酰肼类化合物作为衍生化试剂的应用

1.本发明涉及生物样本中含羧基、醛羰基和酮羰基中一种或多种的化合物的定量、体外诊断分析领域，具体涉及酰肼类化合物作为衍生化试剂的应用。


背景技术：

2.羧基代谢物作为重要的小分子代谢物，参与生物体多条代谢过程并起着关键性的作用，其在生物体中的种类及含量的变化与多种疾病的发生发展密切相关。因此，高覆盖、高灵敏地定量分析这类代谢物对其生理功能研究、疾病的体外诊断等方面具有重大意义。超高效液相色谱-质谱联用技术(uhplc-ms)将色谱高效的分离能力与质谱高灵敏的定量能力相结合，是目前广泛应用于复杂生物基质中代谢物定量分析的有效手段。但由于羧基代谢物大多为亲水性代谢物，在反相色谱上难以保留，目前多采用质谱负离子的检测模式，导致其定量灵敏度较低，无法满足对生物样本中低浓度的羧基代谢物的定量需求。近年来，基于稳定同位素标记的探针增敏技术的提出为羧基类代谢物定量过程中存在的问题提供了解决方案。目前常用的羧基类代谢物的衍生化试剂主要包括氨基类、肼基类及活性卤素类试剂，其在代谢物疏水性的改善、灵敏度的提升方面已经取得了一定的进展，但仍存在覆盖度十分有限，且多未考察手性羧酸对映异构体的分离与定量等问题，因此亟需开发高覆盖、高灵敏且可实现手性羧酸分离的羧基代谢物的定量分析方法。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是针对现有羧基类代谢物的衍生化试剂检测覆盖度低、灵敏度低、定量限高的缺陷，而提供了酰肼类化合物作为衍生化试剂的应用。本发明的酰肼类化合物合成方法简单、试剂廉价易得，可实现检测多种含羰基的化合物(包括含羧基、醛羰基和酮羰基中一种或多种的化合物)，具有高覆盖度、高灵敏度和低定量限。
4.本发明提供了如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐(指如式i所示的化合物的同位素标记物的盐)，
[0005][0006]
其中，带“*”的碳原子表示为手性碳原子，以r构型、s构型、或r构型和s构型混合的形式存在，例如所述如式i所示的化合物为
[0007]
其中，所述如式i所示的化合物的同位素标记物中，一个或多个原子的同位素丰度与其自然丰度不同。
[0008]
例如，如式i所示的化合物中至少有一个1h被2h(即氘)取代。
[0009]
例如，如式i所示的化合物中至少有一个
12
c被其较重的同位素
13
c取代。
[0010]
例如，如式i所示的化合物中至少有一个
14
n被其较重的同位素
15
n取代。
[0011]
例如，如式i所示的化合物中至少有一个
16
o被其较重的同位素
18
o取代。
[0012]
优选地，所述如式i所示的化合物的同位素标记物为如下任一化合物：
[0013]
[0014]
[0015]
[0016]
[0017]
[0018]
[0019]
[0020][0021]
其中，如式i所示的化合物的同位素标记物的盐为如式i所示的化合物的同位素标记物与盐酸形成的盐，优选地，为如式i所示的化合物的同位素标记物与盐酸以摩尔比为1:1形成的盐。
[0022]
本发明还提供了一种如式i所示的化合物的同位素标记物的制备方法，其包括以下步骤：
[0023]
在溶剂中，在碱存在下，“如式ii所示化合物或其盐”与如式iii所示化合物、水合肼进行如下所示的偶联反应，形成如式i所示的化合物的同位素标记物，即可；
[0024][0025]
其中，带“*”的碳原子表示为手性碳原子，以r构型、s构型、或r构型和s构型混合的形式存在；
[0026]
所述如式ii所示的化合物、如式iii所示的化合物或水合肼中，至少有一个原子的同位素丰度与其自然丰度不同。
[0027]
其中，所述偶联反应中，所述溶剂可选自卤代烷烃类溶剂(例如二氯甲烷和/或四氯化碳)、苯类溶剂(例如甲苯)和醚类溶剂(例如四氢呋喃和/或乙醚，更例如为带分子筛的无水四氢呋喃)中的一种或多种，优选为醚类溶剂。
[0028]
其中，所述偶联反应中，所述碱可为无机碱和/或有机碱，所述有机碱可为三乙胺和/或吡啶，所述无机碱可选自碳酸盐(例如碳酸钾和/或碳酸钠，又例如碳酸钾)、碳酸氢盐(例如碳酸氢钠)和氢氧化物(例如氢氧化钠和/或氢氧化钾)中的一种或多种，优选为碳酸盐。
[0029]
其中，所述偶联反应中，所述如式ii所示的化合物的盐可为如式ii所示的化合物的盐酸盐。
[0030]
其中，所述偶联反应中，所述碱与所述“如式ii所示化合物或其盐”的摩尔比可为2:1-10:1，例如3:1。
[0031]
其中，所述偶联反应中，所述如式iii所示化合物与所述“如式ii所示化合物或其盐”的摩尔比可为0.5:1-5:1，例如0.9:1。
[0032]
其中，所述偶联反应中，所述水合肼与所述“如式ii所示化合物或其盐”的摩尔比可为10:1-500:1，例如100:1。
[0033]
其中，所述偶联反应中，所述“如式ii所示化合物或其盐”在所述溶剂中的摩尔浓度可为0.001-10mol/l，例如0.06mol/l。
[0034]
其中，所述偶联反应中，各物料的加料顺序可为所述如式iii所示的化合物加入到“如式ii所示化合物或其盐”和碱中(优选在冰浴条件下滴加，后室温反应30分钟)，再加入水合肼和醇类溶剂(所述醇类溶剂优选为甲醇，优选加入后室温反应1小时)。
[0035]
其中，所述偶联反应还包括如下后处理步骤：去除溶剂(优选旋蒸去除)、萃取(优选用二氯甲烷萃取)、洗涤(优选用饱和碳酸钠溶液洗涤)、干燥(优选用无水硫酸镁干燥)、过滤、去除溶剂(优选旋蒸去除)和冻干。
[0036]
本发明还提供了一种用于检测和/或分离物质x的组合物，其包括：
[0037]
组分a以及缩合剂；
[0038]
所述组分a为：(1)如式i所示的化合物或其盐，和/或(2)上述如式i所示的化合物的同位素标记物或如式i所示的化合物的同位素标记物的盐；
[0039][0040]
带“*”的碳原子表示为手性碳原子，以r构型、s构型、或r构型和s构型混合的形式存在；
[0041]
所述物质x为含羰基的化合物(指含羧基、醛羰基和酮羰基中一种或多种的化合物)。
[0042]
其中，所述物质x优选为含羧基的化合物，优选地，所述含羧基的化合物为小分子羧基化合物，例如分子量小于1000da的羧基化合物；例如羧基代谢物，更例如为人血浆、人尿液、人粪样或人源性细胞a549中的羧基代谢物。
[0043]
其中，所述缩合剂为本领域常规用于羧基和氨基缩合发生酸胺反应的缩合剂，例如选自2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(hctu)、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(tbtu)、2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tstu)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、三苯基膦(tpp)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat)中的一种或多种。
[0044]
其中，所述缩合剂与所述组分a的摩尔比可为1:10-10:1，例如22:40。
[0045]
进一步地，所述缩合剂优选为edc、hoat或“edc和hoat的组合”。
[0046]
edc和hoat的组合中，所述edc与所述组分a的摩尔比可为100:1-1:100，例如20:40；所述hoat与所述组分a的摩尔比可为100:1-1:100，例如2:40。
[0047]
其中，当所述组分a为上述如式i所示的化合物和/或上述如式i所示的化合物的同位素标记物时；所述组合物还进一步包含酸，所述的酸优选为盐酸，更优选为1m盐酸。
[0048]
优选地，所述组合物为以下任一组合物：
[0049]
a)所述组合物由下述组分组成：组分a；以及缩合剂；
[0050]
