藏红花发酵物、含此的具控油及祛红功效的皮肤外用组成物及其用途的制作方法

1.本发明是有关于一种藏红花发酵物，特别是一种藏红花发酵物、含此的具控油及祛红功效的皮肤外用组成物及其用途。


背景技术：

2.皮肤分为真皮层及表皮层，其中表皮层位于真皮层外，是皮肤最外层的组织，且是防止体内水分散失的重要屏障。为了维持表皮层的水分，表皮层的细胞分泌天然保湿因子于细胞间，从而抓住水分子。其次，真皮层中的皮脂腺分泌皮脂至表皮层外，进而防止表皮层水分大量散失。然而，如果皮脂分泌过多，皮脂容易累积于毛孔，从而导致皮肤出油、发炎、粉刺、黑头或者等皮肤问题。
3.上述真皮层具有许多皮肤附属器，包含皮脂腺及微血管。真皮层中的微血管负责皮肤的营养供应及废物移除，且可借由扩张或收缩协助调节体温。在正常的状况下，真皮层中的微血管不易观察，但如果微血管过度扩张、皮肤发炎及/或变薄，皮肤会出现红血丝症状，甚至伴随发热、搔痒及泡疹等症状。皮脂分泌过多及皮肤出现红血丝症状等问题都会对外观造成影响，甚至产生皮肤搔痒、疼痛等不适症状，是常见的皮肤问题。
4.藏红花(crocus sativus)是一种鸢尾科(iridaceae)藏红花属(crocus)的多年生球茎草本植物。藏红花的雌蕊柱头含有藏红花素、藏红花酸、藏红花酸二甲酯、藏红花苦素及维生素b2等活性物质，具有抑制癌细胞(如：血癌、乳头癌、扁平细胞瘤及软组织肉瘤)、促进血液循环及/或抗氧化等功效，常用于增加人体免疫力、降低胆固醇、月经失调及/或改善心脑血管疾病等，是名贵的药材、食品香料及化妆品及/或染料的珍贵原料。然而，1朵藏红花仅有3个雌蕊柱头，约16000朵藏红花才能获得100g的雌蕊柱头，从而限制了藏红花的应用。此外，藏红花的花朵(包含花瓣及花蕊)对于皮肤的功效则少有研究。


技术实现要素：

5.因此，本发明的一态样是提供一种藏红花发酵物，其利用酵母对含有藏红花(crocus sativus)的发酵基质进行发酵步骤后制得。藏红花发酵物含有丰富的羟基红花黄色素a，且对皮肤具控油及/或祛红等功效。
6.本发明的又一态样是提供一种具控油功效的皮肤外用组成物，可包含但不限于藏红花发酵物做为有效成分。
7.本发明的再一态样是提供一种具祛红功效的皮肤外用组成物，可包含但不限于藏红花发酵物做为有效成分。
8.本发明的另一态样是提供一种藏红花发酵物用于制备具控油及祛红功效的皮肤外用组成物的用途，其中皮肤外用组成物可包含但不限于藏红花发酵物做为有效成分。
9.根据本发明的上述态样，提出一种藏红花发酵物，其由发酵基质经发酵步骤而制得，其中发酵基质由藏红花及水所组成，且藏红花可例如为干燥花朵。发酵步骤利用酵母于
20℃至50℃的温度进行10小时至50小时。酵母可例如为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center，cgmcc)c-lye-6，且保藏编号为cgmcc no.22020。藏红花发酵物可包含但不限于2.5μg/ml至3.5μg/ml的羟基红花黄色素a。
10.根据本发明的一实施例，藏红花发酵物可选择性包含2.0mg/ml至8.0mg/ml的蛋白质、2.0mg/ml至10.0mg/ml的粗多糖、0.5mg/ml至3.0mg/ml的总黄酮及/或0.1mg/ml至1.0mg/ml的总酚。根据本发明的一实施例，藏红花发酵物的ph值可例如为4.5至6.8。根据本发明的一实施例，藏红花及水的重量体积比(g:ml)可例如为2～10:100～300。根据本发明的一实施例，酵母的菌体浓度可例如为105菌落形成单位(colony forming unit，cfu)/ml至108cfu/ml。根据本发明的一实施例，藏红花及酵母的重量体积比(g:ml)可例如为2～20:5～10。
11.根据本发明的又一态样，提出一种具控油功效的皮肤外用组成物，可包含但不限于上述藏红花发酵物做为有效成分。根据本发明的再一态样，提出一种具祛红功效的皮肤外用组成物，可包含但不限于上述藏红花发酵物做为有效成分。
12.根据本发明的另一态样，提出一种藏红花发酵物用于制备具控油及祛红功效的皮肤外用组成物的用途，其中皮肤外用组成物可包含但不限于上述藏红花发酵物做为有效成分。根据本发明的一实施例，藏红花发酵物可选择性具抗氧化的功效。
