+
，肿瘤浸润性nk细胞：cd3-/cd49b
+
/cd45
+。
数据以平均值
±
sem表示。p值通过单向方差分析计算*p《0.05,**p《0.01and***p《0.001。
[0056]
图21为从各治疗组组小鼠中采集的(左)原位和(右)远处肿瘤的数字图像。
[0057]
图22为c57bl/6j小鼠经各种处理后的体重变化。
[0058]
图23为不同组别肿瘤切片h&e染色的代表性图像。
具体实施方式
[0059]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0060]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0061]
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
[0062]
下述实施例中的vnp20009为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typyimurium)vnp20009(atcc 202165)。
[0063]
细胞计数试剂盒-8(cck-8)、活性氧物种测定试剂盒、annexin v-fitc/pi凋亡检测试剂盒、atp测定试剂盒，钙调素am/pi购自beyotime biotechnology。pbs(ph 7.4)和胎牛血清(fbs)购自gibco life technologies(ag，瑞士)。
[0064]
dmem、胰蛋白酶(edta)和青霉素链霉素购自康宁。luria bertani(lb)琼脂粉和lb液体培养基干粉购自solarbio。
[0065]
本研究中使用的所有其他化学品均为分析试剂级，使用时无需进一步纯化。超纯水(18.25mω.cm，25℃)用于制备所有溶液。
[0066]
统计学分析：实验结果表示为平均值
±
平均值标准误差(sem)。差异的显著性通过单向方差分析进行分析，然后使用gpaphpad prime 8.0(graphpad software)进行tukey’shonestly significant difference(hsd)检验，结果为*p《0.05、**p《0.01、***p《0.001。
[0067]
实施例1、携带tbtp-au的细菌载体vnp@tbtp-au的制备
[0068]
一、实验方法
[0069]
携带tbtp-au的载体vnp@tbtp-au制备具体步骤如下：
[0070]
1.制备聚集诱导发光物质tbtp-au
[0071]
tbtp-au通过以下方法制备。tbtp-au化合物合成路线制备见图1。
[0072]
compound 1、compound 2和yridin-4-ylboronic acid购自zhengzhou ruke biotechnology co.,ltd.。c6f5au(tht)(tht＝thiophene)合成方法参考自：uson,r.；laguna,a.；laguna,m.；briggs,d.a.；murray,h.h.；fackler jr.,j.p.,(tetrahydrothiophene)gold(i)or gold(iii)complexes.in inorganic syntheses,1989；pp 85-91.。
[0073]
1)compound 3合成方法(suzuki偶联反应)：compound 1(963mg,1.30mmol)和compound2(431mg,1.00mmol)混合于42ml thf/water(v/v:5:1)溶液中，并加入pd(pph3)4(58mg,0.05mmol)和k2co3(414mg,3.00mmol).混合液于70℃n2环境下搅拌4h，加入20ml水终止反应，利用ch2cl2(3
×
20ml)对获得的产物进行提取。提取物利用无水na2so4进行干燥和过滤提纯。最后混合液通过column chromatography(silica gel,ch2cl2/hexane＝1:1,v/v)获得浅绿色固体compound 3。compound 3的分子式为c
50h54
brn5o2s4，分子量为963.2366。产率：48％。
[0074]
以下为质谱鉴定结果：1h nmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):8.62(s,1h),8.62(s,1h),7.41(d,j＝8hz,2h),7.14(d,j＝8hz,4h),7.00(d,j＝4hz,4h),6.88(d,j＝12hz,2h),3.83(s,6h,
–
och3),2.73(d,j＝4hz,2h),2.60(d,j＝4hz,2h),1.74(m,2h),1.37-1.27(m,18h),0.98-0.85(m,12h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3),δ(ppm):156.1,150.4,148.3,146.0,141.8,140.6,138.5,137.1,136.8,134.8,133.1,129.8,126.8,126.3,119.8,116.8,114.8,113.5,110.8,55.5(
–
och3),40.4,40.0,33.8,32.6(m),28.8,28.7,25.8,25.7,23.2,14.2(d),10.9(d).hrms(maldi-tof),m/z:calcd.for c
50h54
brn5o2s4:963.2344；found:963.2366.
[0075]
2)合成tbtp(suzuki偶联反应)：在42ml的dioxane/thf/water(v/v/v:3:2:1)溶液中加入compound 3(963mg,1.00mmol)、pyridin-4-ylboronic acid(160mg,1.30mmol)、pd(pph3)4(116mg,0.10mmol)和k2co3(414mg,3.00mmol)，混合溶液在70℃n2环境搅拌反应12h.加入20ml水终止反应，利用ch2cl2(3
×
20ml)萃取反应产物.提取物利用无水na2so4进行干燥和过滤提纯。最后混合液通过column chromatography(silica gel,ch2cl2/meoh＝20:1,v/v)获得黑绿色的tbtp.tbtp的分子式为c
55h58
n6o2s4，分子量为962.3515。产率为66％。
[0076]
以下为质谱鉴定结果：1h nmr(400mhz,cdcl3),δ(ppm):8.85(d,j＝8hz,2h,pyridine-h),8.68(d,j＝4hz,2h),7.53(d,j＝8hz,2h,pyridine-h),7.41(d,j＝8hz,2h),7.13(d,j＝12hz,4h),6.98(d,j＝8hz,2h),6.87(d,j＝8hz,4h),3.82(s,6h,
–
och3),2.81(d,j＝8hz,2h),2.77(d,j＝4hz,2h),1.75(br,2h),1.26(br,18h),0.88-0.84(m,12h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3),δ(ppm):156.1,151.4,151.0,150.0,148.5,147.3,146.4,140.8 140.5,138.7,137.4,137.0,135.7,129.8,126.9,126.1,119.8,114.8,113.5,110.8,55.5(
–
och3),40.5,32.5(m),28.6(d),25.8,23.1(d),14.2(d),10.9(d).hrms(maldi-tof),m/z:calcd.for c
55h58
n6o2s4:962.3504；found:962.3515.
