用于aGVHD分级的联合诊断标志物及试剂盒

用于agvhd分级的联合诊断标志物及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及一种用于agvhd分级的联合诊断标志物及试剂盒，属于生物技术领域。


背景技术：

2.异基因造血干细胞移植(allo-geneic造血干细胞移植，allo-hsct)是目前治愈造血系统恶性肿瘤，尤其是白血病的唯一有效手段。近年来异基因造血干细胞移植技术发展迅速，移植成功率及患者长期生存率都有很大改善，但是急性移植物抗宿主病(agvhd)仍然是异基因造血干细胞移植后发病和死亡的主要原因之一。在hla相合的亲缘供者移植中仍有30～50％的概率发生agvhd，hla不全相合和无关供者干细胞移植的agvhd发生率更高。移植物抗宿主病的主要特征是免疫系统中效应t细胞过度活化，cd8
+
t细胞能通过颗粒酶/穿孔素途径在主要组织相容性复合物不相和的受者介导致死性agvhd，最终造成受者靶器官的免疫炎症损伤。
3.《中国异基因造血干细胞移植治疗血液系统疾病专家共识(ⅲ)——急性移植物抗宿主病(2020年版)》公开了agvhd的诊断和分级标准根据，i～ii度为轻度agvhd，iii～iv度为重度agvhd；重度agvhd可能对肝脏及下消化道造成严重的器官受累，并发生扩展至全身的皮疹。根据黄晓军.造血干细胞移植问与答.人民卫生出版社.2020年3月第1版，第63-76以及penack o,et al.lancet haematol.2020；7:e157-67.的记载，轻度agvhd不会影响移植效果，相反对预防复发有好处，且轻度agvhd往往一般不用治疗。而一旦患者发生比较严重的agvhd，不但会影响移植效果，需要多种免疫抑制剂药物，价格昂贵、不良反应重且易合并感染。因此对于重度的agvhd来说，早期发现和预防、积极治疗均很重要。
4.目前对于agvhd的诊断主要靠临床症状，但由于agvhd早期表现缺乏特异性，如仅有轻微的皮肤瘙痒、皮疹、恶心、腹泻等，易与感染或药物不良反应等相混淆，不易在发病早期明确诊断并给予及时治疗。近年来，有学者采用针对agvhd发生机制中细胞因子的变化情况来辅助诊断，并评估agvhd的严重程度和预后。例如单独测量或与其他标记一起测量st2是agvhd和nrm(非复发死亡)比较有效的生物标志物。st2早在hsct后第7天或第14天也有被证实为agvhd和nrm的预后标志物。elafin是使用下一代蛋白质组学和皮肤agvhd样本发现的，并支持在血浆和皮肤活组织检查中对agvhd的特异性诊断。在过去的十年中，异基因造血干细胞移植后agvhd的上述生物标志物研究有了突破性进展，但尚未成为常规临床实践的一部分。早期诊断agvhd相对困难，缺乏足够有效的实验室检测指标。因此急需寻找一种能够客观、实时反映患者细胞免疫状态的特异性指标来早期预测、诊断并分级agvhd，为临床争取机会。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种用于agvhd分级的联合诊断标志物，所述联合诊断标志物包括tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞。
6.本发明还提供了检测上述联合诊断标志物水平的试剂在制备agvhd分级诊断的产
品中的应用。
7.本发明还提供了一种用于agvhd分级诊断的试剂盒，所述试剂盒包括检测上述联合诊断标志物的水平的试剂。
8.在本发明的一种实施方式中，所述试剂包括靶向tim-3的荧光素标记抗体和靶向颗粒酶b的荧光素标记抗体。
9.在本发明的一种实施方式中，所述试剂还包括靶向igg的荧光素标记抗体和靶向cd8
+
t细胞的荧光素标记抗体。
10.在本发明的一种实施方式中，所述试剂包括cd8-fitc荧光标记抗体、颗粒酶b-alexa647荧光标记抗体、tim-3-pe荧光标记抗体和igg-pe荧光标记抗体。
11.在本发明的一种实施方式中，所述试剂还包括红细胞裂解液。
12.本发明还提供了一种使用上述试剂盒的方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述方法为先使用试剂盒中的抗体试剂对待测样本进行处理，再检测待测样本中tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例。
13.在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
14.步骤一：取两支流式试管，将待测样本加入两支流式试管中，在第一试管中加入靶向tim-3的荧光素标记抗体和靶向cd8
+
t细胞的荧光素标记抗体，在第二试管中加入靶向igg的荧光素标记抗体和靶向cd8
+
t细胞的荧光素标记抗体，将第二试管作为同型对照，得到两份被标记的待测样本；
15.步骤二：使用破膜剂将两份被标记的待测样本破膜，在第一试管中加入靶向颗粒酶b的荧光素标记抗体，得到两份经破膜的待测样本；
16.步骤三：使用流式细胞分析(fcm)检测两份经破膜的被标记的待测样本，得到tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例。
17.在本发明的一种实施方式中，所述步骤一中，所述靶向tim-3的荧光素标记抗体为tim-3-pe荧光标记抗体；所述靶向cd8
+
t细胞的荧光素标记抗体为cd8-fitc荧光标记抗体；所述靶向igg的荧光素标记抗体为igg-pe荧光素标记抗体。
18.在本发明的一种实施方式中，所述步骤二中，所述靶向颗粒酶b的荧光素标记抗体为颗粒酶b-alexa647荧光标记抗体。
19.在本发明的一种实施方式中，所述步骤二还包括：纯化和固定两支被标记的待测样本。
20.在本发明的一种实施方式中，所述步骤二中，通过在被标记的待测样本中加入红细胞裂解液，离心并弃上清，得到纯化后的待测样本。
