克氏原螯虾性别决定基因PcWNT2b的克隆及分子标记与应用

克氏原螯虾性别决定基因pcwnt2b的克隆及分子标记与应用
技术领域
1.本发明涉及水产养殖动物分子标记筛选领域，具体涉及克氏原螯虾性别决定基因pcwnt2b的克隆及分子标记与应用。


背景技术：

2.克氏原螯虾(procambarua clarkii)俗称小龙虾，隶属于十足目(decapoda)、螯虾科(ambaridae)，原螯虾属，是我国重要的淡水经济养殖动物。由于味道鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱，成为我国养殖产量第六的水产动物。
3.近些年繁养分离成为国内克氏原螯虾主要的养殖模式，控制养殖密度是该模式下提高养殖效益的有效办法。然而由于克氏原螯虾具有打洞的习性，且具有较强的繁殖能力，很难做到精准放养。养殖户为准确控制养殖密度，提高养殖效益，养殖结束后常常使用药物将养殖池的成虾清除，然而药物的使用，不利于环境的保护也无法有效避免药物残留等一系列问题，因此，如何科学的控制养殖密度仍是克氏原螯虾养殖需要面临的一个重要难题。
4.单性养殖阻断了自然繁殖的可能性，能够有效的控制养殖密度，实现精准投喂，控制养殖成本，提升养殖效益；同时，克氏原螯虾在生长过程中具有明显的性别二态性，雌性较雄性具有更高的含肉率，以及更强的抗病能力，因此开展单性培育是实现精准化养殖，提高经济效益的重要策略之一。
5.单性苗种的培育常常需要技术手段操作获得性逆转的个体，通过为性别决定基因的干扰敲除或过表达是重要的一个手段。然而克氏原螯虾中的性别决定基因还未见报道，通过对性别决定基因的定位与克隆可以加快实现单性品种繁育的步伐。
6.因此本发明基于基因组重测序及图位克隆技术，通过定位性别决定基因，并进一步开发基因内分子标记，这些标记可用于克氏原螯虾的遗传性别鉴定。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于通过基因组重测序及图位克隆得到克氏原螯虾性别决定基因，并基于该性别决定基因开发其基因内分子标记，利用该分子标记对克氏原螯虾雌、雄性鉴定辅助鉴定。
8.本发明的技术方案如下所示：
9.本发明通过克氏原螯虾基因组重测序及图位克隆的方法定位性别决定基因所在区间，并对区间内与性别相关的基因进行克隆和研究。
10.本发明在定位的区间内发现一个在其它物种中报道与雌性性别关联的相关基因，该基因具有wnt基因的保守结构域；
11.申请人将区间内的具有wnt基因保守结构域的性别相关基因命名为pcwnt2b。其cds序列如序列表seq no:1所示；其编码的蛋白质的序列如seq id no:2所示，共编码278个氨基酸残基。
12.在基于cdna序列扩增基因完整dna序列时，申请人在基因内设计了一种能够快速
鉴定克氏原螯虾雌雄遗传性别的分子标记pcsdgm，该分子标记的核苷酸序列如seq no：3所示；
13.具体地，本发明利用所述分子标记鉴定克氏原螯虾雌雄性的辅助筛选上，具体步骤为：
14.以克氏原螯虾基因组dna为模板进行扩增，将得到的测序结果与seq no：3所示的核苷酸序列进行比较，若测序序列与所述核苷酸序列相同且峰图为单峰图，判定为雌性；若测序的结果在180bp后出现大面积双峰图，判定为雄性。
15.申请人筛选了一种扩增分子标记pcsdgm，其核苷酸序列为：
16.正向引物5
′‑
gcaacaccgtgattctgtaa-3
′
，(即seq id no:4所示的序列)，反向引物5
′‑
aagcgtctggtccccta-3
′
；(即seq id no:5所示的序列)
17.pcr反应体系：dna模板：2μl，2
×
pcr mix：10μl，正、反向引物各1μl，ddh2o：6μl；
18.pcr反应程序为：95℃，4min；95℃，30s；59℃，30s；72℃；60s，共35个循环；72℃，10min。
19.本发明具有以下优点：
20.(1)本发明定位并克隆了克氏原螯虾性别鉴定的一个决定基因。