[0077]
3)合成tbtp-au(配体交换反应)：在ch2cl2(30ml)溶液中加入c6f5au(tht)(362mg,0.40mmol)、tbtp(193mg,0.20mmol)，室温n2环境搅拌反应48h，反应结束后通过旋蒸获得粗产物，并加入ch2cl2/iced diethyl ether通过重结晶获得深绿色的tbtp-au。tbtp-au分子式为c
61h58
auf5n6o2s4，tbtp-au分子量为1326.3065。产率：93％。结构式为如下：
[0078][0079]
以下为质谱鉴定结果：1h nmr(400mhz,thf-d8),δ(ppm):8.94(d,j＝12hz,2h),8.72(d,j＝4hz,2h),7.90(d,j＝8hz,2h),7.43(d,j＝4hz,2h),7.11(d,j＝8hz,4h),6.98-6.88(m,6h),3.98(s,6h),2.93(d,j＝8hz,2h),2.81(d,j＝8hz,2h),1.73(br,2h),1.42-1.29(m,18h),0.92-0.86(m,12h).
13
c nmr(100mhz,thf-d8),δ(ppm):157.9,152.1,151.9,151.6,149.6,149.4,148.5,147.0,143.8,141.2,140.7,139.1,138.7,136.6,136.5,136.3,136.2,130.6,128.1,125.5,120.2,117.3,115.8,55.8(
–
och3),41.6,41.3,34.9,33.7(d),29.8,29.7,26.9,24.2(d),14.8,14.7,11.4,11.3.
19
f nmr(376mhz,thf-d8),δ(ppm):-116.0(m),-159.2(m),-162.8(m).hrms(maldi-tof),m/z:calcd.for c
61h58
auf5n6o2s4:1326.3090；found:1326.3065.
[0080]
2.vnp@tbtp-au的制备
[0081]
vnp20009培养条件：接种至lb培养基，37℃，180rpm摇床培养，培养12-14h，获得vnp20009菌液。
[0082]
将步骤1获得的500μg tbtp-au与15μl dmso混合，得到tbtp-au溶液。将该tbtp-au溶液和对数生长期(od
600
:0.6-4)的vnp2009加入3ml lb培养基中，置于摇床中37℃150rpm1h，得到混合物。然后将该混合物6000rpm离心2min，pbs洗涤后以1ml pbs重悬后储存于4℃以备进一步使用，得到vnp@tbtp-au。利用uv-vis光谱的吸收强度估计vnp@tbtp-au中tbtp-au的负载效率。用荧光光谱法测定vnp@tbtp-au中tbtp-au的负载量，通过计算上清中的荧光强度，计算得到剩余的tbtp-au，再计算得到负载率。
[0083]
3.vnp@tbtp-au的表征
[0084]
透射电子显微镜(tem)图像以jem-3200fs透射电子显微镜拍摄。uv-vis-nir吸收光谱以spark 10m(tecan，美国)或nanodrop onec微体积uv-vis分光光度计测得。在zetasizer(nano series，malvern)上测量纳米颗粒vnp@tbtp-au的zeta电位、尺寸和多分散指数(pdi)。使用spark 10m(美国tecan)评估荧光强度。荧光图像由激光扫描共焦显微镜(tcs sp8，德国莱卡)拍摄。使用小型动物成像系统(ivis spectrum，perkinelmer，usa)检测体内生物分布。rt是在xrad 160(美国x射线透视)上进行的。
[0085]
4.tbtp-au对vnp20009的细胞毒性
[0086]
50μg tbtp-au与1
×
105cfu vnp20009在3ml lb培养基中孵育，并置于37℃ 150rpm的摇床中，通过测量不同时间点(0、0.5、2、4、6、12和24h)的od
600nm
来评估tbtp-au的细胞毒性。
[0087]
5.rt对vnp20009的抑制作用
[0088]
在6孔板各孔中加入3ml lb培养基，将1
×
105cfu vnp20009加入各孔，以2或4gy的剂量照射，然后将细菌转移到15ml离心管中，并置于37℃(150rpm)的摇床中，通过测量不同时间点(0、0.5、2、4、6、12和24h)的od
600nm
来评估rt对vnp20009的抑制率。
[0089]
6.检测单线态氧(1o2)的产生
[0090]
以9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(abda)为指示剂，测定了1o2的生成量。在实验过程中，在48孔板中分别加入0.2ml 20μg/ml的tbtp-au液体(用dmso溶解tbtp-au后再用pbs重悬得到的液体)、或0.2ml vnp20009菌悬液(用pbs悬浮vnp20009得到的液体，vnp20009的含量为1
×
106cfu/ml)或0.2ml pbs或0.2ml vnp@tbtp-au液体(用pbs悬浮vnp@tbtp-au得到的液体，相当于终浓度为20μg/ml tbtp-au，1
×
10
6\
cfu/ml vnp20009)，然后在各孔中加入1μl(7.5mm)abda，之后按以剂量(0，2，4，6，8，10gy)的射线照射。接下来在12,000rpm下离心10min。通过uv-vis光谱仪记录abda在378nm处的吸收，以获得其衰变速率。