21.在本发明的一种实施方式中，所述步骤三中，使用流式细胞分析检测包括：使用ssc和fsc设门淋巴细胞，然后设门cd8
+
t淋巴细胞，通过同型对照设门分析得到tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例。
22.在本发明的一种实施方式中，当检测结果得到待测样品中tim-3
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例≥14.155％，且颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例≥86.195％时，为ⅲ～ⅲ度agvhd，所述agvhd为单倍体造血干细胞移植后发生的agvhd。
23.在本发明的一种实施方式中，所述待测样品为外周血。
24.本发明技术方案，具有如下优点：
25.本发明提供了一种用于agvhd分级的联合诊断标志物，所述联合诊断标志物为tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞；通过流式细胞分析得到在单倍体造血干细胞移植后发生agvhd的患者的外周血中，tim-3
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例≥14.155％(95％ ci＝0.675～1.000，约登指数＝0.604，p《0.05)，且颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞比例≥86.195％时，诊断为ⅲ～ⅲ度agvhd。为agvhd分级诊断提供足够有效的实验室检测指标，且该指标具备特异性，能够客观、实时反映患者细胞免疫状态，以达到早期预测、诊断并分级agvhd的可能，为临床争取机会。
26.本发明还提供了一种用于agvhd分级诊断的试剂盒和使用所述试剂盒进行agvhd分级诊断的方法，所述试剂盒包括cd8-fitc荧光标记抗体、颗粒酶b-alexa647荧光标记抗体、tim-3-pe荧光标记抗体和igg-pe荧光标记抗体，建立了agvhd早期预测快速检测平台试剂组合；使用流式细胞分析(fcm)方法，通过所述试剂盒中多色流式抗体组合和精准设门策略的组合，可以在50分钟内完成tim-3
+
cd8
+
t细胞的检测和分析，省时省力，同型对照设门策略精确计算tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞的数量，减少了实验误差，有利于操作的标准化。
附图说明
27.图1：a移植后健康对照组(hc)、非agvhd组和agvhd组血液中tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的代表性流式细胞图。b移植后健康对照组(hc)、非agvhd组和agvhd组血液中cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞对比图。
28.图2：a i～ii度和iii～iv度agvhd患者血液中tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的代表性流式细胞图。b i～ii度和iii～iv度agvhd患者血液中cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞对比图。
29.图3：agvhd患者血液中tim-3
+
cd8
+
t细胞的相关性分析图。
30.图4：不同cd8
+
t细胞亚群对agvhd严重程度的诊断价值的roc分析图。
具体实施方式
31.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
32.下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
33.下述实施例中涉及的cd8-fitc荧光素标记抗体购自美国bd公司，cat#555634；穿孔素-percp-cy
tm
5.5荧光素标记抗体购自美国bd公司，cat#563762；tim-3-pe荧光素标记抗体购自美国bd公司，cat#563422；颗粒酶b-alexa647荧光素标记抗体购自美国bd公司，cat#561999；igg-pe荧光素标记抗体购自旷博生物公司，cat#560951z6410050-100t；红
细胞裂解液购自旷博生物公司，型号为z6910001。
34.实施例1：一种用于agvhd分级的联合诊断标志物
35.本实施例提供了一种用于agvhd分级的联合诊断标志物，所述联合诊断标志物为tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞。
36.实施例2：一种用于agvhd分级诊断的试剂盒
37.本实施例提供了一种用于agvhd分级诊断的试剂盒，所述试剂盒由cd8-fitc荧光标记抗体、颗粒酶b-alexa647荧光标记抗体、tim-3-pe荧光标记抗体、igg-pe荧光标记抗体和红细胞裂解液组成。
38.实施例3：一种使用用于agvhd分级诊断的试剂盒的方法
39.本实施例提供了一种使用用于agvhd分级诊断的试剂盒的方法，所述方法包括如下步骤：
40.步骤一：使用含有用于抗凝的肝素钠的采血管，采集1ml的单倍体造血干细胞移植患者的空腹静脉血，将空腹静脉血与采血管中含有的肝素钠混匀，得到抗凝血；取两支流式试管，每支试管中加入200μl的抗凝血，在第一试管中加入cd8-fitc荧光标记抗体和tim-3-pe荧光标记抗体各5μl，在第二试管中加入cd8-fitc荧光标记抗体和igg-pe荧光标记抗体各5μl，将第二试管作为同型对照管，将第一试管和第二试管于25℃避光孵育15min，得到两份被标记的抗凝血样本；