21.(2)本发明基于定位到的基因设计了其基因内分子标记，该标记可以快速地对雌雄克氏原螯虾进行性别鉴定的辅助筛选的应用。
附图说明
22.图1：雌、雄性克氏原螯虾分别对应的测序峰图。
23.图2：克氏原螯虾雌雄全基因组重测序后符合雌性纯合，雄性杂合且雌性位点数量为雄性2倍的异位点在基因组上的密度分布图。
24.图3：与性别连锁的染色体lg38与其它常染色体的遗传图谱比较。
25.图4：全同胞家系后代重组数量及lg38上雌雄差异位点分布图。
26.图5：克氏原螯虾pcwnt2b基因在雌雄性腺中的表达量比较。
27.图6：克氏原螯虾pcwnt2b蛋白质的氨基酸多序列比对结果图。
具体实施方式
28.对序列表的说明
29.seq id no:1是克氏原螯虾性别决定基因pcwnt2b的cds序列。
30.seq id no:2是克氏原螯虾性别决定基因pcwnt2b编码的蛋白质序列，共编码278个氨基酸残基。
31.seq id no:3是分子标记pcsdgm以雌性个体基因组dna为模板扩增得到的核苷酸序列。seq id no:4是分子标记pcsdgm的正向引物序列；
32.seq id no:5是分子标记pcsdgm的反向引物序列。
33.seq id no:6是分子标记pcm2876的正向引物序列；
34.seq id no:7是分子标记pcm2876的反向引物序列。
35.seq id no:8是分子标记pcm2878的正向引物序列；
36.seq id no:9是分子标记pcm2878的反向引物序列。
37.seq id no:10是分子标记m前的正向引物序列；
38.seq id no:11是分子标记m前的反向引物序列。
39.seq id no:12是分子标记m后的正向引物序列；
40.seq id no:13是分子标记m后的反向引物序列。
41.实施例1pcwnt2b基因的定位及基因内分子标记的开发
42.本发明通过分别对克氏原螯虾雌雄性混合池基因组进行重测序，与公布的雌性个体参考基因组进行比对挖掘snp变异位点，按照雌性为纯合、雄性为杂合的的条件进行初步筛选，对筛选出来的变异位点的匹配数量进行计数，并根据匹配的数量按照雌性为雄性的2倍的量进行筛选，将筛选到的克氏原螯虾的雌雄差异位点定位在参考基因组上，发现其差异位点主要定位在lg38上，并且主要集中在11mb～12mb的区间内。
43.基于已经公布的克氏原螯虾的参考基因组序列，在lg38上设计ssr标记，利用1个克氏原螯虾全同胞家系分别构建lg10、lg19、lg38、lg73(构建过程省略，构建方法为通用方法)局部遗传连锁图谱(见图3)，对性别决定基因进行精细定位。
44.在构建lg38染色体局部遗传连锁图谱过程中通过同其它染色体进行比较发现该染色体上存在重组抑制的现象，最终将性别决定区间定位在2.2mb～15.7mb内。
45.利用lg38上开发的性别特异分子标记筛选克氏原螯虾的自然个体，其中命名为pcm2876、pcm2878这2个分子标记在10mb～12mb的区间内，它们的核苷酸序列分别如下所示：
46.pcm2876标记引物
47.正向引物f：5
′‑
cacgcctccattaaaaggtc-3
′
(即seq no：6所示的序列)
48.反向引物r：5
′‑
tgtaaaggccattgttgcag-3(即seq no：7所示的序列)
49.pcm2878标记引物
50.正向引物f：5
′‑
gctggacaggaatgtcacaa-3
′
(即seq no：8所示的序列)
51.反向引物r：5
′‑
gttaaggacctgcccgaaa-3
′
(即seq no：9所示的序列)
52.上述2组性别特异ssr标记引物的特点在于，以基因组dna为模板，将扩增后pcr产物经4％ page胶检测后，银染显色，读取带型。证明雄性克氏原螯虾与雌性克氏原螯虾相比，雄性克氏原螯虾显示为1条特异带型，即根据pcm2876、pcm2878这2个分子标记引物扩增条带，可以用于辅助鉴定克氏原螯虾的性别。