13.应用本发明的藏红花发酵物，其利用酵母对含藏红花的发酵基质进行发酵步骤而制得，可包含但不限于丰富的羟基红花黄色素a，具有抗氧化活性，且对皮肤具控油及祛红功效，而可做为皮肤外用组成物的有效成分。
附图说明
14.为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下：
15.图1a至图1c分别为绘示根据本发明的一实施例的羟基红花黄色素a标准品、藏红花发酵物及藏红花水煮液的hplc谱图。
16.图2是绘示根据本发明的一实施例的不同浓度的藏红花发酵物及藏红花水煮液对dpph自由基清除率的折线图。
17.图3是绘示根据本发明的一实施例的不同浓度的藏红花发酵物及藏红花水煮液对羟自由基清除率的折线图。
18.图4是绘示根据本发明的一实施例的对照区域及受试区域的皮肤连续涂抹藏红花发酵物不同时间后的皮脂含量的柱形图。
19.图5a至图5j是分别显示根据本发明的一实施例的不同受试者皮肤未涂抹藏红花发酵物及皮肤连续涂抹藏红花发酵物14天后的受试区域照片。
20.图6是绘示根据本发明的一实施例的受试者皮肤未涂抹藏红花发酵物及连续涂抹藏红花发酵物14天后的红血丝平均值的折线图。
具体实施方式
21.本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包含复数引用，除非上下文另有
明确规定。数值范围(如10％～11％的a)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％≤a≤11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的b，或0.2％以下的b)，则皆指其下限值可能为0(即0％≤b≤0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。
22.如前所述，本发明提供一种藏红花发酵物、含此的具控油及祛红功效的皮肤外用组成物及其用途，其利用酵母对含有藏红花(crocus sativus)的发酵基质进行发酵步骤后获得，其中藏红花发酵物含有丰富的羟基红花黄色素a(hydroxysafflor yellow a)，具有抗氧化活性，且对皮肤具控油及祛红等功效。
23.详细而言，上述发酵基质可例如为由藏红花及水所组成。在一实施例中，藏红花可例如新鲜花朵经干燥处理后获得的干燥花朵。在一实施例中，藏红花可包含但不限于花瓣及花蕊，且可选择性包含花梗。在一实施例中，干燥处理的方法不限，可利用现有方法进行，如：阴干法、日光曝晒法、高温烘烤法、冷冻干燥法、真空干燥法及喷雾干燥法等。在一具体例中，干燥方法可例如为日光曝晒法，其将藏红花曝晒于烈日下数小时。阳光中具有紫外线及远红外线，因此借由日光曝晒法，不仅可移除藏红花的水分，还可抑制微生物的生长，从而避免藏红花变质腐化。其次，日光曝晒法的温度为约50℃，其是低于高温烘烤法的温度，其中高温烘烤法进行时，会将烘箱设定于80℃至90℃，使烘箱维持在60℃至70℃的温度，但烘箱为密闭空间，因此烘箱中的温度有时会超过70℃，从而破坏藏红花的活性物质(如：藏红花素及/或酚类物质)。因此，日光曝晒法可在进行发酵步骤前，尽量保留藏红花的活性物质。
24.上述酵母的菌株不限，可例如为酿酒酵母(又称为啤酒酵母，saccharomyces cerevisiae)。在一实施例中，酿酒酵母可例如为菌株c-lye-6，其于2021年03月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center，cgmcc，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，且保藏编号为cgmcc no.22020。在一实施例中，酿酒酵母可例如为保藏于美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)，且其保藏编号为atcc2367。