41.步骤二：在两份被标记的抗凝血样本中加入2ml的红细胞裂解液，涡旋震荡混匀，于25℃避光静置5min后，于1000rpm下离心5min，弃上清得到纯化后的空腹静脉白细胞样本；在纯化后的空腹静脉白细胞样本中加入100μl的固定剂(bd公司破膜剂，cat#641776，a液)，避光孵育5min后，加入2ml的pbs缓冲液混匀，于1000rpm下离心5min，弃上清得到经纯化、固定的空腹静脉白细胞样本；在第一试管的经纯化、固定的空腹静脉白细胞样本中加入50μl的破膜剂(bd公司破膜剂，cat#641776，b液)，在第二试管的经纯化、固定的空腹静脉白细胞样本中加入50μl的破膜剂(bd公司破膜剂，cat#641776，b液)和5μl的颗粒酶b-alexa647荧光标记抗体，于4℃避光孵育15min后，使用pbs缓冲液洗涤细胞一次，得到两份经纯化、固定和破膜的空腹静脉白细胞样本；
42.步骤三：使用pbs缓冲液洗涤两份经纯化、固定和破膜的空腹静脉白细胞样本，在经洗涤的空腹静脉白细胞样本中加入500μl的pbs缓冲液重悬细胞后，使用流式细胞仪(canto ii)(bd biosciences,franklin lakes,nj,usa)分析检测经pbs缓冲液重悬的空腹静脉白细胞样本，每个样本收集5万个细胞，所述流式细胞仪首先用ssc和fsc设门淋巴细胞，然后设门cd8
+
t淋巴细胞，分别分析tim-3和颗粒酶b在cd8
+
t细胞中的表达；当单倍体造血干细胞移植患者的外周血中的tim-3
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例≥14.155％，且颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞比例≥86.195％时，诊断为ⅲ～ⅲ度agvhd。
43.实验例1：流式细胞分析
44.本实验例提供了针对tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的流式分析，从单倍体外周血造血干细胞移植的患者入手，对患者外周血中tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的比例进行动态监测，并进一步分析三者与agvhd的相关性，实验过程如下：
45.所有患者均来自新疆医科大学第一附属医院。经由医院伦理委员会审核通过方案，签署知情同意书后进行本治疗，所有患者和所有健康对照者均签署知情同意书。
46.招募以57例单倍体外周血造血干细胞移植的患者和20例年龄和性别与移植患者相匹配的健康对照者作为研究对象；所述患者的agvhd诊断和分级根据《中国异基因造血干细胞移植治疗血液系统疾病专家共识(ⅲ)——急性移植物抗宿主病(2020年版)》：年龄小于50岁；hla配型无全相合供者(中华骨髓库无关供者和脐带血库寻找相匹配的脐带血均无或病情不能等待者)，选择亲缘间的单倍体供者；移植前无活动性感染；移植前无明显脏器损伤功能障碍者，ⅰ～ⅰ度为轻度和ⅲ～ⅲ度为重度。
47.使用实施例3的方法，在实施例3的基础上，保留步骤三，步骤一的空腹静脉血抽取自上述患者和健康对照者；在步骤二的第二试管中加入破膜剂和颗粒酶b-alexa647荧光标记抗体时，同时加入5μl的穿孔素-percp-cy
tm
5.5荧光标记抗体，其他操作方法相同；分别分析tim-3、颗粒酶b和穿孔素在cd8
+
t细胞中的表达；移植后健康对照组(hc)、非agvhd组和agvhd组血液中各细胞对比如图1所示，i～ii度和iii～iv度agvhd患者血液中各细胞对比如图2所示。
48.图1a显示了单倍体相合外周血造血干细胞移植后，移植患者血液中tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的百分比增加，非agvhd组与agvhd组相比，cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞数量差异无统计学意义；图1b显示了agvhd组的tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞百分比显著高于非agvhd组(p《0.05)和健康对照组。
49.图2显示了ⅲ～ⅲ度agvhd组的tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞数量显著高于ⅰ～ⅰ度agvhd组，而ⅰ～ⅰ和ⅲ～ⅲ度agvhd组之间cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的数量差异无统计学意义。
50.实验例2：tim-3
+
cd8
+
t细胞的相关性分析
51.本实验例提供了tim-3
+
cd8
+
t细胞与cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的相关性分析，以实验例1中发生agvhd的患者为研究对象，使用spss22.0软件分析斯皮尔曼(spearman)相关性，确定cd8
+
t细胞与tim-3
+
cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞与颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞与穿孔素
+
cd8
+
t细胞的相关性的显著性，其中，cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的表达量通过实验例1得到，相关性分析结果如图3所示。
52.由于agvhd的发病机制为颗粒酶b和穿孔素对靶组织器官和细胞的攻击，因此图3显示了agvhd患者的颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞水平与tim-3
+
cd8
+
