一种深古菌转甲基酶Ι的基因、蛋白序列及其制备方法

一种深古菌转甲基酶
ι
的基因、蛋白序列及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种深古菌转甲基酶ι的基因、蛋白序列及其制备方法。


背景技术：

2.利用甲氧基芳香化合物为底物的转甲基过程需要多种酶共同作用，其中包括转甲基酶ι、类咕啉蛋白、ae激活酶、转甲基酶ⅱ。转甲基酶ι负责关键的底物识别及催化过程，催化甲氧基芳香化合物上的甲基转到咕啉环蛋白上，转甲基酶ⅱ催化咕啉环蛋白上的甲基转移至四氢叶酸上，ae激活酶可将没有活性的二价钴催化成有活性的一价钴。
3.转甲基多酶复合体多数存在于产乙酸细菌中，近期发现这一类转甲基酶复合体在产甲烷古菌及其他古菌中也存在，但是目前报道的转甲基酶都属于细菌来源，亲源性高。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提出一种深古菌转甲基酶ι的基因、蛋白序列及其制备方法，所述深古菌转甲基酶i具有利用愈创木酚为底物，进行转甲基的反应活性，将甲基转移至咕啉环蛋白上，可用于甲氧基的芳香族化合物的转甲基。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.本发明提供一种深古菌转甲基酶ι的蛋白序列，其氨基酸序列如seq id no：1所示。
7.本发明进一步保护编码上述深古菌转甲基酶ι蛋白序列的基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：2所示。
8.本发明进一步保护一种重组表达载体，包含上述的基因片段。
9.本发明进一步保护一种重组菌，其特征在于，包上述的重组表达载体。
10.作为本发明的进一步改进，所述重组菌为大肠杆菌。
11.本发明进一步保护一种深古菌转甲基酶ι的制备方法，包括以下步骤：
12.s1.构建上述的重组表达载体；
13.s2.将步骤s1得到的重组表达载体转入宿主细胞，并对宿主细胞进行扩大培养、诱导表达；
14.s3.收集诱导培养后的宿主细胞，进行破碎、加热、离心，得到上清液；
15.s4.对上清液进行纯化，得到所述转甲基酶ι。
16.本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的深古菌转甲基酶ι。
17.本发明进一步保护一种上述深古菌转甲基酶ι的转甲基反应缓冲液，其特征在于，所述缓冲液反应体系中含35mmol/l tris-hcl，70mmol/l kcl，12mmol/l mgcl2，0.5mmol/l ti(iii)citrate，2.3mmol/l atp，0.08mg/ml激活酶，1.2mg/ml co(ii)-咕啉环蛋白，2.3mmol/l愈创木酚和0.015mg/ml trigger factor标签与深古菌甲基转移酶i。
18.本发明具有如下有益效果：本发明中的转甲基酶ι序列与目前已报道的转甲基酶ι
35.r2:5
’‑
cgagtgcggccgcaagcttttatttggatgccattgctttttt-3’36.使用bamhi和hindiii双酶切pcold-tf载体，ndei和hindiii双酶切pet28a载体并用dna产物纯化试剂盒回收酶切产物。利用ii连接酶将深古菌甲基转移酶i片段基因与bamhi/hindiii双酶切后的pcold-tf载体进行重组，咕啉环蛋白基因与ndei/hindiii双酶切后的pet28a载体进行重组。成功构建上述两个载体后，将其分别转化到dh5α感受态细胞中，次日挑取单菌，进行菌液pcr验证阳性重组克隆，阳性克隆再进行dna序列测定，验证深古菌甲基转移酶i片段基因和咕啉环蛋白基因序列的正确性。
37.2.重组深古菌酶甲基转移酶i片段蛋白与咕啉环蛋白的原核表达
38.将深古菌甲基转移酶i和咕啉环蛋白的原核重组表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中。转化培养后的菌液分别均匀涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的固体lb平板上，37℃倒置培养16小时。挑取单菌落至20ml含相应抗生素的lb液体培养基中，37℃
×
200r/min条件下摇床温育过夜。将20ml菌液转接扩大至500ml培养体系中，37℃
×
200r/min条件下继续培养，待od
600
测定值达到0.7-1.0，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，在20℃
×
200r/min条件下继续培养18h，分别诱导trigger factor标签/深古菌甲基转移酶i融合蛋白和咕啉环蛋白表达。
39.3.深古菌甲基转移酶i和咕啉环蛋白的亲和纯化(厌氧条件下进行)
40.将诱导后的大肠杆菌细胞，在8000r/min下离心3min，收集菌体细胞。用40ml裂解缓冲液(20mmol/l tris-hcl，ph 7.6，150mmol/l nacl，5％甘油)重悬菌体细胞，进行超声波破碎。超声破碎条件为600w功率下超声4s，间歇4s，总共超声20min。然后在4℃条件下10000r/min离心30min，收集上清液获得重组蛋白粗液。
41.将上清液加入到装有2ml ni-nta纯化树脂的色谱柱，并让缓冲液流经色谱柱，以使深古菌甲基转移酶i所带的8个连续组氨酸标签和咕啉环蛋白所带的6个连续组氨酸标签分别与ni-nta树脂上固定的镍离子特异性结合。然后用含有20mmol/l咪唑的裂解缓冲液洗涤树脂，除去树脂上非特异性结合的杂蛋白。接着用20ml洗脱缓冲液(含有250mmol/l咪唑)洗脱ni-nta树脂，收集洗脱液，洗脱液分别含有trigger factor标签/深古菌甲基转移酶i融合蛋白和咕啉环蛋白。