25.在一实施例中，在进行发酵步骤前，可选择性先对酵母进行前处理，其中前处理可例如利用液态培养基进行第一液态培养步骤，以使酵母活化，从而获得第一培养物。接着，将第一培养物涂布于固态培养基上进行固态培养步骤，从而获得单一菌落。然后，将单一菌落接种至液态培养基以进行第二液态培养步骤，从而获得酵母菌液，其中此酵母菌液在600nm下光密度(optical density，od)为0.5至1.0，且酵母菌液浓度相当于105菌落形成单位(colony forming unit，cfu)/ml至108cfu/ml。酵母经前处理后，处于对数期而具较佳的活性。补充说明的是，上述液态培养基及固态培养基可例如为现有培养基。在一具体例中，液态培养基为马铃薯葡萄糖培养液(potato dextrose broth，pdb)。在一具体例中，固态培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，pda)。在一实施例中，上述第一液态培养步骤、固态培养步骤及第二液态培养步骤的温度不限，可例如为20℃至50℃进行，如25℃至45℃，或30℃至40℃。
26.发酵步骤中，藏红花及水的重量体积比、藏红花及酵母的重量体积比、发酵步骤的温度及时间可影响藏红花发酵物的品质。本文所述的藏红花发酵物的品质指藏红花发酵物的ph值、粘度、具控油及/或祛红功效的活性物质的含量。在一实施例中，藏红花发酵物的ph
值可例如为4.5至6.8，接近皮肤表面的ph值，故藏红花发酵物涂抹于皮肤后，仍可维持皮肤表面的正常菌相之平衡，对皮肤温和不刺激。在一实施例中，藏红花发酵物的粘度可例如为10cp至15cp，以避免藏红花发酵物起屑或析出沉淀物，且使藏红花发酵物的触感清爽不粘腻。
27.本文所述的“具控油及/或祛红功效的活性物质”可包含但不限于羟基红花黄色素a，其是一种类黄酮衍生物，具有单查尔酮苷类结构。羟基红花黄色素a是菊科植物红花(carthamus tinctorius)的主要活性物质，然而藏红花是否含有羟基红花黄色素a则少有研究。经管柱层析分析，相对于未经发酵步骤的藏红花水煮液，发酵基质经发酵步骤制得的藏红花发酵物的羟基红花黄色素的a含量增加33.03％。在一实施例中，藏红花发酵物的羟基红花黄色素a的含量可例如为2.5μg/ml至3.5μg/ml。如果藏红花发酵物的羟基红花黄色素a的含量小于2.5μg/ml，则藏红花发酵物的控油及/或祛红功效不佳。延长发酵步骤或可增加藏红花发酵物的羟基红花黄色素a的含量，但如果发酵步骤超过50小时，酵母的活性会降低，导致羟基红花黄色素a的含量无法再增加。
28.补充说明的是，羟基红花黄色素a具抗氧化及/或抗发炎活性。因此，藏红花发酵物的羟基红花黄色素a的含量较高，意味着藏红花发酵物的抗氧化/或抗发炎活性佳，其中本文所述的“抗氧化活性”是指清除自由基的活性。自由基的形式不限，可例如为氢自由基、氯自由基、甲基自由基、四甲基哌啶自由基、1,1-二苯-2-三硝苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，dpph)及/或羟自由基或自由基。在一具体例中，红花发酵物的抗氧化活性以dpph自由基及/或羟自由基清除百分比评估。经自由基清除实验证实，相对于未经发酵步骤的藏红花水煮液，藏红花发酵物的dpph自由基及/或羟自由基活性较藏红花水煮液佳，证实藏红花发酵物具较佳的抗氧化活性。
29.在一实施例中，具控油及/或祛红功效的活性物质可选择性包含蛋白质、粗多糖、总黄酮及/或总酚。在一实施例中，藏红花发酵物可选择性包含2.0mg/ml至8.0mg/ml的蛋白质、2.0mg/ml至10.0mg/ml的粗多糖、0.5mg/ml至3.0mg/ml的总黄酮及/或0.1mg/ml至1.0mg/ml的总酚。蛋白质、粗多糖、总黄酮及/或总酚的含量在上述范围中，可使藏红花发酵物对皮肤具有较佳的控油及/或祛红功效。补充说明的是，经检测证实，相对于未经发酵步骤的藏红花水煮液，发酵基质经发酵步骤制得的藏红花发酵物的总黄酮的含量增加28.60％，证实发酵步骤可增加藏红花发酵物的总黄酮的含量。
30.在一实施例中，藏红花发酵物的品质受到酵母的活性的影响。上述酵母的活性是指酵母的生长活性及/或产生具控油及/或祛红功效的活性物质的活性。如果酵母的活性不佳，则具控油及/或祛红功效的活性物质的含量将不足，导致藏红花发酵物控油及/或祛红功效不佳。
31.在一实施例中，发酵步骤的温度可例如为20℃至50℃，如：25℃至45℃，或30℃至40℃。如果发酵步骤的温度是低于20℃，则酵母的活性不佳。如果发酵步骤是在高于50℃的温度下进行，则酵母可能会失去活性，甚至死亡。
