基于RAA-CRISPR/Cas12a技术可视化检测玉米褪绿斑驳病毒的方法

基于raa-crispr/cas12a技术可视化检测玉米褪绿斑驳病毒的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及基于raa-crispr/cas12a技术可视化检测玉米褪绿斑驳病毒的方法、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.玉米褪绿斑驳病毒(maize chlorotic mottle virus，mcmv)是番茄丛矮病毒科、玉米褪绿斑驳病毒属的唯一成员，属于我国进境及国内植物检疫性有害生物。2009年在我国云南首次发现，之后在四川南部地区也有发生的报道。mcmv侵染部分单子叶植物，玉米是其天然寄主。mcmv能通过昆虫(叶甲和蓟马)介体、种子和机械方式传播。mcmv单独侵染玉米引起褪绿、斑驳、矮化甚至局部坏死等症状。mcmv与甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus，scmv)，玉米矮花叶病毒(maize dwarf mosaic virus，mdmv)、小麦线条花叶病毒(wheat streak mosaic virus，wsmv)等马铃薯y病毒科的一种或者几种病毒共同侵染玉米，可引起致死性坏死病，使整个植株坏死，导致严重产量损失甚至绝收。
3.目前针对mcmv的检测方法主要是基于病毒蛋白抗体的血清学方法及反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)。血清学方法主要是酶联免疫吸附测定(elisa)及胶体金试纸条等，适合大量样品的检测，但灵敏度低于核酸检测方法。rt-pcr对仪器设备的依赖程度较高，需要热循环仪进行变性、退火、延伸等步骤，整个过程耗时长，成本高。
4.重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase-aided ampliffication，raa)能够在39℃左右的恒温条件下对靶标片段进行快速扩增，不需要精密温控设备。相较于pcr，raa反应更加快速、灵敏，特异性强，目前已经用于新冠病毒、非洲猪瘟病毒、禽流感病毒等的检测，但用于植物病毒检测的报道很少。mcmv严重威胁着玉米生产安全，因此建立简单、特异、灵敏、快速的检测方法尤为重要。
5.近年来，基因编辑工具crispr/cas系统越来越多地应用于核酸检测领域。crispr/cas12a能够识别数个核苷酸的特定原型间隔子相邻模体(protospacer adjacent motif，pam)序列(lbcas12a能够识别5
′‑
tttn-3
′
)；在crrna的引导下，切割双链靶标dna；切割dsdna后，能够激活其切割单链dna(single-stranded dna，ssdna)的活性。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种检测玉米褪绿斑驳病毒的方法。
7.本发明提供了用于检测玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒，包括raa引物对、ssdna探针(例如，20nt)、crrna和cas12a蛋白，所述raa引物对由mcmv-f1引物和mcmv-r3引物组成，所述mcmv-f1引物为序列表中seq id no.1所示的单链dna分子，所述mcmv-r3引物为序列表中seq id no.4所示的单链dna分子，所述ssdna探针为序列表中seq id no.13所示的单链dna分子，所述crrna为序列表中seq id no.12所示的rna分子。
8.可选地，根据上述的试剂盒，所述ssdna探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团
bhq1。例如，可在seq id no.13的第1位碱基上标记荧光基团且第20位碱基标记淬灭基团bhq1。
9.所述荧光基团可选自fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe、fitc、tet、ned、tamra、lc red460、lc red705、quasar705或texas red中的至少一种。
10.所述cas12a蛋白可为毛螺旋菌的cas12a重组表达蛋白lbcas12a。
11.可选地，根据上述的试剂盒，所述荧光基团为fam。
12.本发明还提供了检测玉米褪绿斑驳病毒的方法，包括以待测样品的cdna为模板，采用上述raa引物对进行raa反应获得扩增产物；采用上述ssdna探针和上述crrna对所述扩增产物进行crispr/cas12a反应获得反应产物；根据所述反应产物的荧光确定待测样品是否含有玉米褪绿斑驳病毒。