b)所述组合物由下述组分组成：组分a；缩合剂；以及酸。
[0051]
本发明还提供了物质a作为衍生化试剂的应用，所述衍生化试剂用于检测和/或分离物质x，
[0052]
所述物质a为(i)上述如式i所示的化合物或其盐；(ii)上述组合物；或(iii)上述如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐；
[0053]
所述物质x为含羰基的化合物(指含羧基、醛羰基和酮羰基中一种或多种的化合物)。
[0054]
优选地，所述应用包括如下步骤：
[0055]
(1)所述物质a与样品进行衍生化反应，得到衍生化产物；所述样品包括物质x；
[0056]
(2)采用液相色谱-质谱联用技术，将衍生化产物分离和/或检测，即可。
[0057]
其中，当物质a为所述“如式i所示的化合物或其盐”或所述“如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐”时，步骤(1)还可加入上述缩合剂。
[0058]
其中，所述衍生化反应可在酸性条件下进行，所述酸性条件优选为盐酸，更优选为1m盐酸。所述盐酸与所述衍生化反应的反应体系的体积比可为0.5-10％，例如4.5％。
[0059]
其中，所述衍生化反应在溶剂中进行，所述溶剂优选为腈类溶剂(例如乙腈)和水，更优选地体积比为1:1的乙腈和水。
[0060]
其中，所述物质a中，所述“如式i所示的化合物或其盐”或所述“如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐”与所述样品中的反应基团(为酮羰基、醛羰基和羧基中的一种或多种)的摩尔比可为10:1-500:1，例如200:1。
[0061]
其中，所述衍生化反应的反应温度可为20-80℃，例如37℃。
[0062]
其中，所述衍生化反应的反应时间可为10-120分钟，例如60分钟。
[0063]
其中，所述液相色谱-质谱联用技术中，液相色谱的色谱条件优选为：色谱柱为反相色谱柱(例如agilent zorbax eclipse plus c18色谱柱)；柱温为40至55摄氏度(例如50摄氏度)，流动相a和b分别为含0.005％-0.5％甲酸的水和乙腈，或分别为水和甲醇(优选分
别为0.1％甲酸的水和乙腈)，流速为0.2至0.5毫升每分钟(例如0.5毫升每分钟)，进样0.5至5微升(例如1微升)，梯度洗脱。
[0064]
较佳的，所述梯度洗脱的梯度以流动相b的百分比表示，可为：0-4分钟，8％；4-7分钟，8-20％；7-11分钟，20-30％；11-15分钟，30-50％；15-18分钟，50-95％；18-19分钟，95-100％；
[0065]
或者，所述梯度洗脱的梯度以流动相b的百分比表示，还可为0-5分钟，2-7％；5-6分钟，7％；6-7分钟，7-8％；7-12分钟，8-15％；12-24分钟，15-21％；24.1-27分钟，95％。
[0066]
其中，所述液相色谱-质谱联用技术中，质谱的分析条件可采用正离子模式下的多反应监测模式，进一步地还可为：离子源温度为350至550摄氏度(例如450摄氏度)，离子化电压为3500至5500伏(例如3500伏)，喷雾气压强为40至55psi(例如35psi)，辅助加热气的压强为40至60psi(例如50psi)。
[0067]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0068]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0069]
本发明的积极进步效果在于：
[0070]
1、本技术提供的酰肼类化合物的同位素标记物制备方法简单，所用试剂廉价易得，反应条件温和，通过简单的萃取后处理即可，且在常规溶剂中的溶解度优良；
[0071]
2、本技术首次将式i化合物、其同位素标记物或它们的盐作为衍生化试剂用于在液相色谱-质谱中分离和/或检测含羰基的化合物(指含羧基、醛羰基和酮羰基中一种或多种的化合物)，该试剂及其与缩合剂形成的组合物与含羰基的化合物衍生化反应效率高，具体的，对手性羧基化合物的r-/s-对映异构体具有相同的衍生化效率和质谱响应，使得当无法获得两个纯对映异构体时，可使用其中一个对映异构体或混合的外消旋体作为分析对照品进行定量分析；对手性羧基化合物的色谱保留规律可在缺乏光学纯对照品时帮助识别r-/s-对映异构体。
[0072]
3、本技术提供的式i化合物、其同位素标记物或它们的盐及它们与缩合剂形成的组合物可实现包括手性α-氨基酸、手性α-羟基酸和手性α-甲基酸在内的手性羧基化合物的同分异构体和对映异构体在常规反相色谱条件下的分离，从而可对其进行定量分析，定量限为0.003-8.457fmol(10-15
摩尔)。
[0073]
4、基于本技术式i化合物、其同位素标记物或它们的盐及它们与缩合剂形成的组合物所建立的定量分析方法简单快速，能在18分钟内完成267种羧基化合物的检测定量分析，适合大样本高通量分析。
[0074]
5、利用本技术的衍生化试剂的同位素标记形式，不仅可用于内标以协助绝对定量，还可用于标记不同的样本以实现单次进样检测多个样本。
[0075]
6、本技术所建立的定量方法还可实现对肌酐的定量检测，该分析方法能够覆盖人尿液中高浓度的肌酐水平。
附图说明
[0076]
图1为12种代表性羧基化合物的sbph衍生化条件的优化；其中；(a)酸的用量筛选；(b-c)缩合试剂和待测物反应基团的摩尔比筛选；(d)sbph和待测物反应基团的摩尔比筛
选；(e)反应温度；(f)反应时间。
[0077]
图2为优化尿液样本中衍生化试剂的用量。
[0078]
图3为用sbph标记的代表性羧基化合物单一手性对映异构体的uplc-ms/ms色谱图。
[0079]
图4-7分别为267种羧基化合物中部分化合物的uplc-ms/ms色谱图。
[0080]
图8-11分别为相同质核比的羧基化合物的uplc-ms/ms色谱图。
[0081]
其中，图8中各缩写代表：m/z 304(a1：异丁酸；a2：丁酸)、m/z 318(b1：乙酰乙酸；b2：r-2-甲基丁酸；b3：s-2-甲基丁酸；b4：异戊酸；b5：戊酸)、m/z 328(c1：2-糠酸；c2：柠康酸；c3：山梨酸)、m/z 358(d1：5-(羟甲基)-2-呋喃甲酸；d2：2-辛烯酸)、m/z 372(e1：乳清酸；e2：3-氯苯甲酸；e3：3-壬烯酸；e4：2-壬烯酸)、m/z 381(f1：r-苯丙氨酸；f2：s-苯丙氨酸)、m/z 386(g1：没食子酸；g2：4-氯苯乙酸)、m/z 388(h1：4-乙基辛酸；h2：4-甲基壬酸；h3：癸酸)、m/z397(i1：r-酪氨酸；i2：s-酪氨酸)、m/z 398(j1：3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸；j2：对羟基苯乳酸；j3：高香草酸；j4：异高香草酸；j5：2,6-二甲氧基苯甲酸)、m/z 400(k1：3,4-二羟基扁桃酸；k2：10-十一烯酸)、m/z 404(l1：3-羟基癸酸；l2：s-2-羟基癸酸；l3：r-2-羟基癸酸)、m/z 460(m1：3-羟基十四烷酸；m2：2-羟基十四烷酸)、m/z 535(n1：丙二酸；n2：3-羟基丙酮酸)、m/z 547(o1：延胡索酸；o2：马来酸；o3：乙酰丙酸；o4：2-戊酮酸；o5：2-酮异戊酸)、m/z 577(p1：己二酸；p2：3-甲基戊二酸；p3：2-酮戊二酸)、m/z 578(q1：r-谷氨酸；q2：s-谷氨酸)、m/z 591(r1：庚二酸；r2：3-甲基己二酸)；
[0082]