[0091]
7.检测
·
oh的生成
[0092]
甲基蓝(mb)在665nm处的吸收增强表明
·
oh的产生。将0.2ml 20μg/ml的tbtp-au液体(用dmso溶解tbtp-au后再用pbs重悬得到的液体)、或0.2ml vnp20009菌悬液(用pbs悬浮vnp20009得到的液体，vnp20009的含量为1
×
106cfu/ml)或0.2ml pbs或0.2ml vnp@tbtp-au液体(用pbs悬浮vnp@tbtp-au得到的液体，相当于20μg/ml tbtp-au，1
×
106cfu/ml vnp20009)分别置于48孔板中，以不同剂量(0、2、4、6、8、10gy)照射，然后立即加入10μg/ml mb，37℃孵育30min，12,000rpm离心10min，用uv-vis光谱仪检测上清液的吸光度。
[0093]
二、实验结果
[0094]
将tbtp-au与对数生长期的vnp20009共培养1h，制备了负载tbtp-au的细菌，图2中a)中的透射电子显微镜图像和图2中b)中的clsm结果显示了制备的vnp@aie。vnp20009在加载tbtp-au后显示出类似的形态(图2中a))，表明加载tbtp-au后vnp20009的导电性能得到了改善，经350nm激光照射后，vnp20009的主要管腔中显示出红色漫反射荧光(图2中b))。vnp20009和vnp@tbtp-au的平均直径分别为1939
±
60.77nm和2019
±
26.15nm(图2中c))。在负载tbtp-au后，vnp@tbtp-au的zeta电位略高于vnp20009，但小于tbtp-au(图2中d))，表明tbtp-au负载在vnp20009的管腔内，而不是细胞膜外。
[0095]
uv-vis吸收光谱分析表明，vnp@tbtp-au在350nm和835nm处与tbtp-au具有相同的特征吸收峰(图2中e))，荧光光谱分析显示350nm激发下在706nm处有相同的发射峰(图3)。这些数据表明，所制备的tbtp-au已被vnp20009)负载，可用于进一步的使用。
[0096]
通过荧光光谱分析，vnp@tbtp-au在500μg tbtp-au：1
×
106cfu vnp20009时的负载效率为95.08％，表明vnp20009具有良好的负载能力。而且tbtp-au的负载水平随着vnp20009浓度的增加而上升(图4)。
[0097]
通过测定od
600nm
和在lb琼脂平板上进行稀释涂膜试验，评价纳米材料对vnp20009的抑制效果，结果如图5和图6所示，并且在纯菌和生物杂交菌vnp@tbtp-au中菌落总数几乎相等，所制备的tbtp-au对细菌生长的影响可以忽略不计。rt对vnp20009的生长速度有明显的抑制作用(图7)。
[0098]
为了证实tbtp-au作为一种有效的辐射增敏剂的有效性，利用5-二甲基吡咯烷氧化物(dmpo)、9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(abda)和甲基蓝(mb)的降解实验证实了所制
备的tbtp-au纳米材料在x射线照射下能够有效地产生羟基自由基(
·
oh)和1o2。结果如图2中f)所示，随着辐照剂量的增加，esr显示
·
oh/dmpo的特征峰显著增加，这表明所制备的抗原不仅可以通过x射线辐射增敏金属离子产生有效的
·
oh。同时，abda和mb检测也显示了1o2和
·
oh的特征信号强度显著增加(图2中g)和h)，表明通过x射线向tbtp-au的能量转移产生了有效的ros，vnp20009也不影响(
·
oh)和1o2的产生。
[0099]
综上所述，本发明成功地制备细菌和tbtp-au结合的递送平台，该平台可以同时有效地产生
·
oh和1o2来响应x射线照射，在抗肿瘤治疗方面具有巨大的潜力。
[0100]
实施例2、vnp@tbtp-au材料对体外细胞的影响
[0101]
1、细胞培养
[0102]
293t(货号：fh0244)和hela细胞(货号：fh0317)，b16f10细胞(货号：fh0361)均购自上海富衡生物科技有限公司细胞库。293t、hela和b16f10细胞在含1％青霉素-链霉素(p/s)和10％胎牛血清(fbs)的dmem(gibco)培养基中，在37℃，5％co2的环境中培养。
[0103]
2、细胞毒性实验
[0104]
将293t、hela和b16f10细胞培养在96孔板上(2
×
104个细胞/孔)，在37℃、5％co2、95％湿度的环境中培养，待细胞在96孔板中汇合到60-65％后，用含有所需数量的nps(0、5、10、20、50和100μg/ml)的200μl新的全培养液取代培养液，其中nps为tbtp-au和vnp@tbtp-au(相当tbtp-au的量，vnp20009的量为1
×
104cfu/请补充孔板反应体积)。同时用含1
×
104cfu vnp20009的200μl新的全培养液取代培养液。用特定间隔的样品处理细胞6h，用pbs洗涤细胞3次，以不同剂量(0、2、4、6、8、10gy)射线照射细胞，再培养12h，然后将10μl cck-8和90μl无血清培养液轻轻混合，加入每孔后37℃孵育1h，通过spark 10m检测波长450nm处的吸光度来评价细胞活力。
[0105]
3、b16f10癌细胞中ros生成检测
[0106]
将b16f10细胞与不同浓度的tbtp-au(体系终浓度为20μg/ml)、vnp20009(体系终浓度为1
×
106cfu/ml)、vnp@tbtp-au(体系终浓度相当于20μg/ml tbtp-au，vnp20009的量为1