32.在一实施例中，发酵步骤的时间可例如为10小时至50小时，如：40小时至50小时，或45小时至48小时。如果发酵步骤的时间是少于10小时，则制得的藏红花发酵物所含的具控油及/或祛红功效的活性物质将不足。相反地，如果发酵步骤的时间是多于50小时，则藏红花发酵物中将累积过多的酵母代谢物，从而酸化藏红花发酵物及/或抑制酵母的活性，且
有杂菌生成的疑虑。
33.在一实施例中，藏红花及水的重量体积比(g:ml)可例如为2～10:100～300，如：4～8:300，或者6:300，使制得的藏红花发酵物的粘度维持在较佳的范围。在一实施例中，藏红花对酵母的重量体积比(g:ml)可例如为2～20:5～10，然以3～5:5为较佳，以使酵母具有较佳的活性。
34.在一实施例中，可选择性对藏红花发酵物进行发酵步骤、固液分离步骤及/或灭菌步骤。上述固液分离步骤可例如以现有方法进行，如：过滤处理、离心处理及蒸馏处理等，以移除藏红花发酵物的杂质。在一示例中，离心处理可例如为以4000rpm至12000rpm的转速进行15分钟至30分钟。在一具体例中，离心处理以4500rpm的转速进行20分钟。上述灭菌步骤可例如利用现有方法进行，如：压蒸汽处理、干热处理及紫外线处理等。在一具体例中，灭菌步骤是利用高压(1.0kg/cm2至1.5kg/cm2)高温(110℃至130℃)的水蒸气进行10分钟至20分钟。
35.利用上述方法制得的藏红花发酵物为浅褐色的半透明液体。其次，基于藏红花发酵物为100重量百分比(wt％)，藏红花发酵物含有0.9wt％至2.0wt％的可溶性固形物，其中可溶性固形物是指藏红花发酵物中所有溶解于水的化合物的总称，包含上述具控油及/或祛红功效的活性物质。
36.经皮肤实验证实，皮肤连续涂抹藏红花发酵物14天后，皮脂含量下降，且红血丝症状改善，证实藏红花发酵物对皮肤具控油及祛红功效。本文所述的藏红花发酵物对皮肤具“控油”功效是指藏红花发酵物涂抹于皮肤后，可降低皮脂分泌量。其中，皮脂分泌量可例如利用皮肤每单位面积的皮脂含量评估。本文所述的“藏红花发酵物对皮肤具祛红功效”是指藏红花发酵物涂抹于皮肤后，可改善皮肤表面红血丝症状。其中，红血丝症状包含皮肤持续性的泛红(例如血红蛋白及/或表皮浮现微血管所致)，且红血丝症状的严重程度可由红血丝平均值量化。具体而言，利用不同波长的光照射皮肤的受试区域所得的影像，可分析血红素(hemoglobin)的吸收光谱，并以受试区域的红血素的浓度平均值定义红血丝平均值(任意单位)，其中红血丝平均值越大，表示受试区域的红血丝症状越严重。
37.其次，经皮肤斑贴实验证实，藏红花发酵物对皮肤具低致敏性。本文所述的“藏红花发酵物对皮肤具低致敏性”是指藏红花发酵物涂抹皮肤经一段时间后，不引起皮肤的红斑、浸润、水肿、丘疹及疱疹等发炎及/或过敏等症状。
38.由此可知，藏红花以酵母进行发酵步骤后，获得的藏红花发酵物对皮肤具控油及祛红功效，意味着发酵步骤可自藏红花保留及/或产生皮肤可吸收并利用的活性物质。值得注意的是，上述制造步骤排除使用有机溶剂，因此可排除有机溶剂残留的问题。其次，藏红花发酵物不需经长时间(如：大于或等于半小时)的高温(如：大于或等于100℃)处理，可避免上述皮肤可吸收并利用的成分遭高温破坏。
39.在一实施例中，藏红花发酵物可做为具控油及/或祛红功效的皮肤外用组成物的有效成分。在一实施例中，上述皮肤外用组成物的剂型可例如为溶液、乳液、乳霜、悬浮液、粉剂、凝胶或浴盐。在一实施例中，上述皮肤外用组成物可例如乳液、化妆水、精华液、隔离霜、洗面奶、面膜或防晒乳，惟本发明不限于此处所举。
40.以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。
41.实施例一、制备藏红花发酵物
42.首先，将酿酒酵母于37℃在pdb中进行第一液态培养步骤，以获得第一菌液。接着，将第一菌液涂布于pda上进行固态培养步骤，以获得单一菌落。然后，将单一菌落接种于pdb中，并于37℃进行第二液态培养步骤，以获得酿酒酵母的第二菌液，其中第二菌液在600nm下光密度为0.5至1.0，相当于含有浓度为105至108cfu/ml的酿酒酵母的活菌。补充说明的是，上述酿酒酵母保藏于cgmcc，且其保藏编号为cgmcc no.22020的菌株c-lye-6，其菌落为点状，表面边缘光滑，颜色呈乳白色而不透明，且以细胞形式单独存在。