13.所述根据所述反应产物的荧光确定待测样品是否含有玉米褪绿斑驳病毒可为，在蓝光灯/紫外灯(波长为440-460nm/400nm)下观察所述反应产物，若反应产物产生绿色荧光，则待测样品含有玉米褪绿斑驳病毒，若反应产物不产生色荧光，则待测样品不含有玉米褪绿斑驳病毒。
14.可选地，根据上述的方法，所述crispr/cas12a反应的体系中ssdna探针的浓度为800nm；所述crispr/cas12a反应的体系中crrna和cas12a的浓度比为5∶1。
15.可选地，根据上述的方法，所述crispr/cas12a反应的体系体积为25μl，所述ssdna探针的浓度为100-1600nm，例如800nm，所述crrna浓度为62.5nm-2000nm，例如1000nm，所述cas12a蛋白浓度为12.5nm-400nm，例如200nm。
16.可选地，根据上述的方法，所述待测样品的cdna是由2000ng待测样品的rna定量反转录获得的反转录产物，再以10倍浓度梯度系列稀释所述反转录产物获得的。换言之，所述待测样品的cdna可由如下步骤制备：定量反转录2000ng待测样品的rna，获得反转录产物，即为所述待测样品的cdna；也可以10倍浓度梯度系列稀释所述反转录产物，获得稀释度为10-1-10-7
的反转录产物，即为所述待测样品的cdna。
17.上述试剂盒中的raa引物对也属于本发明的保护范围之内。
18.上述的试剂盒在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围之内：
19.(1)检测或辅助检测玉米褪绿斑驳病毒；
20.(2)制备检测或辅助检测玉米褪绿斑驳病毒的产品。
21.上文所述raa反应的条件可为37-39℃反应30min。上文所述crispr/cas12a反应的条件可为37℃反应15min。
22.本发明中的raa引物对可有效扩增靶标片段，具有高度的特异性，灵敏度更高。
23.基于crispr/cas12a的切割活性，本发明结合raa核酸扩增技术和crispr/cas12a检测体系，建立了mcmv的快速可视化核酸检测方法。在该检测方法中，加入带有fam荧光基团的ssdna探针，经cas12a切割报告探针后发出绿色荧光，在蓝光灯/紫外灯(440-460nm/400nm)下肉眼可见检测结果。相较于传统的rt-pcr检测，该方法灵敏度高，扩增速度快，反应时间短，高效简便，不需要复杂的仪器设备；检测结果肉眼可见，适用于玉米褪绿斑驳病毒的现场快速检测，为基层植保部门进行病害早期诊断与及时防控提供依据，对于防控该病害的发生与流行具有重要意义。
附图说明
24.图1为ssdna探针浓度的优化结果。
25.图2为cas12a/crrna浓度的优化结果。
26.图3为实施例2提供的检测玉米褪绿斑驳病毒的方法特异性验证结果。
27.图4为实施例3提供的检测玉米褪绿斑驳病毒的方法灵敏度验证结果。
28.图5为rt-pcr检测玉米褪绿斑驳病毒的灵敏度验证结果。
具体实施方式
29.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
30.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
31.实施例1、检测玉米褪绿斑驳病毒的方法建立
32.一、raa引物的设计
33.1.经过大量序列比对分析，根据raa引物设计规则设计了检测mcmv的四条引物(如表1所示)
34.表1 mcmv检测引物序列
[0035][0036]
2.将步骤1设计的4条引物组合成3对引物组合(如表2所示)。
[0037]
表2 mcmv检测引物组合
[0038][0039]
二、最佳引物组合的筛选
[0040]
1.提取感染玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)的玉米叶片的总rna，用oligo(dt)引物反转录为cdna。
[0041]
2.以步骤1得到的cdna为模板，采用表2所示的3种引物组合分别进行raa反应。
[0042]
raa反应体系的配置方法如下：
[0043]
含有冻干重组酶聚合酶粉的raa反应管(wlb8201kit，南京沃博生物科技有限公司)中依次加入a缓冲液(buffer)29.4μl、ddh2o 12.1μl、上游引物、下游引物溶液各2μl、模
板cdna(2000ng rna定量反转录)溶液2μl。引物溶液中上游引物的浓度为10μmol/l，下游引物的浓度为10μmol/l。
[0044]
在管盖上加2.5μl b缓冲液(buffer)，瞬时离心并充分混匀，得到反应体系。
[0045]
将反应体系置于37℃-39℃的金属浴中反应30min。
[0046]
3.完成步骤2后，将50μl反应产物与等体积的tris饱和酚和氯仿的混合液(tris饱和酚∶氯仿＝1∶1，体积比)混合，12000rpm离心10min，取离心后的上清产物5μl于2％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。
[0047]