×
106cfu/ml)和对照组pbs 10μl共同孵育4h并使用x线进行照射，然后将培养基更换为含5μm的dcfh-da、单线态氧传感器试剂和二氢乙啶的新鲜无血清培养基，在无光条件下继续孵育30min，分别检测ros、1o2和o
2-的产生。然后用clsm进行ros分析。
[0107]
4、克隆形成率检测
[0108]
将5
×
104个b16f10细胞接种到24孔板中过夜，分别加入tbtp-au(体系终浓度为20μg/ml)、vnp20009(体系终浓度为2
×
104cfu/ml)、vnp@tbtp-au(体系终浓度相当于20μg/ml、vnp20009的量为2
×
104cfu/ml)和对照组pbs 20μl孵育4h，4gy剂量照射后继续培养2h，然后收集细胞，以200个/孔的密度重新接种到6孔板中，培养1周，按时更换新鲜完全培养液。然后用预冷甲醇固定10min，结晶紫染色液染色后成像。
[0109]
5、溶血实验
[0110]
血样采集自c57bl/6j小鼠(gempharmatech co.ltd)。用5ml pbs稀释1ml血样，然后通过2000rpm 10min离心从血清中分离红细胞(rbc)。用pbs洗涤六次后，用10ml pbs稀释rbc。然后用不同浓度的vnp20009或vnp@tbtp-au溶液(体系终浓度为5、10、20、50、100μg/ml)，ddh2o和pbs设为阳性和阴性对照，以评估溶血能力。在摇床中37℃180rpm培养后放置在台式浓缩器中3小时后，将混合物以11000rpm离心10分钟。最后检测570nm处上清液的吸
光度，以计算溶血百分比。
[0111]
6、体外抗肿瘤效果
[0112]
将b16f10细胞(5
×
104cfu)接种于24孔板中，分别与tbtp-au(体系终浓度为20μg/ml)、vnp20009(体系终浓度2
×
104cfu/ml)、vnp@tbtp-au(体系终浓度相当于20μg/ml tbtp-au，vnp20009的量为2
×
104cfu/ml)和对照(pbs)共同培养4h，4gy剂量照射，12h后分别进行cck-8检测、活细胞和死亡细胞染色、钙调素-am/pi染色。
[0113]
7、atp检测
[0114]
将b16f10细胞以5
×
104个细胞/孔的密度接种于24孔板中培养16h(融合达80～85％)，然后用含有不同浓度的tbtp-au(体系终浓度为20μg/ml)、vnp20009(体系终浓度2
×
104cfu/ml))、vnp@tbtp-au(体系终浓度相当于20μg/ml tbtp-au，vnp20009的量为2
×
104cfu/ml)和对照(pbs)的新鲜培养液替换原细胞培养液培养4h，4gy剂量照射，12h后收集细胞培养物，按照说明书使用用三磷酸腺苷检测试剂盒测定细胞三磷酸腺苷含量。用spark10m检测和记录生物发光。
[0115]
8、体外实验检测inf-γ
[0116]
首先，将b16f10细胞以2
×
105个/孔的接种密度于6孔板培养过夜。当融合率达到70％时，加入tbtp-au(体系终浓度为20μg/ml)、vnp20009(体系终浓度为2.5
×
104cfu/ml)、vnp@tbtp-au(体系终浓度为相当于20μg/ml tbtp-au，vnp20009的量为2.5
×
104cfu/ml)和对照组(pbs)培养4小时，然后以是否经过x射线照射分组。经过上述处理后，收集b16f10细胞的培养上清液，用elasa法检测ifn-γ。
[0117]
9、western blotting
[0118]
将5
×
105cells b16f10细胞全细胞蛋白裂解物与稀释后的5
×
sds蛋白上样缓冲液混合后煮沸，然后进行sds-page电泳，电泳完毕后转到聚偏氟乙烯膜(pvdf)上。转膜结束后以封闭缓冲液(beyotime biotechnology，cat.no.p0023b)封闭1h，后在4℃下与以下抗体封闭过夜：cgas(cat.no:ab224144,abcam),sting(cat.no.13647s,cst),calreticulin(crt,cat.no:ab92516,abcam),hmgb1(cat.no:ab79823,abcam),γ-h2a.x(s139)(cat.no:ab81299,abcam)andβ-actin(cat.no.ac026,abclonal),β-actin被设为内参。一抗封闭后的pvdf膜以pbs与吐温-20的混合液(pbst)洗涤3次，后与抗兔igg且连接hrp的二抗孵育2h。二抗封闭结束后再次以pbst洗涤3次，每次5min。洗涤结束后使用pierce
tm
ecl western blotting显色剂(cat.no.32132；life)孵育后以chemiscope series 6000touch(clinx science instruments co.ltd)进行成像。
[0119]
10、免疫荧光染色
[0120]
b16f10细胞或组织切片样品在室温下用4％多聚甲醛固定15分钟。然后，样品用0.1％triton x-100pbs渗透10分钟，并在室温下与含有5％牛血清白蛋白(bsa)的封闭缓冲液孵育1小时。然后，样品与特定一抗(crt，cat no:ab92516，abcam；γ-h2a.x(s139)，cat no：ab81299，abcam)在不同稀释度下4℃孵育过夜，然后用pbs洗涤三次，并在室温下以特定的二抗孵育2小时。最后，用dapi染色，使用pbs洗涤样品，并使用leica clsm(sp8)成像。为了确定免疫细胞亚群，结果部分详细列出了典型标记的特异性抗体。
