一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法及应用

1.本发明属于中药分析检测领域，具体涉及一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法及应用。


背景技术：

2.心痛舒喷雾剂是由牡丹皮、川芎及冰片三味中药制备而成，批准文号：国药准字 z20194075，在临床上被用于治疗痰浊瘀血痹阻心脉而致的冠心病心绞痛，其经舌下喷雾给药，被毛细血管吸收后直接进入体循环，起效快，在心血管病急救方面具有独特优势。牡丹皮具有活血化瘀的功效，现代药理研究表明，牡丹皮中丹皮酚等通过抑制血小板聚集、抗调理素以及稳定红细胞膜等抑制血栓的形成。川芎被广泛应用于治疗痰浊瘀血痹阻心脉而致的心脑血管病的中药复方中，在王清任著《医林改错》一书中被后世总概为“五逐瘀汤”的5种方剂中，川芎均被使用，由此可见，川芎在活血化瘀理论中扮演着重要角色。冰片则对其他药物有促进吸收、影响分布、抑制代谢的作用, 有利于减少用药量, 延长药物作用时间, 从而提高药物疗效。由此可见本复方虽然只有简单的三味中药，但却配伍精妙，各味中药相辅相成，共同发挥药效作用。
3.心痛舒喷雾剂现行的质量控制标准收载于国家药品标准新药转正标准第42册，主要为单味药材的薄层鉴定及单一成分的含量测定，无法反映出心痛舒喷雾剂整体的质量情况。指纹图谱作为中药质量控制的一种常用手段，可以准确完整的反映中药的整体质量特征，通过分析不同批次药品与标准图谱的相似度可以进行质量优劣评价与真伪鉴定；也可以通过与对照品和阴性样品对比，对复方中的特征峰进行定性鉴别和归属，亦可以联用化学计量学分析复方中含量易于变化的成分，对其进行重点质控。因此建立一种高效准确的指纹图谱分析方法，对心痛舒喷雾剂的质量控制具有重要意义，有利于其生产，质检和临床推广应用。