53.pcr体系：buffer：4μl，正、反引物各1μl，dntp：0.2μl，r-taq酶：0.1μl，ddh2o：11.7μl。
54.pcr反应程序：95℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min。
55.利用pcm2876、pcm2878等多个性别特异分子标记对1249尾雌性克氏原螯虾和1248尾雄性克氏原螯虾进行鉴定，发现其中pcm2876标记引物在雌性克氏原螯虾中未发现重组个体；在雄性克氏原螯虾中发现126个重组个体；pcm2878标记引物在雌性克氏原螯虾中发现3个重组个体，在雄性克氏原螯虾中发现81个重组个体。
56.wnt家族基因在众多物种中被报道具有决定雌性性别的作用。在2个性别特异性分子标记引物pcm2876、pcm2878之间发现1个具有wnt保守结构域的基因，申请人将性能显著的标记命名为pcwnt2b，并将其作为克氏原螯虾的性别决定基因候选基因片段。
57.基于ncbi数据库中提供的克氏原螯虾参考基因组序列及课题组前期转录组数据
中的已知序列，本实施例设计了一组引物扩增pcwnt2b基因的全长cds序列。具体步骤如下：
58.(1)利用trizol溶液(invitrogen)提取克氏原螯虾雌性卵巢的总rna；利用商业反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)反转录，得到对应的cdna。
59.(2)以转录组和参考基因组提供的序列，利用primer3软件设计引物，以克氏原螯虾卵巢组织的cdna为模板对wnt2b基因的全长进行扩增，利用2对引物m前、m后(序列如seq no：10-seq no：13所示)进行pcr扩增后，拼接2对引物对应的序列，获得其包含完整orf的cds序列，其核苷酸序列如序列表seq no：1所示，该基因对应的氨基酸序列如seq no：2所示；
60.(2)扩增wnt2b基因的cds序列时所使用的引物如下：
61.m前：
62.正向引物f：5
′‑
cctagctcgtatcatgtcctctcct-3
′
，(即seq no：10所示的序列)反向引物r：5
′‑
aagtccttcttcctgggttttttg-3
′
。(即seq no：11所示的序列)
63.m后：
64.正向引物f：5
′‑
ggctgctctgacaacatccg-3
′
，(即seq no：12所示的序列)反向引物r：5
′‑
gaatcctaaagtcacgacacacgg-3
′
。(即seq no：13所示的序列)
65.pcr反应体系：cdna模板：2μl；2
×
pcr mix：10μl，正、反向引物各1μl，ddh2o：6μl；
66.pcr反应程序：95℃，4min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；共35个循环；72℃，10min；
67.基于ncbi数据库中提供的克氏原螯虾参考基因组序列以及扩增获得的cds序列，设计引物扩增其全长dna序列。
68.在pcwnt2b基因内设计(标记)引物pcsdgm，正向引物5
′‑
gcaacaccgtgattctgtaa-3
′
(seq no：4)，反向引物5
′‑
aagcgtctggtccccta-3
′
(seq no：5)，扩增得到的核苷酸序列如seq no：3所示。
69.其中引物pcsdgm在以基因组dna为模板进行扩增时，将pcr产物送往商业公司进行纯化后测序，测序结果显示其在雌性中扩增为单峰图，且序列与seq no：3所示序列相同，而雄性中在180bp后出现大面积双峰图。因此将pcsdgm作为判断雌雄性别的1个分子标记。
70.以pcm2876、pcm2878这2个分子标记筛选出的重组个体的基因组dna为模板，使用引物pcsdgm进行扩增，发现所有个体均未违背雌性中测序结果为单峰，雄性测序结果为双峰的规律，因此确认pcwnt2b片段(即标记)与性别发生共分离。本实施例将pcwnt2b片段确定为克氏原螯虾的性别决定基因。