图9中各缩写代表：m/z 339(aa1：烟酸；aa2：2-吡啶甲酸)、m/z 346(ab1：2-乙基戊酸；ab2：3-乙基戊酸；ab3：r-2-甲基己酸；ab4：s-2-甲基己酸；ab5：4-甲基己酸；ab6：5-甲基己酸；ab7：庚酸)、m/z 347(ac1：s-异亮氨酸；ac2：s-亮氨酸)、m/z 355(ad1：6-羟基烟酸；ad2：3-羟基-2-吡啶甲酸)、m/z 365(ae1：r-甲硫氨酸；ae2：s-甲硫氨酸)、m/z 368(af1：4-羟基苯乙酸；af2：4-羟基-3-甲基苯甲酸；af3：扁桃酸；af4：3-甲氧基苯甲酸)、m/z 369(ag1：3-氨基水杨酸；ag2：3-羟基-2-氨基苯甲酸)、m/z 380(ah1：4-羟基肉桂酸；ah2：3-羟基肉桂酸；ah3：2-羟基肉桂酸；ah4：3-苯基丁酸；ah5：苯丁酸)、m/z 384(ai1：4-羟基扁桃酸；ai2：尿黑酸；ai3：3,4-二羟基苯乙酸；ai4：香草酸；ai5：5-甲氧基水杨酸)、m/z 369(ag1：3-氨基水杨酸；ag2：3-羟基-2-氨基苯甲酸)、m/z 380(ah1：4-羟基肉桂酸；ah2：3-羟基肉桂酸；ah3：2-羟基肉桂酸；ah4：3-苯基丁酸；ah5：苯丁酸)、m/z 384(ai1：4-羟基扁桃酸；ai2：尿黑酸；ai3：3,4-二羟基苯乙酸；ai4：香草酸；ai5：5-甲氧基水杨酸)、m/z 410(aj1：对氨基马尿酸；aj2：反式-阿魏酸)、m/z 420(ak1：r-色氨酸；ak2：s-色氨酸)、m/z 561(al1：戊烯二酸；al2：中康酸；al3：衣康酸；al4：2-酮异亮氨酸；al5：2-酮异己酸；al6：2-氧代己酸)、m/z 563(am1：戊二酸；am2：2-甲基琥珀酸；am3：乙基丙二酸)、m/z 581(an1：酒石酸；an2：硫代二乙酸；an3：苯甲酰甲酸)、m/z 605(ao1：异柠檬酸；ao2：柠檬酸)；
[0083]
图10中各缩写代表：m/z 306(ba1：3-羟基丙酸；ba2：乳酸；ba3：甲氧基乙酸)、m/z 316(bb1：4-戊烯酸；bb2：3,3-二甲基丙烯酸)、m/z 330(bc1：2-甲基-4-戊烯酸；bc2：2-甲基-2-戊烯酸)、m/z331(bd1：r-脯氨酸；bd2：s-脯氨酸)、m/z 333(be1：乙酸胍；be2：r-缬氨酸；be3：s-缬氨酸；be4：n-乙酰甘氨酸)、m/z 350(bf1：s-2,3-二羟基异戊酸；bf2：r-2,3-二羟基异戊酸)、m/z 353(bg1：3-吡啶乙酸；bg2：间氨基苯甲酸；bg3：对氨基苯甲酸)、m/z 354(bh1：4-羟基苯甲酸；bh2：3-羟基苯甲酸；bh3：2-羟基苯甲酸)、m/z 356(bi1：咪唑丙酸；
bi2：3-(2-呋喃)丙酸)、m/z 360(bj1：4-羟基环己烷甲酸；bj2：丙戊酸；bj3：r-2-甲基庚酸；bj4：s-2-甲基庚酸；bj5：辛酸)、m/z 370(bk1：3,4-二羟基苯甲酸；bk2：2,5-二羟基苯甲酸；bk3：2,6-二羟基苯甲酸)、m/z 396(bl1：烟酰甘氨酸；bl2：3-(3-甲氧基苯基)丙酸)、m/z 405(bm1：犬尿喹啉酸；bm2：3-吲哚丙酸；bm3：1-甲基-3-吲哚乙酸)、m/z 409(bn1：5,6-二羟基-2-吲哚甲酸；bn2：苯乙酰甘氨酸；bn3：琥珀酰苯胺酸)、m/z 411(bo1：对羟基马尿酸；bo2：3-羟基马尿酸；bo3：5-乙酰氨基水杨酸；bo4：s-α-羟基马尿酸；bo5：r-α-羟基马尿酸；bo6：2-羟基马尿酸)、m/z 421(bp1：黄尿酸；bp2：吲哚-3-乳酸)、m/z 549(bq1：琥珀酸；bq2：甲基丙二酸)、m/z 587(br1：2,5-呋喃二羧酸；br2：顺乌头酸)、m/z 607(bs1：3-异丙基苹果酸；bs2：2-异丙基苹果酸)；
[0084]
图11中各缩写代表：m/z 319(ca1：r-2-氨基丁酸；ca2：s-2-氨基丁酸)、m/z 320(cb1：3-羟基丁酸；cb2：3-羟基异丁酸；cb3：2-羟基异丁酸；cb4：s-2-羟基丁酸；cb5：r-2-羟基丁酸)、m/z332(cc1：2-乙基丁酸；cc2：2-甲基戊酸；cc3：3-甲基戊酸；cc4：4-甲基戊酸；cc5：己酸)、m/z334(cd1：3-羟基异戊酸；cd2：3-羟基戊酸；cd3：s-2-羟基-2-甲基丁酸；cd4：r-2-羟基-2-甲基丁酸；cd5：s-2-羟基异戊酸；cd6：r-2-羟基异戊酸；cd7：2-羟基戊酸)、m/z 335(ce1：r-苏氨酸；ce2：s-苏氨酸)、m/z 345(cf1：r-焦谷氨酸；cf2：s-焦谷氨酸)、m/z 348(cg1：天冬酰胺；cg2：6-羟基己酸；cg3：3-羟基己酸；cg4：2-羟基-3-甲基戊酸；cg5：s-2-羟基异己酸；cg6：r-2-羟基异己酸；cg7：s-2-羟基己酸；cg8：r-2-羟基己酸)、m/z 362(ch1：赖氨酸；ch2：谷氨酰胺；ch3：脲基异丁酸)、m/z 366(ci1：3-苯基丙酸；ci2：对甲基苯乙酸)、m/z 376(cj1：3-羟基辛酸；cj2：s-2-羟基辛酸；cj3：r-2-羟基辛酸)、m/z 382(ck1：对羟基苯丙酸；ck2：(4-羟苯基)-2-丙酸；ck3：3-(3-羟基苯基)丙酸；ck4：3-(2-羟基苯基)丙酸；ck5：苯乳酸；ck6：3-甲氧基苯乙酸)、m/z 564(cl1：亚氨基二乙酸；cl2：r-天冬氨酸；cl3：s-天冬氨酸)、m/z 579(cm1：3-羟基戊二酸；cm2：2-羟基戊二酸；cm3：3-甲基苹果酸；cm4：柠苹酸)。
[0085]
图12为用sbph标记的30对手性羧基化合物对映异构体的uplc-ms/ms色谱图。
具体实施方式
[0086]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0087]
实验材料：所有羧基化合物标准化学品购自商业试剂公司，具体见表1。
[0088]
实验所用无水四氢呋喃购买于阿达玛斯公司；甲醇购买于默克公司；肌酐购买于麦克林公司。
[0089]
水合肼、碳酸钾、碳酸钠、无水硫酸镁和二氯甲烷购买于阿拉丁公司。
[0090]
1-羟基-7-氮杂苯三唑(hoat)购买于国药化学试剂公司。
[0091]
质谱级的甲酸、色谱级的乙腈、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、l-脯氨酸甲酯、苯甲酰氯和苯甲酰氯-d5均购买于西格玛公司。
[0092]
氘代甲醇(cd3od)和肌酐-d3购买于cambridge isotope laboratories试剂有限公司(美国)。
[0093]
样品处理与色谱流动相时所用的超纯水购自milli-q系统(millipore，usa)。
[0094]
实验用生物样本：基于复旦大学伦理委员会批准(pe21087)，人血浆、尿液和粪样
均得自人类表型组计划招募并签署了知情同意书的健康中国成年志愿者。样品一经临床标准采样方式获得后，立刻使用液氮速冻并在-80℃储存待测。人源性肺癌细胞a549得自上海肺科医院(中国，上海)。
[0095]
实验仪器：在bruker 600mhz超导核磁共振波谱仪上对sbph、sbph-d5进行一维氢谱的表征，其数据的采集和处理软件是bruker topspin 3.6.0。在thermo orbitrap exploris 240或sciex x500r或zenotof 7600质谱上对sbph、sbph-d5及其衍生的待测物进行高分辨质谱表征。定量分析是在sciex qtrap 6500
+
质谱仪上进行的，该质谱仪配有电喷雾电离(esi)源，与shimadzu lc-30ad uplc系统联用。
[0096]
生物样本的前处理：将20微升人血浆或尿液与120微升预冷的乙腈(-20℃)混合，冰浴超声5min，随后置于低温离心机4℃，14000rpm离心10分钟获得上清液。
[0097]
细胞样品(约20mg)与100微升水和600微升预冷的乙腈混合，冻融三次，冰浴超声5分钟，随后置于低温离心机4℃，14000rpm离心10分钟获得上清液。