技术实现要素：

4.鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法及应用，本发明构建的hplc标准指纹图谱方法稳定且可靠，可以准确、清晰的反映心痛舒喷雾剂的质量，对于心痛舒喷雾剂质量的控制与提升及临床的推广与应用具有重要价值。
5.本发明是通过以下技术方案实现：一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法和应用，包括如下步骤：(a) 供试品溶液的制备：精密吸取心痛舒喷雾剂药液至容量瓶中，加入甲醇稀释定容，过滤取续滤液即得供试品溶液；(b) 混合对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯i、丹皮酚对照品至容量瓶中，加甲醇稀释定容，过滤，取续滤液即得混合对照品溶液；
(c) 高效液相色谱检测：分别吸取混合对照品溶液和多个批次供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，获取色谱图，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈(a)-0.1%甲酸(b)；体积流量为0.8 ml/min；柱温为30℃；进样量为10 μl；梯度洗脱程序为：0～10min，10%～15%a；10～24min，15%～25%a；24～28min，25%～26%a；28～30min，26%～30%a；30～48min，30%～57%a；48～52min，57%～80%a；52～57min，80%～10%a；57～62min，10%a；检测波长为254nm；(d) 标准指纹图谱的建立：将获取的色谱图导入2012版中药指纹图谱相似度评价软件，将s1批次设为参照图谱，对照图谱生成方法选择平均数法，时间窗宽度设为0.1，经过多点校正后进行峰匹配获得标准指纹图谱。
6.优选地，步骤(a)中，所述甲醇的质量浓度为 70%～80%，稀释倍数为15～25倍。
7.优选地，步骤(b)中，所述甲醇的质量浓度为70%～80%。
8.优选地，步骤(c)中，色谱柱为east laboratory epic c18，规格为4.6 mm
×
250 mm，5 μm。
9.优选地，步骤(d)中，通过对照品指认了8个特征峰，分别是5号峰没食子酸、9号峰氧化芍药苷、10号峰绿原酸、14号峰咖啡酸、17号峰芍药苷、21号峰阿魏酸、27号峰洋川芎内酯i、31号峰丹皮酚。
10.本发明还提供了所述的一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法在质量检测中的应用。将待测的心痛舒喷雾剂样品的色谱图与标准指纹图谱进行相似度计算，根据相似度计算结果对待测样品的质量进行评价，相似度大于0.9则为合格，反之则为不合格。
11.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：本发明采用hplc法，首次建立了心痛舒喷雾剂的标准指纹图谱，方法灵敏度高，专属性强，易于操作且结果准确，非常适用于该制剂的质量分析研究。与现有技术相比，本发明解决了心痛舒喷雾剂评价指标单一的问题，能够高效、全面的反映整体的质量情况。本发明可以将待测的心痛舒喷雾剂样品的色谱图与标准指纹图谱进行相似度计算，根据相似度计算结果对待测样品的质量进行评价，有利于企业和质检部门对心痛舒喷雾剂的质量进行控制和鉴定，有利于其在临床上的使用和推广。
附图说明
12.图1是13个批次供试品的指纹图谱及其对照图谱；图2是混合对照品、缺川芎阴性样品，缺牡丹皮阴性样品色谱图及对照图谱；图3是采用不同流动相的供试品色谱图；图4是采用不同检测波长的供试品色谱图；图5是采用不同柱温的供试品色谱图；图6是采用不同流速的供试品色谱图；图7是采用不同稀释溶剂的供试品色谱图；图8是采用不同洗脱梯度程序的供试品色谱图。
实施方式
13.为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实
施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
14.1仪器与试药1.1仪器waters 2489型高效液相色谱仪(美国waters公司); yl-060st型超声波清洗器(深圳市语路清洗设备有限公司)；ab135-s型电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；1.2试药心痛舒喷雾剂供试品13批（批号分别为20221001、20221002、20221003、20221004、20221005、20221006、20221007、20221008、20221009、20221010，20220101、20220201、20220202，编号为s1-s13，均由华佗国药股份有限公司提供）；牡丹皮，川芎，冰片药材，均由华佗国药股份有限公司提供；没食子酸（批号j05gb153704）、氧化芍药苷（批号n26gb169459）、绿原酸（批号a22gb158496）、阿魏酸（批号g13s11l124423）、洋川芎内酯i（批号pz7a11f122339）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98.0%；咖啡酸（批号ps010522）、芍药苷（批号ps000825）、丹皮酚（批号ps000281）对照品均购于成都普思生物科技有限公司，纯度均≥98.0%；乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯）均购自上海安耐吉科技有限公司、甲酸（分析纯），水为哇哈哈纯净水。
15.2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为east laboratory epic c18(4.6 mm
×
250 mm,5 μm);流动相为乙腈(a)-0.1%甲酸(b);体积流量为0.8 ml/min;柱温为30℃;进样量为10 μl;梯度洗脱程序：0～10min,10%～15%a;10～24min,15%～25%a;24～28min,25%～26%a;28～30min,26%～30%a;30～48min,30%～57%a;48～52min,57%～80%a;52～57min,80%～10%a;57～62min,10%a；检测波长为254 nm。
16.2.2溶液的制备2.2.1供试品溶液的制备精密吸取心痛舒喷雾剂药液1 ml，至20 ml容量瓶中，加入75%甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm有机微孔滤膜，取续滤液即得供试品溶液。
17.2.2.2混合对照品溶液的制备精密称取适量没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯i、丹皮酚对照品至容量瓶中，加75%甲醇配制成质量浓度分别为0.0690、0.0728、0.0348、0.0110、0.3660、0.0242、0.0314、0.3790 mg/ml的混合对照品溶液。
18.2.2.3阴性样品溶液制备按照处方中各药材比例与制备工艺，制得缺川芎、缺牡丹皮的阴性样品，按“2.2.1”项下方法制备，即得阴性样品溶液。
19.2.3方法学考察2.3.1精密度取s1号供试品，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，连续进样6次，获取色谱图，以31号峰丹皮酚为参照峰，计算得到各特征峰相对保留时间rsd
《0.13%；相对峰面积rsd《2.99%。使用2012版中药指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，结果为1.000，符合中药指纹图谱的要求。