43.将6g的藏红花的干燥粉末及300ml的水混合成基质后，加入10ml的酿酒酵母的第二菌液，再于30℃下进行发酵步骤48小时，从而获得藏红花发酵物。接下来，以121℃、1.1kg/cm2的水蒸气对藏红花发酵物进行灭菌步骤达15分钟，再以4500rpm的转速进行离心处理20分钟，确保藏红花发酵物无致病菌检出，且活菌数小于50cfu/ml，以符合化妆品对于生物安全性的规定。
44.上述藏红花发酵物为浅褐色的半透明液体。利用现有方法(如：利用旋转粘度测定计及酸碱度计定法)分析上述藏红花发酵物，藏红花发酵物的粘度为10cp至15cp，且藏红花发酵物的ph值为4.5至6.8。其次，基于上述藏红花发酵物为100wt％，藏红花发酵物包含1.5wt％的可溶性固形物。再者，藏红花发酵物含有1.0mg/ml至5.0mg/ml的蛋白质、0.5mg/ml至5.0mg/ml的粗多糖、1.0mg/ml至10.0mg/ml的总黄酮及/或1.0mg/ml至8.0mg/ml的总酚。值得说明的是，藏红花虽有个体差异，不同批次的藏红花发酵物的粘度、ph值和蛋白质、粗多糖、总黄酮及总酚的含量略有不同，但皆在上述范围内。
45.实施例二、评估基质经发酵步骤及未经发酵步骤的活性物质的含量
46.1.总黄酮的含量
47.以实施例一的藏红花发酵物做为实验样本，并以未经发酵步骤的基质做为对照样本，其中未经发酵步骤的基质是由5g的藏红花的干燥花朵及300ml的水所组成，经灭菌步骤(以121℃、1.1kg/cm2达15分钟)及离心处理(4500rpm、20分钟)后制得的藏红花水煮液。然后，检测实验样本及对照样本的总黄酮含量，其结果如表1所示，其中总黄酮的检测为本发明所属技术领域中技术人员所熟知，且不影响实验样本及对照样本的总黄酮相对含量的评估，于此不再赘述。
48.表1
[0049][0050]
如表1所示，实验样本的总黄酮含量较对照样本高28.60％，证明含有藏红花的基质经发酵步骤后，可增加总黄酮的含量。
[0051]
2.羟基红花黄色素a的含量
[0052]
将藏红花发酵物及藏红花水煮液分别以水稀释成浓度为10体积％，并分别以孔洞为0.4μm的薄膜进行过滤。接着检测标准品、藏红花发酵物及藏红花水煮液的羟基红花黄色素a的含量。羟基红花黄色素a的含量的检测方法简述如下：利用市售的硅胶层析管柱(商品
名：shim-pack gist c18，货号：227-30017-08，生产商：岛津科学仪器故份有限公司，日本京都)进行高效液相层析(high performance liquid chromatography，hplc)法，其中hplc法的条件为：流动相a为乙腈，流动相b为0.1体积％的磷酸水溶液，流动相a与流动相b的体积比为80:20，流速为1ml/分钟，检测波长为403nm，进样量为10μl，且柱温为35℃。
[0053]
请参阅图1a至图1c，其分别为绘示根据本发明的一实施例的羟基红花黄色素a标准品(图1a)、藏红花发酵物(图1b)及藏红花水煮液(图1c)的hplc图谱，其中横轴表示滞留时间(单位：分钟)，且纵轴表示信号强度(单位：mv)。如图1a所示，羟基红花黄色素a的滞留时间为3.990分钟，且检量线[calibration curve，即标准取线(standard curve)]，方程式如式(i)所示：
[0054]
y＝29420x-12808，r2＝0.9999
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(i)，
[0055]
其中x为羟基红花黄色素a的含量，y为波峰面积，且r2为线性相关系数平方值。
[0056]
如图1b所示，藏红花发酵物的滞留时间为3.655分钟，且经式(i)的换算，藏红花发酵物的羟基红花黄色素a的含量为3.045μg/ml。如图1c所示，藏红花水煮液的滞留时间为3.654分钟，且经式(i)的换算，羟基红花黄色素a的含量为2.289μg/ml。由此可知，藏红花发酵物的羟基红花黄色素a的含量比对照样本多33％，证明含有藏红花的基质经发酵步骤后，可增加羟基红花黄色素a的含量。
[0057]
实施例三、评估藏红花发酵物的抗氧化活性
[0058]
1.清除dpph自由基活性
[0059]