结果显示，引物对(f1和r3)条带最为清晰特异，为检测玉米褪绿斑驳病毒的最佳引物组合，扩增条带大小为175bp，扩增片段的序列如seq id no.5所示。
[0048]
三、mcmv crrna的设计、筛选与合成
[0049]
1.依据raa扩增的片段，结合lbcas12a识别5
′‑
tttn-3
′
pam序列的特点设计了多个crrna。
[0050]
2.利用cpf1-crispr-dt在线软件(http：//bioinfolab.miamioh.edu/crispr-dt/interface/cpfl_main.php)对这些不同的crrna靶向效率进行计算，部分计算结果如表3所示，选取了其中效率最高的crrna-1用于检测。
[0051]
表3用于检测mcmv的crrna靶向序列及效率
[0052][0053]
3.合成crrna-1转录模板的两条寡核苷酸链t7-crrna-f和t7-mcmv-r(序列如表4所示)，获得此两条寡核苷酸链的干粉状合成物，用1x退火缓冲液(buffer)(solarbio，beijing，china)溶解，使浓度均为10μmol/l，等体积混合，95℃变性2min，缓慢降温至25℃，降温过程不少于45min，使之退火形成双链dna。
[0054]
4.以上述双链dna为模板进行体外转录、纯化得到mcmv crrna-1(序列如表4所示)。
[0055]
表4用于合成mcmv crrna-1转录模板的核苷酸序列及其转录产物mcmv crrna-1序列
[0056][0057]
四、dnat40及t40-crrna的合成
[0058]
1.合成双链dna t40的两条寡核苷酸链nts-40(序列如seq id no.14)和ts-40(序列如seq id no.15)，获得此两条寡核苷酸链的干粉状合成物，用1x退火缓冲液(buffer)(solarbio，beijing，china)溶解，使浓度均为10μmol/l，等体积混合，95℃变性2min，缓慢降温至25℃，降温过程不少于45min，使之退火形成双链dna。
[0059]
2.合成t40-crrna转录模板的两条寡核苷酸链t7-crrna-f和t7-t40-r(序列如表5所示)，获得此两条寡核苷酸链的干粉状合成物，用1x退火缓冲液(buffer)(solarbio，beijing，china)溶解，使浓度均为10μmol/l，等体积混合，95℃变性2min，缓慢降温至25℃，降温过程不少于45min，使之退火形成双链dna。
[0060]
3.以上述双链dna为模板进行体外转录、纯化得到t40-crrna(序列如表5所示)。
[0061]
表5用于合成t40-crrna转录模板的核苷酸序列及其转录产物t40-crrna序列
[0062][0063]
五、反应体系中ssdna探针最佳浓度的确定
[0064]
1.设置不同浓度的ssdna探针(5
′‑
fam-ccggaaaaaaaaaaaaccgg-bhq1-3
′
，序列如seq id no.13，第1位碱基上标记荧光基团fam，第20位碱基标记淬灭基团bhq1)，分别为0nm(阴性对照，nc)、100nm、200nm、300nm、400nm、800nm、1200nm、1600nm，其他反应成分保持不变。
[0065]
2.以体外退火合成的一段40bp的双链dna t40为模板，采用特异性t40-crrna进行crispr/cas12a反应。
[0066]
配制crispr/cas12a检测体系为25μl，各组分如下：
[0067]
200nmlba cas12a(cpf1)(m0653t，new england biolabs inc.，ipswich，ma，usa)，1000nm t40-crrna，2.5μl 10
×
nebuffer 2.1reaction buffer
(b6002s，new england biolabs inc.，ipswich，ma，usa)，20u rri(ag12001，艾科瑞生物)，上述40bp的双链dna t40 2μl，不同浓度的ssdna探针。37℃反应15分钟后，在蓝光灯/紫外灯(波长为440-460nm/400nm)下直接观察检测结果。
[0068]
结果如图1所示。结果表明，当ssdna探针浓度为800nm时，产生明显的绿色荧光，并且与后一个浓度梯度产生的荧光肉眼可见无明显区别，因此，在该反应体系中，ssdna探针的最佳浓度确定为800nm。
[0069]
六、反应体系中cas12a/crrna最佳浓度的确定
[0070]
1.设置不同浓度的cas12a/crrna，分别为0nm/0nm(阴性对照，nc)、12.5nm/62.5nm、25nm/125nm、50nm/250nm、100nm/500nm、200nm/1000nm，400nm/2000nm其他反应成分保持不变。
[0071]
2.以体外退火合成的一段40bp的双链dna t40为模板，采用特异性t40-crrna进行crispr/cas12a反应。
[0072]
配制crispr/casl2a检测体系为25μl，各组分如下：