20.2.3.2重复性取s1号供试品，按2.2.1项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，获取色谱图，以31号峰丹皮酚为参照峰，计算得到各特征峰的相对保留时间rsd《0.18%，相对峰面积rsd《4.46%。使用2012版中药指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，结果为1.000，符合中药指纹图谱的要求。
21.2.3.3稳定性取s1号供试品，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按2.1项下色谱条件进行检测，获取色谱图，以31号峰丹皮酚为参照峰，计算得到各特征峰的相对保留时间rsd《0.21%，相对峰面积rsd《3.51%。使用2012版中药指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，结果为1.000，符合中药指纹图谱的要求。
22.2.4指纹图谱的建立和相似度评价取13批次编号为s1-s13的供试品，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测，将获取的色谱图导入2012版中药指纹图谱相似度评价软件，将s1批次设为参照图谱，对照图谱生成方法选择平均数法，时间窗宽度设为0.1，经过多点校正后进行峰匹配获得对照图谱r及13个批次样品的叠加图谱，如图1所示。共标定特征峰33个，其中31号峰（丹皮酚）峰面积最大，分离度较好，故选择31号峰为参照峰。各批次供试品色谱图与对照图谱的相似度结果均大于0.994，表明各批次供试品之间的差异性较小，13个批次供试品质量均合格。如表1所示。
23.表1 13批供试品相似度评价结果
24.2.5 共有峰的指认和归属取2.2.2项下混合标准品溶液、2.2.3项下阴性样品溶液，按2.1项下色谱条件进行检测获得色谱图。如图2所示，将对照图谱r与混合对照品色谱图比对，指认了33个特征峰中的8个峰，分别是5号峰（没食子酸）、9号峰（氧化芍药苷）、10号峰（绿原酸）、14号峰（咖啡
酸）、17号峰（芍药苷）、21号峰（阿魏酸）、27号峰（洋川芎内酯i）、31号峰（丹皮酚）。将对照图谱r与缺川芎、缺牡丹皮的阴性样品色谱图进行对比，33个特征峰中2、3、5、9、12、16～20、22、23、25、26、28～31号等18个峰归属于牡丹皮；1～4、6～8、10、11、13～15、21、24、25、27、28、32、33号等19个峰归属于川芎，其中2、3、25、28号峰同时归属于牡丹皮和川芎。
25.3 色谱条件优化3.1流动相的优化本发明考察了甲醇(a)-水(b)、甲醇(a)-0.1%甲酸(b)、乙腈(a)-水(b)、乙腈(a)-0.1%甲酸(b)四种不同的流动相体系，如图3所示，由于甲醇-水流动相体系比乙腈-水流动相体系洗脱能力弱，色谱峰较靠后，增加了分析时间，因此选择了洗脱能力较强的乙腈-水流动相体系。对比乙腈-水与乙腈0.1%甲酸流动相体系又可发现，在水相中添加了0.1%的甲酸后，色谱峰的数目和响应均有所增加，因此最终选择乙腈(a)-0.1%甲酸(b)为流动相。
26.3.2 波长的优化本发明考察了230nm、240nm、254nm、260nm、270nm、280nm、300nm、320nm 8种不同的检测波长，如图4所示，在230nm和240nm检测波长下，均有不同程度的末端吸收，且色谱峰少响应也较低；在270nm、280nm、300nm和320nm检测波长下色谱峰较少，在260nm和254nm两个检测波长下，色谱图比较相似，但在254nm波长下色谱峰的数量和分离度都相对较好，故本发明选择254nm作为检测波长。
27.3.3 柱温的优化本发明考察了25℃、30℃、35℃三种不同的柱温，如图5所示，柱温在30℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故最终选择30℃作为本发明的色谱柱柱温；3.4 流速的优化本发明考察了0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min三种不同的流速，如图6所示，随着流速的提高，样品出峰时间也随之提前，但流速为0.8 ml/min时，色谱峰的分离度最好，也较节省溶剂，因此流速最终选择0.8 ml/min。
28.3.5 供试品稀释溶剂的优化本发明考察了10%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇四种不同的供试品稀释溶剂，如图7所示，当采用10%甲醇和50%甲醇做稀释溶剂时，色谱图峰面积降低，可能的原因是心痛舒喷雾剂中绝大多数成分为脂溶性成分，当稀释溶剂中水的含量升高时导致脂溶性成分不溶解，色谱峰面积降低；当采用甲醇作为样品稀释溶剂时，没食子酸和绿原酸色谱峰均发生了前沿与分叉，推测产生了溶剂化效应。故最终选择75%甲醇作为稀释溶剂，色谱图峰型较为对称。
29.3.6 梯度洗脱程序的优化本发明考察了7种不同的梯度洗脱程序，如图8所示，方法1和方法2色谱峰较少，很多化学成分没有响应，分离度较低；方法3基于方法2进行改进，可见色谱峰增加，但在保留时间28.5 min和30.5 min处出现变形峰；方法4较方法3进一步优化，但在保留时间26.5 min处分离度较差；方法5和方法6较方法4增加了有机相比例和洗脱时间，发现在牡丹皮峰之后还有上述方法下未洗脱出来的色谱峰；方法7较方法6进一步优化，洗脱时间增至62 min，最高有机相比例增至80%，各色谱峰分离度较好，出峰多，方法稳定，故最终选择方法7为本发明的梯度洗脱程序。
30.方法1：乙腈(a)-0.1%甲酸(b)，0～8min,10%～12%a; 8～20min,12%～25%a;20-40min,25%～45%a;40～45min,45%～70%a;45～50min,70%～10%a;50～55min,10%a。
31.方法2：乙腈(a)-0.1%甲酸(b)，0～10min,10%～15%a;10～30min,15%～30%a;30-40min,30%～60%a;40～45min,60%～10%a;45～50min,10%a。
32.方法3：乙腈(a)-0.1%甲酸(b)，0～10min,10%～15%a;10～30min,15%～25%a;30-40min,25%～60%a;40～45min,60%～10%a;45～50min,10%a。
33.方法4：乙腈(a)-0.1%甲酸(b)，0～10min,10%～15%a;10～24min,15%～25%a;24-28min,25%～26%a;28～30min,26%～30%a;30～40min,30%～60%a，40～45min,60%～10%a;45～50min,10%a。
34.方法5：乙腈(a)-0.1%甲酸(b)，0～10min,10%～15%a;10～24min,15%～25%a;24-28min,25%～25%a;28～30min,25%～30%a;30～45min,30%～75%a，45～50min,75%～10%a;50～55min,10%a。
35.方法6：乙腈(a)-0.1%甲酸(b)，0～10min,10%～15%a;10～24min,15%～25%a;24-28min,25%～26%a;28～30min,26%～30%a;30～50min,30%～60%a，50～55min,60%～10%a;55～60min,10%a。
36.方法7：乙腈(a)-0.1%甲酸(b)，0～10min,10%～15%a; 10～24min,15%～25%a;24-28min,25%～26%a;28～30min,26%～30%a;30～48min,30%～57%a;48～52min,57%～80%a;52～57min,80%～10%a;57～62min,10%a。
37.将待测的心痛舒喷雾剂样品的色谱图与标准指纹图谱进行相似度计算，根据相似度计算结果对待测样品的质量进行评价，相似度大于0.9则为合格，反之则为不合格。