42.将上述蛋白置换到储存溶液中[20mmol/l tris-hcl(ph 7.6)，1mmol/l dtt，150mmol/l nacl，5％甘油]，于-20℃保存。上述蛋白通过sds-page电泳分析鉴定，鉴定结果如图2所示，其中(a)为trigger factor标签/深古菌甲基转移酶i融合蛋白sds-page电泳结果，(b)为咕啉环蛋白sds-page电泳结果，trigger factor标签/深古菌甲基转移酶i融合蛋白大小约为100kda，咕啉环蛋白约为17kda。
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4.深古菌甲基转移酶i片段蛋白酶活性测定
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将步骤3经亲和纯化(ni-nta树脂)的trigger factor标签与深古菌甲基转移酶i片段融合蛋白进行转甲基测试。
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(1)制备co(ii)-咕啉环蛋白(厌氧条件下进行)
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咕啉环蛋白同样来自于本深古菌，其基因序列见序列表中seq id no：3。1.5ml咕啉环蛋白(30mg)溶液加入至8.5毫升重折叠溶液中并加入终浓度为1mmol/l的dtt。重折叠溶液含有50mmol/l tris、300mmol/l甜菜碱和1mmol/l羟钴胺，并将ph值调节至7.6。然后将此混合溶液在4℃下，黑暗中孵育16小时。次日，通过使用10kda的超滤管，用ph值为7.6的含
1mmol/l dtt的tris hcl溶液交换数次，直到含羟钴铵的滤出液看起来明显清澈而不是红色，则制备好了co(ii)-咕啉环蛋白。
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(2)活性测定反应
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酶活性测定在用橡胶塞封闭并用n2充气的350μl石英比色皿中进行，所有测量一式三份。深古菌甲基转移酶i活性在300μl总体积中测定，其中缓冲液(ph7.6)含有35mmol/l tris-hcl、70mmol/l kcl。第一，通过添加12mmol/l mgcl2、0.5mmol/l ti(iii)citrate(新鲜制备)、2.3mmol/l atp和0.08mg/ml激活酶(genbank accession no.acj01666.1)将最终浓度为1.2mg/ml的重组co(ii)-咕啉环蛋白转化为co(i)-咕啉环蛋白，第二，添加终浓度为2.3mmol/l愈创木酚和0.015mg/ml的甲基转移酶i反应过夜，反应温度为25℃。取添加甲基转移酶i之前和活性测定之后的样品各三份，用于hplc分析甲氧基化合物。ch3会从底物愈创木酚转移至co(i)-咕啉环蛋白生成ch
3-co(iii)-咕啉环蛋白，导致530nm左右的紫外吸收升高，这一现象可用紫外-可见分光光度计测定观察到。上述结果见图3，图3为深古菌甲基转移酶i将愈创木酚的甲基转移到co(i)-咕啉环蛋白，产生甲基化的co(iii)-咕啉环蛋白(红色)；图4为液相色谱检测到愈创木酚转甲基后产物邻苯二酚的生成。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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技术特征：
1.一种深古菌转甲基酶ι的蛋白序列，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no：1所示。2.编码权利要求1所述深古菌转甲基酶ι蛋白序列的基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no：2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因片段。4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求3所述的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为大肠杆菌。6.一种深古菌转甲基酶ι的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.构建如权利要求3所述的重组表达载体；s2.将步骤s1得到的重组表达载体转入宿主细胞，并对宿主细胞进行扩大培养、诱导表达；s3.收集诱导培养后的宿主细胞，进行破碎、加热、离心，得到上清液；s4.对上清液进行纯化，得到所述转甲基酶ι。7.一种如权利要求6所述的制备方法制得的深古菌转甲基酶ι。一种如权利要求7所述深古菌转甲基酶ι的转甲基反应缓冲液，其特征在于，所述缓冲液反应体系中含35mmol/l tris-hcl，70mmol/l kcl，12mmol/l mgcl2，0.5mmol/l ti(iii)citrate，2.3mmol/l atp，0.08mg/ml激活酶，1.2mg/ml co(ii)-咕啉环蛋白，2.3mmol/l愈创木酚和0.015mg/ml trigger factor标签与深古菌甲基转移酶i。

技术总结
本发明提出了一种深古菌转甲基酶Ι的基因、蛋白序列及其制备方法，属于基因工程技术领域，所述转甲基酶Ι来源于深古菌基因组，具有转甲基活性，以带甲氧基的芳香族化合物为底物，将其中的甲基转移至咕啉环蛋白上。将深古菌转甲基酶Ι克隆到pCold-TF表达载体，通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化，制备转甲基酶。该转甲基酶I可用于甲氧基的芳香族化合物的转甲基。于甲氧基的芳香族化合物的转甲基。于甲氧基的芳香族化合物的转甲基。


技术研发人员：王风平 余甜甜 曾宪烘
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2022.01.29
技术公布日：2023/8/9