[0098]
粪样需分成两份平行样品，一份进行冷冻干燥以测量其含水量，另一份用于检测分析。后者(约20mg)的前处理方式与细胞样品的前处理方式相同。
[0099]
标准储备液和混合储备液的配制：将购买的商品化羧基化合物标准化学品溶于乙腈-水(体积比1:1)溶液得到如表1所示浓度的各羧基化合物标准储备液，按表1中所示体积用量将各羧基化合物标准储备液混合得到总浓度约为30mm的268种羧基化合物的混合储备液，其中有12个手性羧基化合物标准化学品为r构型和s构型混合的形式存在，分别可对应24个r或s构型的手性羧基化合物，故此268种羧基化合物的混合储备液中共含有280种非手性及不同手性构型的羧基化合物。
[0100]
将肌酐和肌酐-d3分别溶于乙腈-水(体积比5:95)溶液，使其浓度达到210mm。
[0101]
混合工作液l1和内标工作液的配制：取80微升混合储备液和20微升肌酐溶液和500微升乙腈-水(体积比6:1)混合得到混合工作液l1。取80微升混合储备液和20微升肌酐-d3溶液和500微升乙腈-水(体积比6:1)溶液混合得到内标工作液。
[0102]
工作液的配制：将混合工作液l1按照稀释倍数2、5、10、25、50、125、250、625、1250、3125、6250、15625、31250、78125、156250逐级稀释得到l1-l16共16个浓度梯度用于绘制标准曲线的工作溶液，并选取l7、l5、l3分别代表低、中、高三个浓度水平的质控品。
[0103]
表1羧基化合物标准化学品、其来源及制得的储备液浓度
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112][0113]
实施例1：s-苯甲酰脯氨酰肼和s-苯甲酰脯氨酰肼-d5的制备
[0114]
s-苯甲酰脯氨酰肼(sbph)的制备：称取s-脯氨酸甲酯盐酸盐(331mg，2mmol)和研磨过的碳酸钾粉末(829mg，6mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入带分子筛的无水四氢呋喃(20ml)作为反应溶剂。将圆底烧瓶置于冰浴中，缓慢滴加苯甲酰氯(207μl，1.8mmol)，滴加完毕后室温反应30分钟。然后再加入甲醇(12ml)和水合肼(12.2ml，200mmol)，室温反应1小时。旋蒸除去溶剂，产物用二氯甲烷(60ml)萃取3次，饱和碳酸钠溶液洗涤3次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸除去溶剂，冻干，得s-苯甲酰脯氨酰肼(sbph)。使用核磁共振一维氢谱和高分辨质谱对其进行结构鉴定，结果如下：
[0115]1h nmr(600mhz,cd3od)δ/ppm 7.61-7.56(m,2h),7.51-7.38(m,3h),4.51(dd,j＝8.2,6.0hz,1h),3.66(ddd,j＝10.5,7.1,4.5hz,1h),3.52(ddd,j＝10.3,7.3,4.7hz,1h),2.33-2.26(m,1h),2.02-1.95(m,2h),1.91-1.83(m,1h)。
[0116]
hrms-esi(+)，[m+h]
+
，m/z，计算值：234.1237，测量值：234.1229。
[0117]
s-苯甲酰脯氨酰肼-d5(sbph-d5)的制备：s-苯甲酰脯氨酰肼-d5(sbph-d5)的合成方法与sbph类似，只需将苯甲酰氯替换为苯甲酰氯-d5即可。使用核磁共振一维氢谱和高分辨质谱对其进行结构鉴定，结果如下：
[0118]1h nmr(600mhz,cd3od)δ/ppm 4.51(dd,j＝8.2,6.1hz,1h),3.66(ddd,j＝10.5,7.1,4.5hz,1h),3.52(ddd,j＝10.3,7.3,4.7hz,1h),2.34-2.27(m,1h),2.08-1.93(m,2h),1.91-1.81(m,1h)。
[0119]
hrms-esi(+)，[m+h]
+
，m/z，计算值：239.1551，测量值：239.1562。
[0120]
实施例2衍生化条件的筛选以及衍生化效率的验证
[0121]
(1)衍生化所需试剂溶液的配制：
[0122]
edc和hoat溶液的配制：将edc和hoat分别用乙腈-水(体积比1:1)溶解，使其浓度分别达到1000mm和105mm，并用乙腈-水(体积比1:1)溶液进行稀释得到下述所需浓度。
[0123]
盐酸溶液的配制：将10ml浓盐酸(12m)缓慢倒入110ml水中得1m的盐酸。
[0124]
sbph和sbph-d5溶液的配制：将实施例1制备得到的sbph和sbph-d5用乙腈-水(体积比1:1)分别溶解，配制成1500mm的储备溶液备用，并用乙腈-水(体积比1:1)溶液进行稀释得到下述所需浓度。
[0125]
(2)衍生化条件的筛选：
[0126]
使用代表性的羧基化合物(分别是代表氨基酸的亮氨酸和色氨酸，代表甲基酸的2-(4-羟基苯)丙酸和2-甲基戊酸，代表羟基酸的2-羟基异戊酸和扁桃酸，代表多元羧酸的柠苹酸和2-甲基琥珀酸，代表酮酸的丙酮酸和苯丙酮酸，代表芳香酸的香草酸和3-羟基苯甲酸)对酸的用量、缩合剂和衍生化试剂与待测物的比例、反应温度与时间等衍生化反应的条件进行了系统优化(见图1)，其中，酰肼类化合物不仅可在缩合剂的作用下与羧基发生酸胺缩合，还可与羰基直接发生肟化反应，具体筛选操作及结果如下：
[0127]
(a)盐酸的用量的选择：
[0128]
将上述代表性羧基化合物的标准储备液用乙腈-水(体积比1:1)溶液分别稀释至0.10mm，随后取上述代表性羧基化合物的0.10mm溶液各10微升混合得到代表性羧基化合物混合溶液。
[0129]
盐酸用量的优化范围为反应体系总体积的0-10％。
[0130]
通过准确吸取120微升代表性羧基化合物混合溶液于ep管中，加入10微升140mm的edc溶液、10微升35mm的hoat溶液和13微升480mm的sbph溶液，向其中分别添加0、1、1.5、3、4.5、6、10％1m盐酸，每个盐酸用量有五个技术重复，涡旋混匀后在37摄氏度中孵育1小时(900rpm)。将上述混合物移至冰上冷却淬灭反应。对衍生化后的混合物在液相色谱-高分辨质谱上进行测定。采用acquity uplc hss t3色谱柱(2.1
×
100mm，1.8μm)，柱温设为40摄氏度，流动相a和b分别为含0.1％甲酸的水和乙腈，流速为0.4毫升每分钟，进样1微升。色谱洗脱梯度以流动相b的百分比表示为：0-1分钟，2％；1-7分钟，2-95％；7-8分钟，95％。质谱使用电喷雾电离源在正离子模式下进行记录，离子源温度为550摄氏度，离子化电压为5500伏，喷雾气和辅助加热气设置为50psi。sciex os软件用于数据采集与处理。当羧基化合物衍生物的平均峰面积(以最大平均峰面积进行归一化)达到最大时确定为最佳条件。结果表明，当盐酸用量为4.5％时，羧基化合物衍生物的峰面积最大，所以，4.5％盐酸用量为最优的盐酸用量并用于后续的实验。
[0131]
(b)edc与待测物反应基团(羧基)比例的选择：
[0132]
代表性羧基化合物混合溶液中羧基的总浓度约为0.117mm。
[0133]
edc与待测物反应基团比例的优化范围为其摩尔比0-300倍。
[0134]
通过准确吸取120微升代表性羧基化合物混合溶液于ep管中，向其中分别添加10微升0、35、70、140、210、280、420mm的edc溶液，加入10微升35mm的hoat溶液、13微升480mm的sbph溶液和7微升的盐酸，每个用量有五个技术重复，涡旋混匀后在37摄氏度中孵育1小时(900rpm)。将上述混合物移至冰上冷却淬灭反应。后续检测条件同上。结果表明，当edc与待测物反应基团比例为100:1时，羧基化合物衍生物的峰面积最大，所以，edc与待测物反应基
团比例为100:1为最优的edc用量并用于后续的实验。
[0135]