dpph是一种相当稳定的自由基，其中dpph的甲醇溶液呈蓝紫色，然而dpph经还原后呈淡黄色的溶液，其中dpph的甲醇溶液对波长517nm的光具最大的吸光值。因此，dpph的甲醇溶液中的dpph自由基含量可由dpph的甲醇溶液对波长517nm的光的吸光值推算。如果藏红花发酵物具有清除dpph自由基的活性，则相对于dpph的甲醇溶液，添加藏红花发酵物的dpph的甲醇溶液的dpph自由基含量应较低。换言之，计算dpph的甲醇溶液与添加藏红花发酵物的dpph自由基含量的差值，除以dpph的甲醇溶液的dpph自由基含量的百分比，可获得dpph自由基清除百分比。
[0060]
图2是绘示根据本发明的一实施例的不同浓度的藏红花发酵物及藏红花水煮液对dpph自由基清除率的折线图，其中横轴表示浓度(单位：体积％)，纵轴表示dpph自由基清除百分比(单位：％)，且折线201及折线203分别表示藏红花发酵物及藏红花水煮液。
[0061]
如图2所示，藏红花发酵物的浓度越高，dpph自由基清除百分比也越高，表示藏红花发酵物的dpph自由基清除活性存在剂量依存反应的关系。其次，在同一浓度下，藏红花发酵物的dpph自由基清除百分比高于藏红花水煮液，证实藏红花发酵物的抗氧化活性较藏红花水煮液佳。
[0062]
2.清除羟自由基活性
[0063]
在含有过氧化氢、亚铁离子及水杨酸的反应溶液中添加藏红花发酵物，可评估藏红花发酵物的清除羟自由基的活性。详细而言，过氧化氢及亚铁离子的芬顿反应可产生羟自由基，且水杨酸与羟自由基反应后，可产生对510nm的光具有较大吸光值的紫色产物。因此，反应溶液中的羟自由基浓度可由反应溶液对510nm的光的吸光值推算。如果藏红花发酵物具有清除羟自由基的活性，则相对于未添加藏红花发酵物的反应溶液，添加藏红花发酵物的反应溶液的羟自由基含量应较低。换言之，计算未添加藏红花发酵物的反应溶液与添
加藏红花发酵物的反应溶液的羟自由基含量的差值，除以未添加藏红花发酵物的反应溶液的羟自由基含量的百分比，可获得羟自由基清除百分比。
[0064]
图3是绘示根据本发明的一实施例的不同浓度的藏红花发酵物及藏红花水煮液对羟自由基清除率的折线图，其中横轴表示浓度(单位：体积％)，纵轴表示羟自由基清除百分比(单位：％)，且折线301及折线303分别表示藏红花发酵物及藏红花水煮液。
[0065]
如图3所示，藏红花发酵物的浓度越高，羟自由基清除百分比也越高，表示藏红花发酵物的羟自由基清除活性存在剂量依存反应的关系。其次，在同一浓度下，藏红花发酵物的羟自由基清除百分比高于藏红花水煮液，证实藏红花发酵物的抗氧化活性较藏红花水煮液佳。
[0066]
实施例四、评估藏红花发酵物的控油功效
[0067]
在受试者(5人)额头左右两侧皮肤上分别设定3cm
×
3cm的受试区域及对照区域，并利用市售的皮脂检测仪器(型号：sebumeter sm815，生产商：德国courage+khazaka electronic gmbh公司)检测受试区域及对照区域每单位面积的皮脂含量(单位为μg/cm2)。受试区域的皮肤每日一次涂抹藏红花发酵物(涂抹量：2.0
±
0.1mg/cm2)，但对照区域的皮肤则不进行任何处理。在每天涂抹一次，连续涂抹1天、3天、7天及14天后，分别检测对照区域及受试区域的皮脂含量。
[0068]
图4是绘示根据本发明的一实施例的对照区域及受试区域的皮肤连续涂抹藏红花发酵物不同时间后的皮脂含量的柱形图，其中横轴表示检测的时间，纵轴表示皮脂含量(单位：μg/cm2)，且柱形401及柱形403分别表示受试区域及对照区域。如图4所示，皮肤连续涂抹藏红花发酵物14天后，受试区域的皮脂含量小于对照区域，证明藏红花发酵物对皮肤具控油的功效。
[0069]
实施例五、评估藏红花发酵物的祛红功效
[0070]
在受试者具有红血丝症状的患部皮肤上设定受试区域(3cm
×
3cm)，并利用市售皮肤光学检测仪器(品名：智慧3d肌肤检测仪antera 3d；制造商：都柏林爱尔兰miravex)对受试区域的患部皮肤表面进行影像分析，以获得红血丝平均值。接着，受试区域的皮肤每日一次涂抹藏红花发酵物(涂抹量为2.0
±
1.0mg/cm2/次)。在连续涂抹14天后，检测受试区域的皮肤的平均红血丝值(单位：任意单位)。
[0071]
图5a至图5j是分别显示根据本发明的一实施例的不同受试者皮肤未涂抹藏红花发酵物及连续涂抹藏红花发酵物14天后的受试区域照片，其中圆圈501、圆圈503、圆圈505、圆圈507、圆圈509、圆圈511、圆圈513、圆圈515、圆圈517及圆圈519代表实际测量区域。