71.实施例2pcwnt2b在克氏原螯虾雌雄性腺中的表达差异
72.取5g左右的克氏原螯虾幼虾的性腺组织，雌、雄各3尾，利用trizol溶液(购买自invitrogen公司)提取精巢和卵巢总rna，利用反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)获得对应的cdna。以精巢组织cdna为模板，利用m前、m后2对引物(引物序列分别如seq no.10-seq no.13所示)对cds区域进行扩增，纯化测序后与克氏原螯虾雌性卵巢组织的cds序列进行比较，发现雌、雄性的cds序列无差别。
73.以上述获得的精巢cdna和卵巢cdna为模板，利用引物q-wnt对pcwnt2b在雄性和雌性性腺中的表达差异进行分析，发现pcwnt2b在雌性卵巢中的表达量接近于雄性精巢的2倍(见图5)，说明pcwnt2b是由于在雌、雄中表达剂量不同导致的性别差异。猜测pcwnt2b基因
在性别分化时，雌性中表达量高于雄性，从而控制克氏原螯虾朝雌性分化，与其它物种中报道的wnt基因控制雌性性别的规律相吻合。
74.q-wnt引物序列如下：
75.f：5
′‑
tcttatgaacctccacaaca-3
′
；
76.r：5
′‑
aagtccttcttcctgggttttttg-3
′
。
77.实施例3序列同源性比较
78.从ncbi genebank数据库中搜索下载其它甲壳动物的wnt2、wnt2b氨基酸序列及报道wnt4具有性别决定作用的物种的wnt4的氨基酸序列，利用cluster x多序列比对软件对克氏原螯虾pcwnt2b基因进行同源性分析。发现pcwnt2b基因与人类和小鼠的wnt4基因的氨基酸具有相似的wnt保守结构域。

技术特征：
1.一种克隆的克氏原螯虾性别决定基因pcwnt2b，其特征在于，该基因的核苷酸序列是序列表seq no：1中第1-1020bp所示的序列。2.权利要求1所述的基因的分子标记pcsdgm，其特征在于，该分子标记的核苷酸序列如seqno：4和seq no：5所示。3.权利要求1所述的一种克隆的克氏原螯虾性别决定基因pcwnt2b在克氏原螯虾雌、雄性鉴定中的应用。4.权利要求2所述的分子标记pcsdgm在克氏原螯虾雌、雄性鉴定中的应用，其特征在于，该分子标记的核苷酸序列如序列表seq no：4和seq no：5所示，经pcr扩增后，和对所得产物进行纯化测序，若测序峰图为单峰且与seq no：3所示的核苷酸片段序列相同的判定为雌性，若测序结果在180bp后的峰图为双峰，判定为雄性。5.权利要求3所述分子标记pcsdgm的引物，其特征在于，该引物对的核苷酸序列如下所述：正向引物f：5
′‑
gcaacaccgtgattctgtaa-3
′
，反向引物r：5
′‑
aagcgtctggtccccta-3
′
。

技术总结
本发明属于水产养殖动物分子标记筛选领域。具体涉及克氏原螯虾性别决定基因PcWNT2b的克隆及分子标记与应用。通过对克氏原螯虾雌雄个体比较重测序及图位克隆，确定性别决定基因所在的区间，并获得区间内1个性别相关的基因，将该基因命名为PcWNT2b，该基因CDS序列如SEQ NO：1，蛋白质序列如SEQ NO：2，以该基因DNA序列设计分子标记PcSDGM，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3。以基因组DNA为模板进行扩增，对PCR产物进行纯化测序，测序结果与SEQ NO:3比对，若序列相同且峰图为单峰判定为雌性，若前180bp相同，峰图为双峰，判定为雄性。该基因定位为克氏原螯虾单性育种奠定了基础。氏原螯虾单性育种奠定了基础。


技术研发人员：白旭峰 彭波 孙俊霄 谭云飞 邢永忠
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2023.02.15
技术公布日：2023/8/9