[0073]
不同浓度比例的lba cas12a(cpfl)(m0653t，new england biolabs inc.，ipswich，ma，usa)和t40-crrna，2.5μl 10
×
nebuffer 2.1reaction buffer(b6002s，new england biolabs inc.，ipswich，ma，usa)，20u rri(ag12001，艾科瑞生物)，上述40bp的双链dna t40 2μl，800nm浓度的ssdna探针。37℃反应15分钟后，在蓝光灯/紫外灯(波长为440-460nm/400nm)下直接观察检测结果。
[0074]
结果如图2所示。结果表明，当cas12a/crrna浓度为200nm/1000nm时，产生明显的绿色荧光，明显区别于前一个浓度梯度，并且与后一个浓度梯度产生的荧光肉眼可见无明显区别，因此，在该反应体系中，cas12a/crrna最佳的浓度确定为200nm/1000nm。
[0075]
七、检测玉米褪绿斑驳病毒的方法
[0076]
1.以待测样品的cdna为模板，采用引物mcmv-f1和引物mcmv-r3组成的引物对进行raa反应获得扩增产物。设置ddh2o作为模板的阴性对照。
[0077]
raa反应体系的配置方法如下：
[0078]
含有冻干重组酶聚合酶粉的raa(wlb8201kit，南京沃博生物科技有限公司)反应管中依次加入a缓冲液(buffer)29.4μl、ddh2o 12.1μl、上游引物mcmv-f1、下游引物mcmv-r3溶液各2μl、模板cdna溶液2μl。引物溶液中上游引物的浓度为10μmol/l，下游引物的浓度为10μmol/l。
[0079]
在管盖上加2.5μl b缓冲液(buffer)，瞬时离心并充分混匀，得到反应体系。
[0080]
将反应体系置于37℃-39℃的金属浴中反应30min。
[0081]
2.采用crispr/cas12a反应体系对步骤1的扩增产物进行检测。
[0082]
经过优化的crispr/cas12a检测体系为25μl，各组分如下：
[0083]
2μl步骤1的扩增产物，200nmlba cas12a(cpfl)(m0653t，new england biolabs inc.，ipswich，ma，usa)、1000nm mcmv crrna-1，2.5μl 10
×
nebuffer 2.1reaction buffer(b6002s，new england biolabs inc.，ipswich，ma，usa)，20u rri(ag12001，艾科瑞生物)，800nm ssdna探针。37℃反应15分钟后获得反应产物，在蓝光灯/紫外灯(波长为440-460nm/400nm)下直接观察反应产物。
[0084]
反应产物产生绿色荧光，则待测样品含有玉米褪绿斑驳病毒，反应产物不产生色
荧光，则待测样品不含有玉米褪绿斑驳病毒。
[0085]
实施例2、检测玉米褪绿斑驳病毒的方法的特异性评价
[0086]
1.提取感染水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)的玉米叶片、感染雀麦花叶病毒(bmv)的玉米叶片、感染甘蔗花叶病毒(scmv)的玉米叶片、感染黄瓜花叶病毒(cmv)的玉米叶片、感染番茄褪绿病毒(tocv)的烟草叶片、感染玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)的玉米叶片的总rna并反转录为cdna(取2000ng rna定量反转录)。
[0087]
2.采用实施例1中七、检测玉米褪绿斑驳病毒的方法进行检测。
[0088]
3.检测结果如图3所示，结果表明，只有mcmv病毒对应的反应产物出现了明显的绿色荧光，感染其它种对照病毒的样品和阴性对照(nc)均不产生绿色荧光，由此证明本发明设计的检测方法具有高度特异性。
[0089]
实施例3、检测玉米褪绿斑驳病毒的方法的灵敏度评价
[0090]
一、检测玉米褪绿斑驳病毒的方法灵敏度验证
[0091]
1.取感染玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)的玉米叶片提取的总rna，并反转录为cdna(取2000ng rna定量反转录)。
[0092]
2.采用ddh2o将步骤1得到的cdna以10倍梯度逐级稀释，分别为100、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
共8个稀释度。
[0093]
3.采用实施例1中七、检测玉米褪绿斑驳病毒的方法对步骤2获得的不同稀释度的cdna进行检测。
[0094]
结果如图4所示，1-8为2000ng rna定量反转录获得的cdna以10倍浓度梯度系列稀释，分别为100、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
浓度梯度；9为阴性对照。结果表明本方法的灵敏度为10-5