[0072]
图5a及图5b分别为受试者1皮肤未涂抹藏红花发酵物(图5a)及连续涂抹藏红花发酵物14天后(图5b)的受试区域照片，其中图5a的圆圈501内皮肤的红血丝平均值为1.204，且图5b的圆圈503内皮肤的红血丝平均值为1.103。图5c及图5d分别为受试者2皮肤未涂抹藏红花发酵物(图5c)及连续涂抹藏红花发酵物14天后(图5d)的受试区域照片，其中图5c的圆圈505内皮肤的红血丝平均值为1.488，且图5d的圆圈507内皮肤的红血丝平均值为1.388。图5e及图5f分别为受试者3皮肤未涂抹藏红花发酵物(图5e)及连续涂抹藏红花发酵物14天后(图5f)的受试区域照片，其中图5e的圆圈509内皮肤的红血丝平均值为1.442，且图5f的圆圈511内皮肤的红血丝平均值为1.488。图5g及图5h分别为受试者4皮肤未涂抹藏红花发酵物(图5g)及连续涂抹藏红花发酵物14天后(图5h)的受试区域照片，其中图5g的圆
圈513内皮肤的红血丝平均值为1.282，且图5h的圆圈515内皮肤的红血丝平均值为1.276。图5i及图5j分别为受试者5皮肤未涂抹藏红花发酵物(图5i)及连续涂抹藏红花发酵物14天后(图5j)的受试区域照片，其中图5i的圆圈517内皮肤的红血丝平均值为1.213，且图5j的圆圈519内皮肤的红血丝平均值为1.084。由此可知，藏红花发酵物连续涂抹皮肤14天后，可改善红血丝症状。
[0073]
图6是绘示根据本发明一的实施例的受试者皮肤未涂抹藏红花发酵物及连续涂抹藏红花发酵物14天后的红血丝平均值的折线图，其中横轴由左至右分别表示皮肤未涂抹及涂抹14天，且纵轴表示红血丝平均值(单位：任意单位)。如图6所示，皮肤连续涂抹藏红花发酵物14天后，受试区域的红血丝平均值下降8.45％，证实皮肤连续涂抹藏红花发酵物14天可有效改善红血丝症状，即藏红花发酵物对皮肤具祛红的功效。
[0074]
实施例六、评估藏红花发酵物的低致敏性
[0075]
在皮肤上进行密封式贴片试验(closed patch test)，评估藏红花发酵物的低致敏性。选择适合的受试者30人，其中受试者年龄是在18岁至60岁间随机选择。首先，利用无刺激性的胶带于每位受试者的背部固定2个斑试器达24小时，使斑试器的鳍状室(fin-chamber)中的滤纸片贴附于受试者的背部皮肤上，期间不移除斑试器，也避免斑试器碰到水。以滤纸片含有0.20ml至0.25ml的藏红花发酵物做为实验组，以滤纸片含有0.20ml至0.25ml的蒸馏水做为控制组。经24小时后，取下斑试器，并分别于0.5小时、24小时及48小时后观察斑试器下的皮肤(以下称为受试区域)及受试区域周围的皮肤是否出现红斑、浸润、水肿、丘疹及/或疱疹等症状。
[0076]
将结果记录于表2中，其中图号
“‑”
表示皮肤为阴性，即皮肤没有出现红斑、浸润、水肿、丘疹及/或疱疹等症状，
“±”
表示可疑反应，即受试区域的皮肤出现轻微的红斑，“+”表示弱阳性反应(也称为红斑反应)，即受试区域的皮肤出现红斑、浸润、水肿及/或丘疹，“++”表示强阳性反应(也称为疱疹反应)，即受试区域的皮肤出现红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，且受试区域周围的皮肤也出现上述疱疹反应的症状，“+++”表示皮肤出现极强阳性反应(也称为融合性疱疹反应)，即受试区域的皮肤出现明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹，且受试区域周围的皮肤也出现上述融合性疱疹反应(n＝30)。
[0077]
表2
[0078][0079]
如表2所示，在取下斑试器后0.5小时、24小时或48小时后，受试者在受试区域及其周围的皮肤皆呈阴性，表示无红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹及融合性疱疹等反应，显示藏红花发酵物对皮肤具低致敏性。
[0080]
