一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法与流程

1.本发明涉及一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，属于兽用生物制品技术领域。


背景技术：

2.口蹄疫(foot-and-mouth disease，fmd)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染的动物疫病，是偶蹄动物的一种急性烈性传染病，该传染病可快速远距离传播。猪、牛、羊等偶蹄类动物易感。国际动物卫生组织(oie)将该传染病列在法定上报的动物传染病之首，我国也将其排在一类动物传染病的首位。
3.口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，该病毒属于rna单链病毒。目前，根据血清型划分共分为：a、o、c、asia1、sat1、sat2和sat3 7个血清型，虽然各型病毒引起的发病症候相同，但各血清型间无交叉免疫，病后康复或免疫动物仍可感染其它血清型病毒而发病。
4.fmdv呈二十面体对称结构，直径25nm，内含由约8500核苷酸组成的正极性的单链rna分子。该rna分子编码的蛋白如图1所示，其中在成熟过程中，蛋白质p1在2a辅助下被蛋白酶3c剪切成称作vp0、vp1和vp3的三个蛋白质。vp0、vp1和vp3的单拷贝形成5s原体，5个拷贝的5s原体随后形成了12s五聚体，12个12s五聚体组装成二十面体对称的75s空衣壳。5s原体形成以后，在rna包衣壳过程中，vp0裂解成vp4和vp2。但在rna分子不出现在病毒衣壳内部时，也可以形成病毒衣壳，该病毒空衣壳也可称为口蹄疫病毒样颗粒(vlp)。
5.目前，传统疫苗都是病毒灭活疫苗，但这些疫苗在口蹄疫的防治中存在着很多不足，主要表现在：难于进行感染动物和免疫动物的鉴别诊断；在疫苗的生产过程中，大量增殖自然病毒，需要严格的防范病毒扩散的设施，但是仍然存在病毒逃逸和病毒灭活不完全而散毒的可能性。
6.口蹄疫病毒样颗粒(vlp)具有与完整病毒相同的免疫学特性，但不存在散毒的风险，因而利用各种表达系统生产fmdv的空衣壳一直是国内外研究的热点。
7.在cn109601007b中公开了先用中空纤维柱超滤浓缩含有口蹄疫vlp，然后用梯度蔗糖溶液超速离心纯化得到口蹄疫vlp，或者超滤浓缩液用两次柱层析，第一次用sepharose 6 ff柱，第二次用captoq impres离子交换层析柱得到纯化的vlp，梯度蔗糖溶液超速离心纯化不利于规模化生产，并且工艺繁琐，另外用两次层析纯化的方法，同样操作过程繁琐，并且蛋白得率也不高。
8.在cn110777160a中公开了，含有p1-2a的细胞裂解上清液先用硫酸铵分级沉淀法进行蛋白初步纯化，然后用亲和色谱层析纯化，得到p1-2a，然后3c蛋白酶酶解，得到酶解液在20mm磷酸缓冲液ph8.0、150mm nacl中透析组装形成口蹄疫病毒样颗粒，然后进行分子筛色谱纯化，分子筛纯化上样量较少，不利于规模化生产。
9.在cn104404074b中公开了将获得带sumo标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp3，vp1，vp0)样品在4℃酶切12小时后进行下一步的分子筛色谱纯化，分子筛纯化上样量较少，不利于规模化生产。
10.在cn110981946a中公开了用大肠杆菌表达，镍柱纯化获得带有sumo标签的三种蛋白smtvp0、smtvp3、和smtvp1，然后加入小泛素样修饰蛋白酶进行酶切，再通过用8～20k膜包循环透析组装病毒样颗粒。该方法使用膜包透析的方法，不能够有效去除酶切后的sumo标签及小泛素样修饰蛋白酶，可能对产品质量产生影响。
11.在cn101914501b中公开了通过大肠杆菌表达带有sumo标签的三种蛋白，镍柱纯化后通过小泛素样修饰蛋白酶进行酶切，再经镍柱去除小泛素样修饰蛋白酶，并通过透析的方法进行病毒样颗粒的组装，透析的方法不适合规模化生产。
12.综上所述，在现有技术中，对于口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)的纯化，操作复杂，不利于规模化生产，并且纯度和得率不高。