[0121]
上述实验结果如下：
[0122]
由于细菌可能导致败血症休克，首先评估了不同浓度的vnp20009的溶血率。如图8
中a)所示，vnp20009在体外表现出良好的生物相容性，即使用1
×
106cfu的vnp20009孵育红细胞，溶血率也低于5％(～4.60％)，这可能是由于vnp20009的msbb基因的缺失降低了其导致败血症休克的能力。同时，vnp@tbtp-au与溶血分析也表现出良好的生物相容性(图8中b))。将vnp20009和vnp@tbtp-au与不同类型的细胞系(293t、hela和b16f10)孵育24小时，cck-8细胞计数分析表明两者都没有明显的细胞毒性(图8中c)-e))。这些数据表明所制备的vnp@tbtp-au具有良好的生物相容性和生物安全性。
[0123]
tbtp-au的体外放射增敏性能分析如下：当b16f10细胞与20μg/ml tbtp-au或vnp@tbtp-au共同孵育时，在不同照射剂量下，tbtp-au组和vnp@tbtp-au组的细胞杀伤率均显著高于单纯放疗组(图8中f))，如放射剂量为4gy时，对照组、vnp20009组、tbtp-au组和vnp@tbtp-au组的细胞死亡率分别为23.50％、31.25％、64.75％和77.02％。
[0124]
calcein-am和碘化丙啶(pi)与b16f10细胞的荧光共染色用于检测不同纳米材料加x射线照射后癌细胞的存活和死亡情况。如图8中g)所示，tbtp-au和vnp@tbtp-au组的红色荧光强度(pi)的增加表明放射治疗增强优于其他组并且进一步验证未接受rt照射的细胞的生物安全性。
[0125]
rt通过直接dna损伤或间接增强ros的生成，诱导癌细胞死亡。首先在b16f10肿瘤细胞中分别加入vnp20009，tbtp-au，vnp@tbtp-au培养4小时，然后进行x线照射，接下来用dcfh-da(ros)、单线态氧传感器试剂(1o2)和二氢乙硫酸氢钠(o
2-)等不同的ros探针标记不同种类的ros。荧光染色结果如图9中a)和图10所示，经aie和vnp@aie处理后在x射线照射下，b16f10癌细胞内能产生更多的活性氧。1o2和o
2-染色也显示，aie和vnp@aie加上x射线照射后会有更强的荧光强度(图11和图12)。相反，在对照组+rt和vnp20009+rt组以及未接受x射线照射的组中观察到低荧光强度，与vnp@aie可以促进放射动力学治疗的能力一致。这些数据表明，制备的基于aie的纳米材料是有效的放射增敏剂，可明显增强放射治疗效果。
[0126]
用dna双链断裂标记(γ-h2a.x(s139))染色评价x射线照射引起的dna损伤结果如图9中b)和e)所示，rt、vnp+rt、tbtp-au+rt或vnp@tbtp-au与未经x射线照射的其他治疗组相比，rt治疗组可对b16f10癌细胞造成明显的细胞dna损伤，尤其是tbtp-au+rt或vnp@tbtp-au+rt组中可观察到更严重的dna损伤。western blotting结果也证实了γ-h_2a.x(s139)在aie+rt或vnp@aie+rt治疗组的表达增强(图13)。
[0127]
克隆形成实验评估基于tbtp-au的放射治疗增强的抑制作用的结果如图9中c)和f)所示，直观的照片和定量数据都表明，与没有x射线照射或没有tbtp-au的x射线照射组相比，aie的预处理tbtp-au/vnp@tbtp-au+rt对肿瘤细胞集落形成有更显著的抑制作用，表明tbtp-au或vnp@tbtp-au显著提高b16f10癌细胞对x射线的敏感性。
[0128]
根据体外有效癌细胞杀伤能力的数据(图3中f)和g))，进一步研究tbtp-au放射增敏剂在tbtp-au或vnp@tbtp-au结合x射线照射后是否能诱导icd。通过免疫染色评估了癌细胞表面crt的表达结果如图9中d)和g)所示，tbtp-au联合x射线照射可以显著增强的外周crt表达，这表明制备得到的tbtp-au联合rt具有极好的诱发icd的能力。
[0129]
通过western blotting检测crt的表达增强，crt蛋白的表达量在vnp@tbtp-au+rt组中是对照组的约2.04倍(图13和图9中h))。除crt外，还研究了icd及其信号通路(cgas sting)的其他指标，包括分泌的cgamp、atp、释放的高迁移率组蛋白b1(hmgb1)、ifn-γ和tnfα结果如图13所示，b16f10癌细胞在接受基于tbtp-au的放射增敏后增强了cgas、sting
和hmgb1的表达。定量研究结果还显示，接受基于tbtp-au的放射增敏后，cgamp、atp和ifn-γ的分泌显著增强(图9中i)-l))。
[0130]
此外，由于细胞因子通过极化巨噬细胞和刺激t细胞在调节免疫系统激活中的重要作用，在不同治疗后也对其进行了评估。结果如图9中m)所示，b16f10癌细胞经基于tbtp-au的放射增敏治疗后，il-12的表达增强。因此，可以合理地得出这样的结论，即制备的基于tbtp-au的rt可以通过cgas-sting信号通路诱发icd。
[0131]
实施例3、tbtp-au和vnp@tbtp-au材料对体内细胞的影响
[0132]
1.动物肿瘤模型构建
[0133]
雌性c57bl/6j(5～6周龄，体重：18-20g)购自gempharmatech co.，ltd，所有动物均饲养在深圳市人民医院动物中心的无特定病原体(spf)实验室，温度22
±