稀释度。
[0095]
二、rt-pcr灵敏度验证
[0096]
1.取感染玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)的玉米叶片提取的总rna，并反转录为cdna(取2000ng rna定量反转录)。
[0097]
2.采用ddh2o将步骤1得到的cdna以10倍梯度逐级稀释，分别为100、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
共8个稀释度。
[0098]
3.以步骤2获得的不同梯度稀释的cdna为模板，采用引物mcmv-f1和引物mcmv-r3组成的引物对进行pcr反应。设置采用ddh2o作为模板的阴性对照组。
[0099]
采用2x taq pcr mix plus试剂盒(t0211，兰博利德生物)进行pcr反应，pcr反应体系如表6所示。
[0100]
表6 pcr反应体系
[0101][0102]
pcr反应条件：94℃，5min，94℃，30s，54℃，30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃，10min，16-20℃保存。
[0103]
琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，m为分子量标记(marker)dl 2000，泳道1-8为2000ng rna定量反转录获得的cdna以10倍浓度梯度系列稀释，分别为100、10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
浓度梯度，9为阴性对照。结果表明，该检测体系的灵敏度为10-2
稀释度。
[0104]
因此可以得出结论，raa-crispr/cas12a方法的灵敏度显著高于rt-pcr的灵敏度。
[0105]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.用于检测玉米褪绿斑驳病毒的试剂盒，其特征在于：包括raa引物对、ssdna探针、crrna和cas12a蛋白，所述raa引物对由mcmv-f1引物和mcmv-r3引物组成，所述mcmv-f1引物为序列表中seq id no.1所示的单链dna分子，所述mcmv-r3引物为序列表中seq id no.4所示的单链dna分子，所述ssdna探针为序列表中seq id no.13所示的单链dna分子，所述crrna为序列表中seq id no.12所示的rna分子。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述ssdna探针两端分别标记荧光基团和淬灭基团bhq1。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为fam。4.检测玉米褪绿斑驳病毒的方法，其特征在于：包括以待测样品的cdna为模板，采用权利要求1中所述raa引物对进行raa反应获得扩增产物；再采用权利要求1中所述ssdna探针和权利要求1中所述crrna对所述扩增产物进行crispr/cas12a反应获得反应产物；根据所述反应产物的荧光确定待测样品是否含有玉米褪绿斑驳病毒。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述crispr/cas12a反应的体系中ssdna探针的浓度为800nm；所述crispr/cas12a反应的体系中crrna和cas12a的浓度比为5∶1。6.权利要求1-3任一所述的试剂盒中的raa引物对。7.权利要求1-3任一所述的试剂盒在如下任一项中的应用：(1)检测或辅助检测玉米褪绿斑驳病毒；(2)制备检测或辅助检测玉米褪绿斑驳病毒的产品。

技术总结
本发明公开了基于RAA-CRISPR/Cas12a技术可视化检测玉米褪绿斑驳病毒的方法、试剂盒及其应用。该试剂盒包括RAA引物对、ssDNA探针、crRNA和Cas12a蛋白，所述RAA引物对由MCMV-F1引物和MCMV-R3引物组成，所述MCMV-F1引物为序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA分子，所述MCMV-R3引物为序列表中SEQ ID No.4所示的单链DNA分子，所述ssDNA探针为序列表中SEQ ID No.13所示的单链DNA分子，所述crRNA为序列表中SEQ ID No.12所示的RNA分子。采用该试剂盒检测灵敏度高，扩增速度快，反应时间短，高效简便，不需要复杂的仪器设备，检测结果肉眼可见，适用于玉米褪绿斑驳病毒的现场快速检测。适用于玉米褪绿斑驳病毒的现场快速检测。


技术研发人员：范在丰 段雪艳 马文娣 焦志远 田逸英 孙僖 周涛
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2022.01.28
技术公布日：2023/8/9