技术实现要素：

13.在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷，提供了一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，所述纯化方法包括如下步骤：1)将含有p1-2a的融合蛋白用3c和tev蛋白酶进行酶切，以得到酶切液；2)再将步骤1)中所述酶切液通过镍柱进行镍柱纯化，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体；3)将步骤2)中所述口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体在脱盐柱去除咪唑可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒vlps。
14.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤1)中，加入所述3c蛋白酶的质量为所述含有p1-2a的融合蛋白总质量的5～10％，优选7％；加入tev蛋白酶的量为所述含有p1-2a的融合蛋白总质量的4-6％，优选为5％。
15.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤1)中，所述含有p1-2a的融合蛋白为tf-tev-p1-2a-6arg-6his融合蛋白或tf-tev-p1-2a-6arg融合蛋白。
16.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤2)中，所述镍柱填料为ge ff ni sepharose 6 fast flow、cytiva ff ni sepharose 6 fast flow、ni-ted purose 6 fast flow。
17.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤2)中，在所述酶切液通过镍柱ge ff ni sepharose 6 fast flow或cytiva ff ni sepharose 6 fast flow、后，还包括用低浓度的咪唑洗脱液洗脱镍柱，得到含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体的洗脱液；其中，所述低浓度咪唑洗脱缓冲液为含有10mm-50mm咪唑的50mm磷酸缓冲液。
18.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，所述磷酸缓冲液为nah2po4，ph＝7.4，0.5m nacl。
19.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，所述低浓度咪唑洗脱缓冲液中咪唑的浓度为20～30mm。
20.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，将所述含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体的洗脱液进一步进行透析浓缩，去除咪唑，得到的口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体；所述5s原体在通过脱盐柱去除咪唑可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒vlps。
21.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，步骤2)中，在所述酶切液通过镍柱ni-ted purose 6 fast flow后，还包括收集含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体的流
穿液。
22.在本发明的纯化方法技术方案中，优选地，所述流穿液可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒vlps。
23.在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷，意外发现口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)可和特定的镍柱亲和结合，并且用低浓度的咪唑就可洗脱下来，且纯化后纯度能达到90％以上，得率也在95％以上，还可以清除内毒素；解决了现有技术中，操作复杂不利于规模化生产，且纯度及得率不高的问题。
附图说明
24.图1表示fmdv的分子结构。
25.图2表示sds-page检测tf-tev-p1-2a-6arg-6his融合蛋白酶切后的结果。
26.图3表示sds-page检测tf-tev-p1-2a-6arg-6his融合蛋白酶切纯化后的结果。
27.图4表示采用ge ff填料后，目的蛋白在各阶段的分布。
28.图5表示20mm咪唑洗脱液(透析前)取样分子筛分析结果，显示在17.5处出峰，即为口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体。
29.图6表示20mm咪唑洗脱液(透析后)取样分子筛分析结果，显示在17.5处出峰，即为口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体。
30.图7表示经组装后取样分子筛分析结果。
31.图8表示采用ted填料后，目的蛋白在各阶段的分布。
32.图9表示电镜检测纯化后口蹄疫病毒样颗粒的检测结果。
33.图10表示含有sumo助溶蛋白，采用ge ff填料后，目的蛋白在各阶段的分布。
34.图11表示含有sumo助溶蛋白，经纯化后组装后取样分子筛分析结果。
具体实施方式
35.以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
36.使用试剂均为国产市售产品。
37.根据cn2021111316714.x专利申请制备得到的tf-tev-p1-2a-6arg-6his或者tf-tev-p1-2a-6arg融合蛋白。
38.tev酶制备：具体制备方法参见文献(tropea je1,cherry s,waugh ds，expression and purification of soluble his6-tagged tev protease.methods mol biol.2009；498:297-307)。
39.3c蛋白酶制备：具体制备方法参见文献(james r.birtley,stephen r.knox,et al,crystal structure of foot-and-mouth disease virus 3c protease.the journal of biological chemistry vol.280,no.12.11520
–
11527,2005)。
40.实施例1 tf-tev-p1-2a-6arg-6his融合蛋白酶切
41.收集根据cn2021111316714.x专利申请制备得到的tf-tev-p1-2a-6arg-6his融合蛋白，根据融合蛋白总质量，加入7％(w/w)的3c蛋白酶和5％(w/w)的tev酶，混合后在30
±
1℃酶切16
±
2h小时，得到酶切液，进行下一步镍柱纯化。
42.酶切的鉴定：分别取3c蛋白酶、tev蛋白酶、酶切前样品和酶切后样品各20μl,分别加入5μl的5
×
loading buffer混匀，煮沸10min，然后各取5μl点样于12％sds-聚丙烯酰胺凝胶中，80v恒压跑浓缩胶，120v恒压跑分离胶，随后以考马斯亮蓝染色显示电泳条带，电泳结果见图2所示，其中m为marker，1是3c蛋白酶对照，2是tev蛋白酶对照，3是酶切前样品，4是酶切后样品。从图2中可知，前体蛋白p1-2a酶切完整，酶切后口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)稳定。