(c)hoat与待测物反应基团(羧基)比例的选择：
[0136]
hoat与待测物反应基团比例的优化范围为其摩尔比0-75倍。
[0137]
通过准确吸取120微升代表性羧基化合物混合溶液于ep管中，向其中分别添加10微升140mm的edc溶液，加入10微升0、7、14、35、70、105mm的hoat溶液、13微升480mm的sbph溶液和7微升的盐酸，每个用量有五个技术重复，涡旋混匀后在37摄氏度中孵育1小时(900rpm)。将上述混合物移至冰上冷却淬灭反应。后续检测条件同上。结果表明，当hoat与待测物反应基团比例为10:1时，羧基化合物衍生物的峰面积最大，所以，hoat与待测物反应基团比例为10:1为最优的hoat用量并用于后续的实验。
[0138]
(d)sbph与待测物反应基团(羧基和酮羰基)比例的选择：
[0139]
代表性羧基化合物混合溶液中反应基团(羧基和酮羰基)的总浓度约为0.133mm。
[0140]
sbph与待测物反应基团比例的优化范围为其摩尔比50-500倍。
[0141]
通过准确吸取120微升代表性羧基化合物混合溶液于ep管中，向其中分别添加10微升140mm的edc溶液，加入10微升14mm的hoat溶液、13微升60、120、240、360、480、600mm的sbph溶液和7微升的盐酸，每个用量有五个技术重复，涡旋混匀后在37摄氏度中孵育1小时(900rpm)。将上述混合物移至冰上冷却淬灭反应。后续检测条件同上。结果表明，当sbph与待测物反应基团比例为200:1时，羧基化合物衍生物的峰面积最大，所以，sbph与待测物反应基团比例为200:1为最优的sbph用量并用于后续的实验。
[0142]
(e)反应温度的选择：
[0143]
温度的优化范围为25-80摄氏度，通过准确吸取120微升代表性羧基化合物混合溶液于ep管中，向其中分别添加10微升140mm的edc溶液，加入10微升14mm的hoat溶液、13微升240mm sbph溶液和7微升的盐酸，每个用量有五个技术重复，涡旋混匀后在25、37、50、60、80摄氏度中孵育1小时(900rpm)。将上述混合物移至冰上冷却淬灭反应。后续检测条件同上。结果表明，当反应温度为37摄氏度时，羧基化合物衍生物的峰面积最大，所以，37摄氏度为最优的反应温度并用于后续的实验。
[0144]
(f)反应时间的选择：
[0145]
反应时间的优化范围为10-120分钟，通过准确吸取120微升代表性羧基化合物混合溶液于ep管中，向其中分别添加10微升140mm的edc溶液，加入10微升14mm的hoat溶液、13微升240mm sbph溶液和7微升的盐酸，每个用量有五个技术重复，涡旋混匀后在37摄氏度中孵育10、20、30、60、90、120分钟(900rpm)。将上述混合物移至冰上冷却淬灭反应。后续检测条件同上。结果表明，当反应时间为60分钟时，羧基化合物衍生物的峰面积最大，所以，60分钟为最优的反应时间并用于后续的实验。
[0146]
(g)生物样本缩合剂和衍生化试剂用量的选择：
[0147]
由于生物样本中的羧基待测物的总量是未知的，我们选取羧基待测物种类和含量最为丰富的尿液样本，优化缩合剂和衍生化试剂的具体用量(详见图2)。在此优化过程中我们保持了edc、hoat、sbph之间的用量比例为100:10:200，通过准确吸取120微升尿液前处理上清液于ep管中，向其中分别添加不同浓度的10微升的edc溶液(200、400、600、800、1000mm)，加入10微升的hoat溶液(20、40、60、80、100mm)、13微升sbph溶液(300、600、900、1200、1500mm)和7微升的盐酸，每个用量有五个技术重复，涡旋混匀后在37摄氏度中孵育1
小时(900rpm)。将上述混合物移至冰上冷却淬灭反应。后续检测条件同上。结果表明，当sbph溶液浓度为600mm时，羧基化合物衍生物的峰面积最大，所以，400、40、600mm为最优的edc、hoat、sbph用量并用于后续的实验。
[0148]
通过上述筛选，确定了最佳衍生化反应条件为：准确吸取120微升工作液于ep管中，加入10微升400mm edc溶液、10微升40mm hoat溶液、13微升600mm sbph溶液和7微升盐酸，涡旋混匀后在37摄氏度中孵育1小时(900rpm)。将上述混合物移至冰上冷却淬灭反应。
[0149]
对于生物样本而言，上述120微升工作液分别用120微升上清液进行取代，其余条件不变。
[0150]
(3)衍生化效率的验证
[0151]
复杂样品中羧基化合物的存在形式包括脂肪酸、氨基酸、羟基酸、芳香酸、酮酸与多元羧酸等及其可能存在的手性对映异构体。
[0152]
为确保上述衍生化方法对上述物质均有良好的衍生化效率，将表2中代表性羧基化合物的标准储备液用乙腈-水(体积比1:1)溶液分别稀释至0.10mm，随后取上述羧基化合物的0.1mm溶液各10微升混合得到用于测定衍生化效率的两份平行样品，一份为实验组按上述最佳衍生化反应条件进行操作，另一份为对照组进行平行操作，但是用相同体积的乙腈-水(体积比1:1)代替sbph的加入，使用液相色谱-高分辨质谱检测，具体如下：
[0153]
色谱分析使用agilent zorbax eclipse plus c18色谱柱(2.1
×
100mm,1.8μm)，柱温设为50摄氏度，流动相a和b分别为含0.1％甲酸的水和乙腈，流速为0.5毫升每分钟，进样1微升。色谱洗脱梯度以流动相b的百分比表示为：0-5分钟，2-7％；5-6分钟，7％；6-7分钟，7-8％；7-12分钟，8-15％；12-24分钟，15-21％；24.1-27分钟，95％。质谱使用电喷雾电离源在正离子模式下进行记录，离子源温度为450摄氏度，离子化电压为3500伏，喷雾气和辅助加热气设置为50psi。sciex os软件用于数据采集与处理。
[0154]
我们计算对照组中未衍生的羧基化合物的质谱峰面积与实验组中未衍生的羧基化合物的质谱峰面积的差值，随后计算此差值与对照组中未衍生的羧基化合物的质谱峰面积的比值即可得到羧基化合物的衍生化效率。
[0155]
结果发现上述方法对代表性羧基化合物的衍生化效率很高(92.8-100.0％)，所有这些r-/s-对映异构体的衍生化效率的差异低于3％(具体见表2)。
[0156]
此外，我们还将亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苯乳酸、2-(4-羟基苯)丙酸、扁桃酸、2-羟基异己酸、2-羟基异戊酸和2-甲基琥珀酸的r构型和s构型的标准储备液分别稀释至0.10mm，随后取上述羧基化合物的r构型和s构型0.10mm稀释液各10微升混合分别得到r和s单一构型的羧基化合物混合溶液。对上述两个单一构型的羧基化合物混合溶液分别按上述最佳衍生化条件进行操作，后使用上述液相色谱-高分辨质谱检测条件进行测定。
[0157]
结果发现，在单一构型的手性羧基化合物衍生化后的色谱图中未见另一构型的手性羧基化合物衍生物，因此可认为在此衍生化过程中没有观察到衍生化引起的外消旋化的衍生物(具体见图3)。
[0158]
表2代表性羧基化合物的衍生化效率
[0159][0160]a衍生化效率比值:用sbph标记的r-/s-羧基对映异构体的衍生化效率的比值。
[0161]
效果实施例1s-苯甲酰脯氨酰肼(sbph)用于高覆盖羧基化合物的定性与定量分析
[0162]
检测样品：按照实施例2中的最佳衍生化反应条件对生物样本进行sbph衍生化。与此同时，用sbph-d5对内标工作液在相同条件下进行衍生化，作为内标使用。为了实现准确定量，将sbph衍生化的生物样本和sbph-d5衍生化的内标工作液以体积比为10:1的比例混合，用氮气干燥并重新溶解在乙腈-水(体积比5:95)中，进行lc-esi-ms/ms检测分析。
[0163]
测试方法：定量分析是在sciex qtrap 6500
+