1℃，湿度40-50％，光/暗循环12小时，可自由饮水和标准实验室食物。所有程序均经动物实验机构伦理委员会批准，并按照深圳人民医院(暨南大学第二临床医学院；南方科技大学第一附属医院)的要求执行。将b16f10肿瘤细胞(2
×
105个悬浮于100μl pbs中)皮下注射到每只小鼠的侧腹部，建立b16f10-细胞荷瘤模型。肿瘤可以生长到180mm3，以便进一步使用。在体内抑瘤实验中，将小鼠随机分为4组，每组6只。
[0134]
2、肿瘤靶向性和体内分布评估
[0135]
当c57bl/6j小鼠b16f10荷瘤体积达到160mm3时，随机分为三组：vnp20009组、tbtp-au组和vnp@tbtp-au组，每组3只小鼠。分别静脉注射vnp20009、tbtp-au或vnp@tbtp-au。其中，vnp20009组每只小鼠尾静脉注射100μl vnp20009液体(用生理盐水悬浮vnp20009得到的液体)，使给药剂量为1
×
105cfu/kg体重；tbtp-au组每只小鼠尾静脉注射100μltbtp-au液体(用dmso溶解tbtp-au后再用生理盐水重悬得到的液体)，使给药剂量为5mg tbtp-au/kg体重；vnp@tbtp-au组每只小鼠尾静脉注射100μl vnp@tbtp-au液体(用生理盐水重悬vnp@tbtp-au得到的液体)，使tbtp-au的给药剂量为5mg/kg体重，vnp20009的给药剂量为1
×
104cfu/只。然后将小鼠置于ivis成像系统中，观察默认时间(0，12和24小时)的荧光图像。
[0136]
24h后麻醉处死小鼠，取肿瘤及主要脏器(肝、心、肺、脾、肾)进行荧光分析。取小鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等主要脏器测定荧光强度。为研究细菌的靶向能力，取0.1g小鼠心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织，匀浆于含0.1％ triton x-100的5mlpbs溶液中，10μl稀释5倍，接种于固体lb板上。然后培养过夜计数细菌菌落，以获得准确的细菌cfu。
[0137]
通过注射vnp@tbtp-au与注射tbtp-au的小鼠进行比较，表明vnp20009能够增强np的靶向能力(图14中a)和d)。注射24小时后，处死小鼠，进行体外荧光成像检查肿瘤靶向性和生物分布。如图14中b)和e)所示，在注射vnp@tbtp-au的小鼠中，与其他器官相比，肿瘤组织的荧光强度最高并且和肝组织的荧光强度几乎相等，表明vnp20009可以特异性靶向肿瘤组织。图14中c)和f)结果表明，除肝脏外，细菌主要聚集在注射vnp@aie的小鼠的肿瘤内，并且在注射tbtp-au的小鼠中观察到的每个组织中都没有细菌克隆形成，这表明vnp@tbtp-au有利于提高rt的治疗效果。
[0138]
3、体内抗肿瘤作用
[0139]
将b16f10荷瘤c57bl/6j小鼠随机分为8组(每组6只)：
[0140]
g1：对照组(注射100μl pbs)。第0天每只小鼠静脉注射100μl的pbs。
[0141]
g2：vnp(注射量100μl，1
×
104个细胞)。第0天每只小鼠静脉注射100μl的vnp20009菌悬液。vnp20009菌悬液是用pbs悬浮vnp20009得到的液体，vnp20009菌悬液中vnp20009的含量为1
×
104cfu/100μl。
[0142]
g3：tbtp-au(注射量100μl，5mg/kg的tbtp-au)。第0天每只小鼠静脉注射100μl的tbtp-au液体(用dmso溶解tbtp-au后再用pbs重悬得到的液体)，使tbtp-au的给药剂量为5mg/kg体重。
[0143]
g4：vnp@tbtp-au(注射量100μl，相当于1mg/ml tbtp-au，vnp20009的量为5
×
105cfu/ml)。第0天每只小鼠静脉注射100μl的vnp@tbtp-au液体(用pbs悬浮vnp@tbtp-au得到的液体)，使tbtp-au的给药剂量为5mg/kg体重，vnp20009的给药剂量为1
×
104cfu/只。
[0144]
g5：control对照组(注射100μl pbs)+在注射后12h接受局部x射线照射(4gy)。第0天每只小鼠静脉注射100μl的pbs，注射后12h肿瘤部位接受局部x射线照射(4gy)。
[0145]
g6：vnp(注射量100μl，1
×
104个细胞)。第0天每只小鼠静脉注射100μl的vnp20009菌悬液。vnp20009菌悬液是用pbs悬浮vnp20009得到的液体，vnp20009菌悬液中vnp20009的含量为1
×
104cfu/100μl，注射后12h肿瘤部位接受局部x射线照射(4gy)；
[0146]
g7：tbtp-au(注射量100μl，5mg/kg的tbtp-au)第0天每只小鼠静脉注射100μl的tbtp-au液体(用dmso溶解tbtp-au后再用pbs重悬得到的液体)，使tbtp-au的给药剂量为5mg/kg体重，注射后12h肿瘤部位接受局部x射线照射(4gy)；
[0147]
g8：vnp@tbtp-au(注射量100μl，相当于终浓度5mg/kg的tbtp-au，vnp20009的量为5
×
104cfu/ml)第0天每只小鼠静脉注射100μl的vnp@tbtp-au液体(用pbs悬浮vnp@aie得到的液体)，使tbtp-au的给药剂量为5mg/kg体重，vnp20009的给药剂量为1
×
104cfu/只，注射后12h肿瘤部位接受局部x射线照射(4gy)。
[0148]
在第0天，每只小鼠静脉注射100μl的pbs或制备的nps(1
×