43.实施例2酶切液镍柱(ge ff ni sepharose 6 fast flow、cytiva ff ni sepharose 6 fast flow)纯化
44.在大量的实验摸索的前提下，我们发现酶切后不含有6his标签的口蹄疫衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)能够与镍柱(ge ff ni sepharose 6 fast flow或cytiva ff ni sepharose 6 fast flow，生产厂家：厂家为江苏千纯生物科技有限公司)结合，并且用低浓度的咪唑(一般浓度在10mm～50mm，本优先实施例中使用的是20mm～30mm)就可洗脱下来，所述低浓度的咪唑洗脱液为含有10mm～50mm咪唑的50mm磷酸缓冲液。所述磷酸缓冲液为nah2po4，ph＝7.4，0.5m nacl。并且纯化后纯度能达90％以上，得率也在95％以上，且还可以去除内毒素，如图3所示。酶切后样品纯化具体步骤如下：镍柱平衡后，将酶切后的样品进行上样，然后用50mm磷酸缓冲液冲洗平衡，再用20mm～30mm咪唑洗脱缓冲液(50mm磷酸缓冲液，20mm～30mm咪唑)洗脱目的蛋白，即可得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体。
45.结果鉴定：取镍柱纯化后的蛋白20μl，加入5μl的5
×
loading buffer混匀，煮沸10min，然后取5μl点样于12％sds-聚丙烯酰胺凝胶中，80v恒压跑浓缩胶，120v恒压跑分离胶。随后以考马斯亮蓝染色显示电泳条带，电泳结果见图3，其中1是marker，2是镍柱纯化后的蛋白。
46.由图3电泳结果可知，酶切产物经镍柱纯化能完全分离tf伴侣蛋白，酶切后口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)纯度在90％以上，通过计算，酶切纯化后得率在95％以上，基本没有损失(通过比较纯化前后目的蛋白的摩尔比)，并且内毒素含量合格。
47.从图4可以看出，酶切后口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)主要由低浓度的咪唑洗脱液洗脱得到。
48.从图5和图6可以看出，酶切后的目的蛋白自动组装成5s原体。
49.组装：将洗脱后的样品通过脱盐柱去除咪唑后，可自行进行vlps组装，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒(vlps)，分子筛分析图谱见图6，根据图谱vlps的出峰位置在8.3左右，vlps的含量63.4％；并且得到的vlps稳定，在37.5℃下仍可保持vlps，不解聚，保持活性。
50.实施例3：tf-tev-p1-2a-6arg融合蛋白酶切
51.如实施例1的条件对tf-tev-p1-2a-6arg融合蛋白进行酶切，得到含有口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)的酶切液。
52.实施例4：酶切液镍柱(ni-ted purose 6 fast flow)纯化
53.酶切后口蹄疫衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)通过镍柱(ni-ted purose6 fast flow，生产厂家：厂家为江苏千纯生物科技有限公司)后，存在于流穿中，但tf伴侣蛋白、tev蛋白酶、3c蛋白酶及其他杂蛋白能够与镍柱(ni-ted purose 6 fast flow)结合，因此流穿中目的蛋白纯度能达90％以上，得率也在90％以上，如图7所示。酶切后样品纯化具体步骤如下：镍
柱平衡后，将酶切后的样品进行上样，并收集流穿液。
54.结果鉴定：取镍柱纯化后的流穿蛋白20μl，加入5μl的5
×
loading buffer混匀，煮沸10min，然后取5μl点样于12％sds-聚丙烯酰胺凝胶中，80v恒压跑浓缩胶，120v恒压跑分离胶。随后以考马斯亮蓝染色显示电泳条带，电泳结果见图8。
55.由图8电泳结果可知，酶切产物经镍柱纯化能完全分离tf伴侣蛋白，酶切后口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)纯度在90％以上，通过计算，酶切纯化后得率在90％以上。还有少部分挂柱，可以用低浓度咪唑洗脱液洗脱，但经检测内毒素有超标。
56.组装：流穿液可自行进行vlps组装，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒(vlps)；并且得到的vlps稳定，在37.5℃下仍可保持vlps，不解聚，保持活性。
57.实施例5电镜检测纯化后口蹄疫病毒样颗粒检测
58.取组装后的口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)样品10μl加到200目的铜网上，吸附1min后用滤纸吸去多余的样品，超纯水清洗二次，1％醋酸双氧铀清洗一次后负染1min。用透射电镜观察，如图9所示的结果显示：在制得样品中90％以上都形成了vlp，直径约为30nm左右，其中单个颗粒数目较少，多数病毒样颗粒以二聚体，三聚体和多聚体形式存在。
59.实施例6亚单位疫苗制备及免疫实验
60.6.1isa 201vg佐剂(购自法国seppic公司)疫苗制备
61.水相准备：根据疫苗中目的蛋白含量，使用pbs(或生理盐水)将目的蛋白稀释适当浓度，即为水相。油相准备：根据制备疫苗总量，按照抗原相和佐剂重量比为1:1，体积比为46:54，量取适量isa 201vg佐剂。乳化：将水相和油相都预热到33℃，将水相缓缓加到油相中，200～500rpm搅拌20～30min，于20℃静置1h置于4℃过夜。分装、贮存：根据需要进行分装，检合格后于4℃保存备用。
62.6.2免疫实验
63.参见6.1制备3种浓度的疫苗，分别为疫苗1(30μg/头份)、疫苗2(60μg/头份)、疫苗3(100μg/头份)。
64.根据2015版《中华人民共和国兽药典》三部第53页的安全检验和效力检验的方法对上述3种疫苗进行检验，由于口蹄疫病毒为国家管制病毒，故效力检验没有做攻毒实验，仅检测了一免28天的中和抗体。
65.安全检验结果：免疫后的豚鼠和猪只均正常，没有因疫苗免疫而引起的死亡或明显的局部或全身不良反应；因此，这3批疫苗均是安全的。
66.效力检验结果：中和抗体检测结果如下表所示，以中和抗体≥1:32为保护的判定标准计算疫苗免疫后的pd50，其中疫苗1的pd50为6.4，疫苗2和疫苗3的pd50均为7.6，都能达到目前国家口蹄疫疫苗效检标准(pd50≥6)，因此，这三批疫苗效检都是合格的，且疫苗2和疫苗3的保护率一致，均比疫苗1要好；另外，从效价高低来看，随着免疫剂量的增大，效价有所提高，但幅度不明显，特别是疫苗2和疫苗3；因此综合考虑成本和效果，选择疫苗2作为理想的疫苗进行后续研究和工业化生产。
[0067][0068][0069]
对比例：sumo-tev-vp0/sumo-tev-vp1/sumo-tev-vp3纯化
[0070]
根据cn101914501b制备得到sumo-tev-vp0/sumo-tev-vp1/sumo-tev-vp3的融合蛋白，如实施例1的条件进行酶切，得到含有口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)的酶切液。
[0071]
如实施例2的条件对酶切后的样品进行镍柱纯化，得到的口蹄疫病毒衣壳蛋白(vp0，vp1，vp3)纯度在90％以上，见图10。
[0072]
组装：将洗脱后的样品通过脱盐柱去除咪唑进行vlps组装，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒(vlps)，分子筛分析图谱见图11，根据图谱vlps的出峰位置在8.6左右，vlps的含量15.7％，还有大量的5s原体未能组装成vlps，得到的vlps在37.5℃下解聚，不能保持vlps形态。
[0073]
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