质谱仪上进行的，该质谱仪配有电喷雾电离(esi)源，与shimadzu lc-30ad uplc系统联用。经过参数优化，色谱分析使用agilent zorbax eclipse plus c18色谱柱(2.1
×
100mm,1.8μm)，柱温设为50摄氏度，流动相a和b分别为含0.1％甲酸的水和乙腈，流速为0.5毫升每分钟，进样1微升。色谱洗脱梯度以流动相b的百分比表示为：0-4分钟，8％；4-7分钟，8-20％；7-11分钟，20-30％；11-15分钟，30-50％；15-18分钟，50-95％；18-19分钟，95-100％。其中0-18分钟为质谱采集时间。所有衍生化后的羧基化合物在正离子模式下采用多反应监测模式(mrm)进行定量分析，离子源温度为450摄氏度，离子化电压为3500伏，喷雾气和辅助加热气分别设置为35和50psi。sciex analyst和os(v1.7)软件分别用于数据采集与处理。
[0164]
测试效果：
[0165]
(1)定性分析
[0166]
对羧基化合物(l3高浓度质控品)进行sbph衍生化处理后，通过uplc-ms/ms可检测到267种羧基化合物，其中包含49种饱和脂肪酸、18种不饱和脂肪酸、44种氨基酸、50种羟基酸、20种酮酸、62种芳香酸和24种杂环酸(见图4-7，各序号对应的羧基代谢物具体见表3)。对于65组具有相同质核比的物质(包含同分异构体)均能通过该方法得以分离(图8-11)。以上表明该方法可有效应用于多数同分异构体的检测。
[0167]
(2)标准曲线的建立
[0168]
使用sbph-d5衍生化内标工作液作为内标，采用sbph衍生化上述逐级稀释的工作液l1-l16来获得标准曲线、线性范围和相关系数(r2)。在信噪比为3和10的情况下，分别得到各羧基化合物的检测限(lod)和定量限(loq)。结果表明，267个羧基化合物衍生化产物的
定量线性范围可覆盖2-4个数量级且线性良好(r2》0.99)，检测限(lod，信噪比3:1)与定量限(lloq，信噪比10:1)分别低于5*10-13
及2*10-12
摩尔，lod与loq的最低值可分别达到3*10-18
与9*10-18
摩尔(具体见表3)。
[0169]
表3.经sbph衍生化后的267种羧基化合物的检出限(lod)、最低定量限(loq)、线性范围及线性相关系数(r2)
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177][0178]
(3)日内和日间精密度测试
[0179]
采用上述最佳衍生化反应条件对上述低、中、高三个浓度水平的质控品进行sbph衍生化，在一天内每间隔四小时采集一次，共五次，和连续采集三天的日内差与日间差对精密度进行评估。方法学验证结果表明，在低(l)、中(m)、高(h)三个浓度水平，所有分析物的日内差与日间差cv均低于15％(表4)。
[0180]
表4.uplc-ms/ms定量分析267种羧基化合物的日内(n＝5)和日间(n＝3)精密度结果
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188][0189]
l，m，h分别代表低、中、高浓度的质控工作液；a：日内差cv(％)；b：日间差cv(％)
[0190]
(4)回收率测试
[0191]
同时用经典生物体液(人血浆与尿液)、粪样(人)和人源性细胞(a549)中的回收率评估了方法的准确度。分别在上述生物样本中加入低、中、高浓度水平的羧基化合物质控品，以未加质控品的生物样本作为对照组，计算实验组与对照组中测得羧基代谢物浓度的差值，然后计算该差值与实际加入的羧基化合物质控品浓度的比值。结果表明，在人血浆、尿液、粪样和细胞样品中添加上述低、中、高三个浓度水平的质控品的回收率均在80-120％之间(表5)。
[0192]
表5.uplc-ms/ms定量分析267种羧基化合物在人血浆、尿液、粪样和a549细胞样品中的回收率结果(n＝5)
[0193]
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216][0217]
l，m，h分别代表低、中、高浓度的质控工作液；a：人血浆；b：人尿液；c：人粪样；d：人a549细胞
[0218]
(5)方法的多种生物样品适用性
[0219]
按照实施例2中的最佳衍生化反应条件对经典生物样本进行衍生化及与内标混合，按上述测试方法进行数据采集与处理，后通过建立的标准曲线计算得到各生物样本中的羧基代谢物的定量结果。为将结果转换成单位质量或体积对应的含量，对各生物样本进行归一化处理，其中，血浆样本的定量结果采用样本体积归一化，粪样的定量结果采用样本干重归一化，细胞样本的定量结果采用样本湿重归一化，尿液的定量结果采用样本肌酐归一化，结果表明，
[0220]
此工作方法适用于经典生物体液(人血浆与尿液)、粪样(人)和细胞(a549)等复杂生物样本中羧基代谢物的定量分析(表6)。
[0221]
表6.几种典型复杂生物样本中羧基代谢物组成的定量结果(n＝5)
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230][0231]a平均值
±
标准差(μmol/mmol creatinine)；b平均值
±
标准差(μm)；c平均值
±
标准差(pmol/mg)；n/a：未测到。
[0232]
(6)对尿液中肌酐水平的定量检测
[0233]
以肌酐-d3作为内标，采用与效果实施例1的测试方法相同的色谱与质谱条件进行数据采集与处理，肌酐在0.002-49.6mm的浓度范围内具有良好的线性关系，具有优异的精密度(日内和日间cv《10％)和回收率(94.8％-113.5％)，能够覆盖人尿液中高浓度的肌酐水平。通过建立的标准曲线可计算得到各尿液样本中的肌酐定量结果。
[0234]
由上述数据可知，测得的人粪样中羧基代谢物组成定量值与参考文献【1】报告结果相近。其它样品中羧基代谢物组成定量数据在文献中报道不常见。
[0235]
基于本技术探针所建立的定量分析方法简单快速，能在18分钟的检测时间内完成267种羧基代谢物及肌酐的定量分析，适合大样本高通量分析。与现有基于探针增敏的uplc-ms/ms检测技术相比，参考文献【1】虽然比本技术的检测时间略短，但其覆盖范围仅为短链脂肪酸，远小于本技术。参考文献【2】和【3】的羧酸覆盖度相较于参考文献【1】略有提高，但其分析时间明显增加，是本技术的2-3倍。参考文献【4】和【5】的羧酸覆盖度是目前报道的羧酸中较优的，但其未对羧酸进行绝对定量分析，此外，参考文献【4】中仅对八个羧酸进行了检出限的评估，其检出限为10-200fmol，明显高于本技术的检测限0.003-51.9fmol(除邻苯二甲酸为408fmol)。参考文献【6】和【7】是基于碳酰肼类增敏探针实现羧基化合物定量检测的报道，其中参考文献【6】的覆盖盖范围仅为三萜酸类羧基化合物，与本技术中检测的羧基化合物无重叠部分，不作比较，参考文献【7】的覆盖范围仅为脂肪酸且仅为相对定量，无检出限等数据。
[0236]
同时考虑检测覆盖度、灵敏度和效率三个方面，本技术明显优于传统方法(表7)。
[0237]
表7.本技术探针与现有文献探针的检测覆盖度、灵敏度和检测效率
[0238]
[0239][0240]
效果实施例2：s-苯甲酰脯氨酰肼用于手性羧酸的定量分析
[0241]
检测样品：按照效果实施例1中的条件对工作液及生物样本进行前处理和sbph或sbph-d5衍生化。
[0242]
测试方法：定量分析除色谱洗脱梯度外，与效果实施例1中的条件相同。色谱洗脱梯度以流动相b的百分比表示为：0-5分钟，2-7％；5-6分钟，7％；6-7分钟，7-8％；7-12分钟，8-15％；12-24分钟，15-21％；24.1-27分钟，95％。
[0243]
测试效果：
[0244]
30对手性羧酸经sbph衍生化处理后，形成了性质不同的非对映异构体，从而可在普通c18反相色谱柱上实现30对手性羧酸对映异构体的分离(图12，表8)。
[0245]