105cfu的vnp20009或5mg/kg的tbtp-au)。每2天测量一次小鼠体重和肿瘤大小。肿瘤体积按长
×
(宽)2×
1/2计算。
[0149]
4、安全性评估
[0150]
给药16d后处死小鼠，取出主要组织(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)进行组织切片和图像分析，并采集血常规和生化分析。血常规检测包括白细胞(wbc)、红细胞计数(rbc)、血红蛋白(hgb)、平均红细胞体积(mcv)、平均红细胞血红蛋白(mch)、平均红细胞血红蛋白浓度(mchc)、血小板(plt)和红细胞压积(hct)。测定血清丙氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、总蛋白(tp)、球蛋白(glb)、总胆红素(tbil)、尿素氮(bun)、肌酐(crea)、白蛋白(alb)。
[0151]
5、利用tunel技术进行凋亡细胞测定
[0152]
肿瘤组织切片使用tunel分析试剂盒进行处理。在本实验中，凋亡细胞用红色染色，并通过荧光显微镜(eclipse 80i，尼康公司)进行分析。
[0153]
体内实验评估tbtp-au的放射治疗效率结果如下：与对照组(图15中a))相比，g2至g4的肿瘤抑制率不明显，肿瘤从160mm3快速生长至1400mm3，这可能是因为vnp20009的低剂量和aie的良好生物安全性。与g1组相比，在暴露于x射线的g5至g8组中观察到明显的肿瘤抑制作用，肿瘤分别从160mm3生长到881mm3、877mm3、623mm3和77mm3(图15中a)。在从第0天到第16天的治疗期间，这些组的体重没有显著差异(图15中b))，只有g1组的小鼠自然死亡(图
15中d))，表明实验中的纳米颗粒毒性轻微或无毒。
[0154]
治疗结束时，处死小鼠，获取肿瘤并称重(图15中c)、e))。图15中c)中展示了肿瘤图像并对肿瘤重量进行量化(图15中e))表明，rt可以显著抑制肿瘤生长，制备的aie是一种极好的放射增敏剂，可进一步抑制体内肿瘤的生长。这些数据证实了tbtp-au和vnp@tbtp-au良好的抗肿瘤能力。
[0155]
对接受各种治疗后的肿瘤冷冻切片中的活性氧水平和细胞凋亡率进行了检测。如图15中f)所示，与其他组相比，在接受rt的组别中(g5-g8)，g7和g8组中的ros明显增加。同样，通过tunel染色，与其他组相比，接受rt的中的细胞凋亡更多，g7和g8组的荧光信号增加最明显。凋亡蛋白的h&e染色和ihc染色，包括ki67、bcl-2和caspase-3显示g8组的核染色明显减少，核碎片增多，表明g8的治疗效果优于其他组。ihc染色结果还显示，不同治疗后凋亡蛋白的表达发生了显著变化。例如，ki67和bcl-2下调，caspase-3上调。这些数据进、、一步验证了vnp@aie良好的抗肿瘤作用。
[0156]
在体外实验中证实了vnp@tbtp-au，rt和icd作为免疫反应的激活剂，可以诱导免疫系统的激活，并将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤以消除肿瘤。研究上述各组的抗肿瘤免疫反应，通过对典型标记物进行荧光染色来确定各种类型的免疫细胞。肿瘤组织切片的荧光染色结果如图15中g)所示。rt治疗增强了m1巨噬细胞的瘤内丰度(cd11b+/f4+/80+/cd80+)，降低了m2巨噬细胞的肿瘤内丰度，g8组m1巨噬细胞增加和m2巨噬细胞减少的幅度高于其他组，提示vnp@tbtp-au+rt通过诱导巨噬细胞从m2向m1表型的极化来促进抗肿瘤免疫的激活。此外，对总t细胞、效应t细胞、细胞毒性t细胞和肿瘤浸润性nk细胞的检测也表明，与未经rt的组相比，g5至g8组的这些细胞群显著升高，且vnp@tbtp-au+rt强于tbtp-au+rt、vnp+rt和control+rt(图15中g))，这可能与注射vnp@tbtp-au联合rt后cgas-sting信号通路的激活有关。
[0157]
同时，由于脾是主要免疫器官，我们检测了不同处理后的cd4
+
和cd8
+
t细胞，g5～g8组高于g1～g4组，且vnp@tbtp-au+rt组的作用强于tbtp-au+rt组、vnp+rt组和control+rt组(图16)。这些数据证实了用所制备的基于tbtp-au的纳米材料治疗可以诱导出强大的抗肿瘤免疫。
[0158]
另一方面，治疗的毒性和生物安全性是进一步应用的必要要求。除了体重保持不变(图15中b))外，通过常规血液检查、血液化学和主要器官的he染色来系统评估生物安全性结果如图17和18所示，所有8组的血常规和生化指标均可比，提示在当前剂量下注射vnp20009不会导致脓毒症或其他严重症状。h&e染色显示所有8组小鼠的重要器官均未见明显破坏或损伤(图19)。因此，所制备的tbtp-au平台具有良好的生物安全性。
[0159]
实施例4、rt联合vnp@tbtp-au的远期效应
[0160]
rt已被证明是icd的有效触发手段，激活宿主免疫反应，然后创造一种细胞因子模式，促进效应细胞的迁移和功能。因此，它对远处肿瘤提供了一种远隔效应。通过以上实验可知，vnp@tbtp-au与rt相结合具有强大的多重免疫应答。在此基础上，进一步探讨vnp@aie联合rt对远处肿瘤的放射免疫治疗。
[0161]
1)建立c57bl/6j小鼠双侧b16f10肿瘤模型：(b16f10癌细胞接种于右侧(-7天)为原发瘤，左侧(-4天)为远处瘤)(图20中a))，将小鼠分为以下五组：
[0162]