综言之，上述特定菌株的酵母、特定组成的发酵基质、特定的发酵步骤或特定的评估方法仅用于例示说明本发明的藏红花发酵物、含此的具控油及祛红功效的皮肤外用组成物及其用途。然而，本发明所属技术领域中技术人员应可理解，在不脱离本发明的精神及范围内，其他菌株的酵母、其他组成的发酵基质以及其他的发酵步骤或其他的评估方法也可用于藏红花发酵物、含此的具控油及祛红功效的皮肤外用组成物及其用途，并不限于上述。举例而言，在不影响藏红花发酵物的控油及祛红功效的前提下，也可使用其他菌株的酵母或其他组成的发酵基质，以获得藏红花发酵物。
[0081]
由上述实施例可知，本发明藏红花发酵物、含此的具控油及祛红功效的皮肤外用组成物及其用途，其优点在使用酵母对藏红花进行发酵步骤，以可保留及/或产生皮肤可吸收且对皮肤有益的活性物质(如：羟基红花黄色素a)，使得藏红花发酵物不仅具抗氧化活性，还对皮肤具控油及祛红功效，而可应用于皮肤外用组成物。
[0082]
虽然本发明已以数个特定实施例公开如上，但可对前述发明内容进行各种润饰、各种更动及替换，而且应可理解的是，在不脱离本发明的精神和范围内，某些情况将采用本发明实施例的某些特征但不对应使用其他特征。因此，本发明的精神和权利要求书范围不应限于以上例示实施例所述。
[0083]
【符号说明】
[0084]
201,203,301,303:折线
[0085]
401,403:柱形
[0086]
501,503,505,507,509,511,513,515,517,519:圆圈
[0087]
【生物材料保藏】
[0088]
酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center，cgmcc，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为cgmcc no.22020。

技术特征：
1.一种藏红花发酵物，其特征在于，其由发酵基质经发酵步骤而制得，该发酵基质由藏红花(crocus sativus)及水所组成，该藏红花为干燥花朵，该发酵步骤利用酵母于20℃至50℃的温度进行10小时至50小时，该酵母是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)c-lye-6，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center，cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.22020，且该藏红花发酵物包含2.5μg/ml至3.5μg/ml的羟基红花黄色素a。2.根据权利要求1所述的藏红花发酵物，其特征在于，还包含2.0mg/ml至8.0mg/ml的蛋白质、2.0mg/ml至10.0mg/ml的粗多糖、0.5mg/ml至3.0mg/ml的总黄酮及/或0.1mg/ml至1.0mg/ml的总酚。3.根据权利要求1所述的藏红花发酵物，其特征在于，其中该藏红花发酵物的ph值为4.5至6.8。4.根据权利要求1所述的藏红花发酵物，其特征在于，其中该藏红花及该水的重量体积比(g:ml)为2～10:100～300。5.根据权利要求1所述的藏红花发酵物，其特征在于，其中该酵母的菌体浓度为105菌落形成单位(colony forming unit，cfu)/ml至108cfu/ml。6.根据权利要求1所述的藏红花发酵物，其特征在于，其中该藏红花及该酵母的重量体积比(g:ml)为2～20:5～10。7.一种具控油功效的皮肤外用组成物，其特征在于，包含根据权利要求1至6任一项所述的藏红花发酵物做为有效成分。8.一种具祛红功效的皮肤外用组成物，其特征在于，包含根据权利要求1至6任一项所述的藏红花发酵物做为有效成分。9.一种藏红花发酵物用于制备具控油及祛红功效的皮肤外用组成物的用途，其特征在于，其中该皮肤外用组成物包含根据权利要求1至6任一项所述的该藏红花发酵物做为有效成分。10.根据权利要求9所述的藏红花发酵物用于制备具控油及祛红功效的皮肤外用组成物的用途，其特征在于，其中该藏红花发酵物具抗氧化的功效。

技术总结
本发明是有关于一种藏红花发酵物、含此的具控油及祛红功效的皮肤外用组成物及其用途，其中藏红花发酵物利用酵母对藏红花进行发酵步骤而制得。藏红花发酵物富含羟基红花黄色素A，具有抗氧化活性，且对皮肤具控油及/或祛红等功效。等功效。等功效。


技术研发人员：方祥铭 方晓薇
受保护的技术使用者：上海全丽生物科技有限公司
技术研发日：2022.01.30
技术公布日：2023/8/9