本效果实施例中仅关注表1中编号范围为216-268的羧基化合物。检测结果如下：
[0246]
表8.30对手性羧酸的uplc-ms/ms检测数据
[0247]
[0248][0249]a保留时间(min)；b分离度；c质谱响应比值。
[0250]
由上表可知，本技术显示出以下几个明显的优势：(1)首先本技术能同时对手性α-氨基酸(α-aa)、手性α-羟基酸(α-ha)、手性α-甲基酸(α-ma)进行手性拆分并定量，这点此前未见报道；带有仲胺的氨基酸或不带氨基的羧酸不能被参考文献【8】和【9】中基于醛的手性识别探针所标记。(2)本技术可同时分离手性羧酸的同分异构体及其对映异构体(如r-/s-亮氨酸和r-/s-异亮氨酸)，而且这些手性羧酸未见衍生化引起的外消旋现象(如图2所示，我们在单一构型的手性羧酸衍生化后的色谱图中未见另一构型的手性羧酸，可认为未见衍生化引起的外消旋现象)。(3)r-/s-对映异构体具有相同的衍生化效率和相似的质谱响应，使得当无法获得两个纯对映异构体时，可使用其中一个对映异构体或混合的外消旋体作为分析对照品进行定量分析(如rs-2-甲基戊酸和s-2-甲基戊酸均可用于定量r-/s-2-甲基戊酸)。(4)过量的缩合试剂及其副产物在所有待测物的前端洗脱，过量的sbph也在无待测物洗脱的时间(保留时间＝7分钟)被洗脱，因此都很容易被转移至废液中，以避免进入离子源引起电离抑制。(5)在本技术中所有测试的手性α-氨基酸和手性α-甲基酸的sbph标记的s-对映异构体在c18反相色谱柱上的保留比相应的r-对映异构体更好。相反，所有的手性α-羟
基酸的sbph标记的r-对映异构体在c18反相色谱柱上的保留比相应的s-对映异构体更好。因此当任一纯对映异构体都无法获得时，这对识别r-和s-对映异构体非常有用。例如，sbph标记的rs-α-羟基马尿酸的两个色谱峰很容易被识别，因为其r-对映体的保留比s-对映体弱。
[0251]
此外，上表中提及的绝大多数手性羧酸采用其标准化学品判断哪一个峰是r或s构型。也可通过上述第(5)点所提到的规律，通过其所属的羧酸类型对其色谱峰的构型进行指认。
[0252]
(2)标准曲线的建立
[0253]
采用与效果实施例1相同的方法建议标准曲线，方法学验证结果表明，60个手性羧酸对映异构体的定量线性范围可覆盖2-5个数量级且线性良好(r2》0.992)，检测限(lod，信噪比3:1)与定量限(loq，信噪比10:1)分别低于4*10-15
及9*10-15
摩尔，lod与loq的最低值可分别达到1*10-18
与3*10-18
摩尔(表9)。
[0254]
表9.经sbph衍生化后30对手性羧酸的检出限(lod)、最低定量限(loq)、线性范围及线性相关系数(r2)
[0255]
[0256]
[0257][0258]
(3)日内和日间精密度测试
[0259]
采用效果实施例1相同的方法对低、中、高三个浓度水平的质控品进行sbph衍生化，以进行精密度测试。结果表明，所有分析物的日内差与日间差cv均低于15％(表10)
[0260]
表10.uplc-ms/ms定量分析30对手性羧酸的日内(n＝5)和日间(n＝3)精密度结果
[0261]
[0262][0263]
l，m，h分别代表低、中、高浓度的质控工作液；a：日内差cv(％)；b：日间差cv(％)
[0264]
(4)回收率测试
[0265]
采用与效果实施例1相同的方法进行回收率测试，测试结果表明在人血浆、尿液、粪便和a549细胞样品中的回收率均在80-120％之间(表11)
[0266]
表11.uplc-ms/ms定量分析30对手性羧酸在人血浆、尿液、粪样和细胞样品中的回收率结果(n＝5)
[0267]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271][0272]
l，m，h分别代表低、中、高浓度的质控工作液；a：人血浆；b：人尿液；c：人粪样；d：人a549细胞
[0273]
由上可知，这种基于sbph的uplc-ms/ms方法适合于在四种不同的生物基质中对这60种手性羧酸对映体进行精确的同步定量分析。
[0274]
(5)方法的多种生物样品适用性
[0275]
采用与效果实施例1相同的方法进行测试，结果表明，此工作方法适用于经典生物体液(人血浆与尿液)、粪样(人)和细胞(a549)等复杂生物样本中手性羧酸的定量分析(表12)。测得的人尿液中手性羧酸定量值与参考文献【9】报告结果相近。其它样品中手性羧酸组成定量数据在文献中报道不常见。
[0276]
表12.几种典型复杂生物样本中羧基代谢物组成的定量结果(n＝6)
[0277]
[0278]
[0279][0280]a平均值
±
标准差(μmol/mmol creatinine)；b平均值
±
标准差(μm)；c平均值
±
标准差(pmol/mg)；n/a：未测到。
[0281]
由上述数据可知，本技术提供的基于羧基化合物增敏探针所建立的定量分析方法可实现包括手性α-氨基酸、手性α-羟基酸和手性α-甲基酸在内的手性羧酸代谢物的同分异构体和对映异构体在常规反相色谱条件下的分离，从而可对其进行定量分析，定量限为0.003-8.457fmol。与现有基于探针增敏的手性羧酸检测技术相比，参考文献【8】的检测覆盖度最优，但其检测定量
[0282]
限也略高。参考文献【9】较参考文献【8】的检测灵敏度略有提高，但其检测覆盖度较小。参考文献【10-12】的检测时间略有缩短，特别是参考文献【12】表现出较优的检测灵敏度，但其检测覆盖度较少。同时考虑检测覆盖度、灵敏度和效率三个方面，本技术明显优于传统方法(表13)。
[0283]
表13.本技术探针与现有文献探针的检测覆盖度、灵敏度和检测效率
[0284]
[0285][0286]
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[0287]
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技术特征：
1.如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐，其中，带“*”的碳原子表示为手性碳原子，以r构型、s构型、或r构型和s构型混合的形式存在。2.如权利要求1所述的如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐，其特征在于，其满足下述条件中的一个或多个：(1)如式i所示的化合物中至少有一个1h被2h取代；(2)如式i所示的化合物中至少有一个
12
c被其较重的同位素
13
c取代；(3)如式i所示的化合物中至少有一个
14
n被其较重的同位素
15
n取代；(4)如式i所示的化合物中至少有一个
16
o被其较重的同位素
18
o取代；和(5)如式i所示的化合物的同位素标记物的盐为如式i所示的化合物的同位素标记物与盐酸形成的盐，优选地，为如式i所示的化合物的同位素标记物与盐酸以摩尔比为1:1形成的盐。3.如权利要求1所述的如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐，其特征在于，所述如式i所示的化合物的同位素标记物为如下任一化合物：
4.一种如权利要求1-3任一项所述的如式i所示的化合物的同位素标记物的制备方法，其包括以下步骤：在溶剂中，在碱存在下，“如式ii所示化合物或其盐”与如式iii所示化合物、水合肼进行如下所示的偶联反应，形成如式i所示的化合物的同位素标记物，即可；其中，带“*”的碳原子表示为手性碳原子，以r构型、s构型、或r构型和s构型混合的形式存在；所述如式ii所示的化合物、如式iii所示的化合物或水合肼中，至少有一个原子的同位素丰度与其自然丰度不同。5.如权利要求4所述的如式i所示的化合物的同位素标记物的制备方法，其特征在于，其满足下述条件中的一个或多个：(1)所述偶联反应中，所述溶剂选自卤代烷烃类溶剂(例如二氯甲烷和/或四氯化碳)、