t细胞百分比呈正相关(r＝0.475,p《0.05)，cd8
+
t细胞与tim-3
+
cd8
+
t细胞百分比、穿孔素
+
cd8
+
t细胞与tim-3
+
cd8
+
t细胞百分比无统计学意义的相关性。
53.实验例3：agvhd分级的单因素分析
54.本实验例提供了agvhd分级的单因素分析，以实验例1中发生agvhd的患者为研究对象，以连续变量(年龄、cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞)和分类变量(性别、移植术前疾病风险)为自变量，结局因变量为ⅰ～ⅰ和ⅲ～ⅲ度agvhd，其中，cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的表达量通过实验例1得到，使用spss22.0软件进行统计，分析结果如表1所示。
55.表1显示了高水平的tim-3
+
cd8
+
t细胞(or＝2.059,95％ci＝1.081～3.922,p＝
0.028)是agvhd严重程度的危险因素。
56.表1.单因素分析危险因素对agvhd严重程度的影响
[0057][0058]
对比例1：一种诊断标志物
[0059]
本对比例提供了一种诊断标志物，所述诊断标志物为cd8
+
t细胞。
[0060]
对比例2：一种诊断标志物
[0061]
本对比例提供了一种诊断标志物，所述诊断标志物为颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞。
[0062]
对比例3：一种诊断标志物
[0063]
本对比例提供了一种诊断标志物，所述诊断标志物为穿孔素
+
cd8
+
t细胞。
[0064]
对比例4：一种诊断标志物
[0065]
本对比例提供了一种诊断标志物，所述诊断标志物为tim-3
+
cd8
+
t细胞。
[0066]
对比例5：一种联合诊断标志物
[0067]
本对比例提供了一种联合诊断标志物，所述联合诊断标志物为cd8
+
t细胞和tim-3
+
cd8
+
t细胞。
[0068]
对比例6：一种联合诊断标志物
[0069]
本对比例提供了一种联合诊断标志物，所述联合诊断标志物为穿孔素
+
cd8
+
t细胞和tim-3
+
cd8
+
t细胞。
[0070]
对比例7：一种联合诊断标志物
[0071]
本对比例提供了一种联合诊断标志物，所述联合诊断标志物为穿孔素
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞。
[0072]
实验例4：roc分析
[0073]
本实验例提供了roc分析，以实验例1中的所有agvhd患者为研究对象，使用spss22.0软件绘制roc曲线，预测实施例1和对比例1～7对agvhd严重程度的诊断价值，agvhd的诊断和分级标准根据实验例1所述，cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞的表达量通过实验例1得到，i～ii度为轻度，iii～iv度为重度，roc分析结果如图4所示。
[0074]
图4中，分别根据cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例以及tim-3
+
cd8
+
t细胞联合颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例、cd8
+
t细胞联合tim-3
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例、tim-3
+
cd8
+
t细胞联合穿孔素
+
cd8
+
t细
胞占cd8
+
t细胞的比例和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞联合穿孔素
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例的预测对agvhd严重程度的诊断价值。roc分析显示tim-3
+
cd8
+
t细胞水平对agvhd的严重程度具有诊断价值，以tim-3
+
cd8
+
t细胞水平为诊断指标时，曲线下面积(auc)值为0.854，敏感性为0.667，特异性为0.937，诊断重度agvhd的截断值为14.155％(95％ ci＝0.675～1.000，约登指数＝0.604，p《0.05)，而cd8
+
t细胞水平、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞水平和穿孔素
+
cd8
+
t细胞水平为诊断指标时，auc值分别为0.542、0.729、0.604，p均》0.05；当tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞联合诊断时，auc＝0.896，敏感性为0.667，特异性为1；但是当tim-3
+
cd8
+
t细胞和cd8
+
t细胞、tim-3
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞、颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞和穿孔素
+
cd8
+
t细胞联合诊断时均不能提高诊断重度agvhd的特异性。且根据实验例2的结果，联合标志物在cd8
+
t细胞中的水平呈正相关，通常认为存在相同机制的联合诊断无法从不同的发病机制的角度将诊断效果补足，但本发明证实了tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞的联合诊断对于agvhd分级诊断的特异性存在协同效应。综上所述，本发明发现造血干细胞移植后当外周血中tim-3
+
cd8
+