技术特征：
1.一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：1)将含有p1-2a的融合蛋白用3c蛋白酶和tev蛋白酶进行酶切，以得到酶切液；2)再将步骤1)中所述酶切液通过镍柱进行镍柱纯化，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体；3)将步骤2)中所述口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒vlps。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，加入所述3c蛋白酶的质量为所述含有p1-2a的融合蛋白总质量的5～10％，优选7％，加入tev蛋白酶的量为所述含有p1-2a的融合蛋白总质量的4-6％，优选为5％。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述含有p1-2a的融合蛋白为tf-tev-p1-2a-6arg-6his融合蛋白或tf-tev-p1-2a-6arg融合蛋白。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，所述镍柱填料为ge ff ni sepharose 6fast flow、cytiva ff ni sepharose 6fast flow、ni-ted purose 6fast flow。5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，在所述酶切液通过镍柱ge ff ni sepharose 6fast flow或cytiva ff ni sepharose 6fast flow后，还包括用低浓度的咪唑洗脱液洗脱镍柱，得到含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体的洗脱液；其中，所述低浓度咪唑洗脱缓冲液为含有10mm～50mm咪唑的50mm磷酸缓冲液。6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液为nah2po4，ph＝7.4，0.5m nacl。7.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述低浓度咪唑洗脱缓冲液中咪唑的浓度为20～30mm。8.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，将所述洗脱液进一步进行透析换液去除咪唑，得到的口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体，然后可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒vlps。9.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，步骤2)中，在所述酶切液通过镍柱ni-ted purose 6fast flow后，还包括收集含有口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5s原体的流穿液。10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于，所述流穿液可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒vlps。

技术总结
本发明提供了一种口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒的纯化方法，所述纯化方法包括如下步骤：将含有P1-2A的融合蛋白用3C和TEV蛋白酶进行酶切，以得到酶切液；再将所述酶切液通过镍柱进行镍柱纯化，得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒5S原体；然后可自行组装得到口蹄疫病毒衣壳蛋白病毒样颗粒VLPs。本发明的纯化方法纯化后纯度能达到90％以上，得率也在95％以上。得率也在95％以上。


技术研发人员：张强 吴有强 钱泓 白志军 闻雪 贾宝琴 徐玉兰 宋宇锋
受保护的技术使用者：浙江海隆生物科技有限公司
技术研发日：2022.01.30
技术公布日：2023/8/9