苯类溶剂(例如甲苯)和醚类溶剂(例如四氢呋喃和/或乙醚，更例如为带分子筛的无水四氢呋喃)中的一种或多种，优选为醚类溶剂；(2)所述偶联反应中，所述碱为无机碱和/或有机碱，所述有机碱可为三乙胺和/或吡啶，所述无机碱可选自碳酸盐(例如碳酸钾和/或碳酸钠，又例如碳酸钾)、碳酸氢盐(例如碳酸氢钠)和氢氧化物(例如氢氧化钠和/或氢氧化钾)中的一种或多种，优选为碳酸盐；(3)所述偶联反应中，所述如式ii所示的化合物的盐为如式ii所示的化合物的盐酸盐；(4)所述偶联反应中，所述碱与所述“如式ii所示化合物或其盐”的摩尔比为2:1-10:1，例如3:1；(5)所述偶联反应中，所述如式iii所示化合物与所述“如式ii所示化合物或其盐”的摩尔比可为0.5:1-5:1，例如0.9:1；(6)所述偶联反应中，所述水合肼与所述“如式ii所示化合物或其盐”的摩尔比为10:1-500:1，例如100:1；(7)所述偶联反应中，所述“如式ii所示化合物或其盐”在所述溶剂中的摩尔浓度为0.001-10mol/l，例如0.06mol/l；(8)所述偶联反应中，各物料的加料顺序为所述如式iii所示的化合物加入到“如式ii所示化合物或其盐”和碱中(优选在冰浴条件下滴加，后室温反应30分钟)，再加入水合肼和醇类溶剂(所述醇类溶剂优选为甲醇，优选加入后室温反应1小时)；和(9)所述偶联反应还包括如下后处理步骤：去除溶剂(优选旋蒸去除)、萃取(优选用二氯甲烷萃取)、洗涤(优选用饱和碳酸钠溶液洗涤)、干燥(优选用无水硫酸镁干燥)、过滤、去除溶剂(优选旋蒸去除)和冻干。6.一种用于检测和/或分离物质x的组合物，其包括：组分a以及缩合剂；所述组分a为：(1)如式i所示的化合物或其盐，和/或(2)如权利要求1-3任一项如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐；带“*”的碳原子表示为手性碳原子，以r构型、s构型、或r构型和s构型混合的形式存在；所述物质x为含羰基的化合物，所述含羰基化合物指含羧基、醛羰基和酮羰基中一种或多种的化合物。7.如权利要求6所述的用于检测和/或分离物质x的组合物，其特征在于，其满足下述条件中的一个或多个：(1)所述物质x为含羧基的化合物，所述含羧基的化合物为小分子羧基化合物，例如分子量小于1000da的羧基化合物；例如羧基代谢物，更例如为人血浆、人尿液、人粪样或人源性细胞a549中的羧基代谢物；(2)所述缩合剂选自hatu、hbtu、hctu、tbtu、tstu、dmtmm、edc、tpp和hoat中的一种或多种；优选为edc、hoat或“edc和hoat的组合”；edc和hoat的组合中，所述edc与所述组分a的摩
尔比可为100:1-1:100，例如20:40；所述hoat与所述组分a的摩尔比可为100:1-1:100，例如2:40；(3)所述缩合剂与所述组分a的摩尔比可为1:10-10:1，例如22:40；(4)当所述组分a为如式i所示的化合物和/或如式i所示的化合物的同位素标记物时；所述组合物还进一步包含酸，所述的酸优选为盐酸，更优选为1m盐酸；和(5)所述组合物为以下任一组合物：a)所述组合物由下述组分组成：组分a；以及缩合剂；b)所述组合物由下述组分组成：组分a；缩合剂；以及酸。8.物质a作为衍生化试剂的应用，所述衍生化试剂用于检测和/或分离物质x，所述物质a为(i)如式i所示的化合物或其盐；(ii)如权利要求6或7所述的组合物；或(iii)如权利要求1-3任一项所述的如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐；带“*”的碳原子表示为手性碳原子，以r构型、s构型、或r构型和s构型混合的形式存在；所述物质x为含羰基的化合物，所述含羰基化合物指含羧基、醛羰基和酮羰基中一种或多种的化合物。9.如权利要求8所述的物质a作为衍生化试剂的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：(1)所述物质a与样品进行衍生化反应，得到衍生化产物；所述样品包括物质x；(2)采用液相色谱-质谱联用技术，将衍生化产物分离和/或检测，即可。10.如权利要求9所述的物质a作为衍生化试剂的应用，其特征在于，其满足下述条件中的一个或多个：(1)当物质a为所述“如式i所示的化合物或其盐”或所述“如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐”时，步骤(1)还加入缩合剂；所述缩合剂可选自hatu、hbtu、hctu、tbtu、tstu、dmtmm、edc、tpp和hoat中的一种或多种；优选为edc、hoat或“edc和hoat的组合”；edc和hoat的组合中，所述edc与所述“如式i所示的化合物或其盐”或所述“如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐”的摩尔比可为100:1-1:100，例如20:40；所述hoat与所述“如式i所示的化合物或其盐”或所述“如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐”的摩尔比可为100:1-1:100，例如2:40；(2)所述衍生化反应在酸性条件下进行，所述酸性条件优选为盐酸，更优选为1m盐酸；所述盐酸与所述衍生化反应的反应体系的体积比可为0.5-10％，例如4.5％；(3)所述衍生化反应在溶剂中进行，所述溶剂优选为腈类溶剂(例如乙腈)和水，更优选地体积比为1:1的乙腈和水；所述物质a中，所述“如式i所示的化合物或其盐”或所述“如式i所示的化合物的同位素标记物或其盐”与所述样品中的反应基团的摩尔比可为10:1-500:1，例如200:1；(4)所述衍生化反应的反应温度可为20-80℃，例如37℃；
(5)所述衍生化反应的反应时间可为10-120分钟，例如60分钟；(6)所述液相色谱-质谱联用技术中，液相色谱的色谱条件优选为：色谱柱为反相色谱柱(例如agilent zorbax eclipse plus c18色谱柱)；柱温为40至55摄氏度(例如50摄氏度)，流动相a和b分别为含0.005％-0.5％甲酸的水和乙腈，或分别为水和甲醇(优选分别为0.1％甲酸的水和乙腈)，流速为0.2至0.5毫升每分钟(例如0.5毫升每分钟)，进样0.5至5微升(例如1微升)，梯度洗脱；较佳的，所述梯度洗脱的梯度以流动相b的百分比表示，为：0-4分钟，8％；4-7分钟，8-20％；7-11分钟，20-30％；11-15分钟，30-50％；15-18分钟，50-95％；18-19分钟，95-100％；或者，所述梯度洗脱的梯度以流动相b的百分比表示，为0-5分钟，2-7％；5-6分钟，7％；6-7分钟，7-8％；7-12分钟，8-15％；12-24分钟，15-21％；24.1-27分钟，95％；和(7)所述液相色谱-质谱联用技术中，质谱的分析条件可采用正离子模式下的多反应监测模式，进一步地还可为：离子源温度为350至550摄氏度(例如450摄氏度)，离子化电压为3500至5500伏(例如3500伏)，喷雾气压强为40至55psi(例如35psi)，辅助加热气的压强为40至60psi(例如50psi)。

技术总结
本发明公开了一种酰肼类化合物作为衍生化试剂的应用，具体公开了如式I所示的化合物的同位素标记物或其盐，如式I所示的化合物的同位素标记物的制备方法，用于检测和/或分离物质X的组合物，以及物质A作为衍生化试剂的应用。本发明的化合物合成方法简单、试剂廉价易得，可实现同时检测多种含羰基的化合物(包括含羧基、醛羰基和酮羰基中一种或多种的化合物)，作为衍生化试剂时具有高覆盖度、高灵敏度和低定量限的优点。和低定量限的优点。和低定量限的优点。和低定量限的优点。


技术研发人员：唐惠儒 孙玉婷 胡庆宇
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/9