t细胞比例≥14.155％，且颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞比例≥86.195％时具有非常好诊断重度agvhd的效果，为临床的早期干预治疗提供生物学靶标和参考范围。
[0075]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种用于agvhd分级的联合诊断标志物，其特征在于，所述联合诊断标志物包括tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞。2.检测权利要求1所述的联合诊断标志物水平的试剂在制备agvhd分级诊断的产品中的应用。3.一种用于agvhd分级诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测权利要求1所述的联合诊断标志物的水平的试剂。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括靶向tim-3的荧光素标记抗体和靶向颗粒酶b的荧光素标记抗体。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括靶向igg的荧光素标记抗体和靶向cd8
+
t细胞的荧光素标记抗体。6.一种使用权利要求5所述的试剂盒的方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，所述方法为先使用试剂盒中的抗体试剂对待测样本进行处理，再检测待测样本中tim-3
+
cd8
+
t细胞和颗粒酶b
+
cd8
+
t细胞占cd8
+
t细胞的比例。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一：取两支流式试管，将待测样本加入两支流式试管中，在第一试管中加入靶向tim-3的荧光素标记抗体和靶向cd8
+
t细胞的荧光素标记抗体，在第二试管中加入靶向igg的荧光素标记抗体和靶向cd8
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t细胞的荧光素标记抗体，将第二试管作为同型对照，得到两份被标记的待测样本；步骤二：使用破膜剂将两份被标记的待测样本破膜，在第一试管中加入靶向颗粒酶b的荧光素标记抗体，得到两份经破膜的待测样本；步骤三：使用流式细胞分析检测两份经破膜的被标记的待测样本，得到tim-3
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cd8
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t细胞和颗粒酶b
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cd8
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t细胞占cd8
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t细胞的比例。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，使用流式细胞我方案号分析检测包括：使用ssc和fsc设门淋巴细胞，然后设门cd8
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t淋巴细胞，通过同型对照设门分析得到tim-3
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cd8
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t细胞和颗粒酶b
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cd8
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t细胞占cd8
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t细胞的比例。9.如权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于，当检测结果得到待测样品中tim-3
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cd8
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t细胞占cd8
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t细胞的比例≥14.155％，且颗粒酶b
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cd8
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t细胞占cd8
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t细胞的比例≥86.195％时，为ⅲ～ⅲ度agvhd，所述agvhd为单倍体造血干细胞移植后发生的agvhd。10.如权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为外周血。

技术总结
本发明涉及一种用于aGVHD分级的联合诊断标志物及试剂盒，属于生物技术领域。本发明提供了Tim-3


技术研发人员：庞楠楠 王晶 姜敏 李玉娇 谢仁古丽
受保护的技术使用者：新疆医科大学
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/8/9