技术特征：
1.一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：（a）供试品溶液的制备：精密吸取心痛舒喷雾剂药液至容量瓶中，加入甲醇稀释定容，过滤取续滤液即得供试品溶液；（b）混合对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯i、丹皮酚对照品至容量瓶中，加甲醇稀释定容，过滤，取续滤液即得混合对照品溶液；（c）高效液相色谱检测：分别吸取混合对照品溶液和多个批次供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，获取色谱图，其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为乙腈(a)-0.1%甲酸(b)；体积流量为0.8 ml/min；柱温为30℃；进样量为10 μl；梯度洗脱程序为：0～10min，10%～15%a；10～24min，15%～25%a；24～28min，25%～26%a；28～30min，26%～30%a；30～48min，30%～57%a；48～52min，57%～80%a；52～57min，80%～10%a；57～62min，10%a；检测波长为254nm；（d）标准指纹图谱的建立：将获取的色谱图导入2012版中药指纹图谱相似度评价软件，将s1批次设为参照图谱，对照图谱生成方法选择平均数法，时间窗宽度设为0.1，经过多点校正后进行峰匹配获得标准指纹图谱。2.根据权利要求1所述的一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(a)中，所述甲醇的质量浓度为 70%～80%，稀释倍数为15～25倍。3.根据权利要求1所述的一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(b)中，所述甲醇的质量浓度为70%～80%。4.根据权利要求1所述的一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(c)中，色谱柱为east laboratory epic c18，规格为4.6 mm
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250 mm，5 μm。5.根据权利要求1所述的一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤(d)中，通过对照品指认了8个特征峰，分别是5号峰没食子酸、9号峰氧化芍药苷、10号峰绿原酸、14号峰咖啡酸、17号峰芍药苷、21号峰阿魏酸、27号峰洋川芎内酯i、31号峰丹皮酚。6.根据权利要求1-5任一项所述的一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法在质量检测中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将待测的心痛舒喷雾剂样品的色谱图与标准指纹图谱进行相似度计算，根据相似度计算结果对待测样品的质量进行评价，相似度大于0.9则为合格，反之则为不合格。

技术总结
本发明公开了一种心痛舒喷雾剂指纹图谱的建立方法及应用，主要包括以下步骤：供试品溶液的制备；混合对照品溶液的制备；高效液相色谱检测；标准指纹图谱的建立；该方法构建的HPLC标准指纹图谱共有33个特征峰，有效指认了没食子酸、氧化芍药苷、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯I、丹皮酚等8个成分，该方法稳定且可靠，可以准确、清晰的反映心痛舒喷雾剂质量的优劣，对于本制剂质量的控制与提升及临床的推广与应用具有重要价值。临床的推广与应用具有重要价值。临床的推广与应用具有重要价值。


技术研发人员：彭灿 梁万徽 汪杰 刘艳 左池靖 张静 王茜 彭代银
受保护的技术使用者：安徽中医药大学
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/8/9