g1：对照组、g2：对照组+rt、g3：vnp+rt组、g4：tbtp-au+rt组、g5：vnp@tbtp-au+rt
组。
[0163]
当原发肿瘤体积达到≈180mm3，远处肿瘤体积达到≈140mm3时，注射上述纳米材料，于注射后24h对g2～g5进行x射线照射，注射剂量和照射剂量同实施例3中3步骤。然后每隔2天对两侧肿瘤进行监测，连续16天。
[0164]
结果发现：与第1组相比，第2至第5组的原发肿瘤和远处肿瘤的生长受到抑制(图20中b)和c))，g5组的抑制作用高于g2至g4。
[0165]
治疗结束后处死小鼠，解剖肿瘤，称重，如图20中d)和e)和图21所示，左侧肿瘤与右侧肿瘤评价相似，提示vnp@tbtp-au联合rt可取得良好的放射免疫治疗效果。小鼠的体重没有明显变化(图22)，表明我们的实验具有良好的生物安全性。
[0166]
治疗结束时采集肿瘤组织，切片检查。h&e染色显示g5组细胞核染色较少，核碎裂较多(图23)，表明治疗效果较好。此外，还通过检测免疫细胞的典型标志物来研究远端肿瘤的抗肿瘤免疫。肿瘤组织切片的荧光染色结果如图20中f)所示。rt治疗使瘤内m1巨噬细胞(cd80
+
、红色)的丰度增加，m2巨噬细胞(cd86
+
、绿色)的丰度降低，且g5组m1巨噬细胞增多、m2巨噬细胞减少的幅度高于其他组。同时，总t细胞(cd3
+
)、效应t细胞(cd4
+
)、细胞毒t细胞(cd8
+
)和肿瘤浸润性nk细胞(cd45
+
)染色结果显示，g2～g5组免疫细胞较未放疗组显著升高，且g5组中vnp@tbtp-au+rt的作用分别强于tbtp-au+rt组、vnp+rt组和control+rt组(图20中f))。以上数据表明，制备的抗原纳米材料可以激活免疫反应，诱导远隔效应，抑制远端肿瘤。
[0167]
本发明中，利用减毒沙门氏菌vnp20009作为新合成的tbtp-au的放射增敏剂传递载体，结合其免疫刺激作用，实现肿瘤放射免疫治疗。首先，通过共同培养vnp20009和tbtp-au，并将vnp20009载体特异性靶向肿瘤部位，与单纯tbtp-au相比，其被癌细胞摄取，从而获得了负载tbtp-au的vnp20009，并且它通过增强ros的生成和dna损伤，以及通过cgas-sting信号通路诱导icd，表现出良好的增强rt的作用。更重要的是，vnp@tbtp-au联合rt可通过激活免疫反应有效消除原发性肿瘤。最后vnp@tbtp-au联合rt还可以通过激发免疫反应抑制远处肿瘤的生长。vnp@tbtp-au与rt联用显示出良好的安全性。
[0168]
综上所述，利用细菌作为tbtp-au增强rt的有效载体，探讨了其在肿瘤放射免疫治疗中的作用和机制，为细菌与影像引导放射治疗的有机结合提供了一种新的策略，也为与免疫治疗的结合以获得更好的治疗效果奠定了基础。
[0169]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的药物，其特征在于：所述药物的活性成分含有vnp@tbtp-au，所述vnp@tbtp-au由细菌和所述细菌装载的tbtp-au组成，所述tbtp-au是结构式为式1的化合物，2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于：所述细菌为对数生长期的细菌。3.制备权利要求1或2所述药物的方法，其特征在于：所述方法包括将细菌和tbtp-au混合，得到vnp@tbtp-au，将所述vnp@tbtp-au作为所述药物的活性成分，得到所述药物；所述vnp@tbtp-au由细菌载体和所述活性细菌载体装载的tbtp-au组成，所述tbtp-au是结构式为式1的化合物，4.用于治疗肿瘤的产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1或2所述药物和产生x射线的同位素。5.权利要求1或2中所述的tbtp-au在制备增强权利要求1-3任一所述的活性细菌的抗肿瘤细胞活性的药物中的应用，所述肿瘤细胞为权利要求1或3所述的癌细胞。6.权利要求1或2中任一所述活性细菌在制备增强权利要求1-3任一所述的tbtp-au的抗肿瘤细胞活性的药物中的应用，所述肿瘤细胞为权利要求1或3所述的癌细胞。7.权利要求1或2中所述的药物在制备增强肿瘤放射治疗效果的产品中的应用。8.权利要求1-3任一中任一所述的tbtp-au在制备增强放射治疗效果的产品中的应用。9.权利要求1-3任一中任一所述的tbtp-au、vnp@tbtp-au在制备具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种靶向递送AIEgen用于放射治疗增强免疫治疗载体制备与抗肿瘤应用。本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向递送AIEgen用于放射治疗增强免疫治疗载体制备与抗肿瘤应用。本发明提供了具有抑制肿瘤细胞活性或抗肿瘤活性的药物，药物的活性成分含有VNP@TBTP-Au，VNP@TBTP-Au由活性细菌和活性细菌载体装载的TBTP-Au组成。利用减毒沙门氏菌VNP20009作为新合成的TBTP-Au的放射增敏剂传递载体，结合其免疫刺激作用，实现肿瘤放射免疫治疗，为细菌与影像引导放射治疗的有机结合提供了一种新的策略，也为与免疫治疗的结合以获得更好的治疗效果奠定了基础。获得更好的治疗效果奠定了基础。


技术研发人员：朵燕红 骆光洪 陈美丽 李子煌 李先明
受保护的技术使用者：深圳市人民医院
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/9