一种利用SSR分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交F1杂种的方法

一种利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法。


背景技术：

2.桦木(betula)是壳斗目桦木科下的一个属，约有100种，主要分布在北半球寒温带、温带地区，少数分布在北极圈及亚热带中山地区。桦木木材用途广泛，结构精细，加工性能优良，具有较高的经济价值。种间杂交是聚合不同物种优良性状，培育植物良种的重要手段之一。河桦来源于北美，具有较强的抗逆性能；福建桦主要分布于福建地区，较速生，其树干通直，材质优良，出材率高。通过河桦和福建桦的种间杂交有望获得兼具抗逆性和木材产量的桦木良种。如何快速准确鉴定出桦木种间真实杂交后代是桦木遗传育种的基础。ssr分子标记被广泛用于种质资源鉴定、亲缘关系鉴别等方面，但目前ssr分子标记用于河桦与福建桦种间杂种鉴定还未见报道。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法。该方法是一种快速、简单、省时、准确的杂交种鉴定方法，可有效地应用于河桦与福建桦种间杂交f1杂种真实性的鉴定。
5.本发明的目的按如下技术方案实现：
6.利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，步骤如下：
7.步骤1，种间杂交f1杂种及其亲本的dna提取；
8.步骤2，设计特异ssr引物，建立pcr反应体系以及扩增反应程序；
9.步骤3，使用qsep100全自动核酸蛋白分析系统对ssr扩增产物进行毛细管电泳检测；
10.步骤4，真实杂种的鉴定：分析毛细管电泳的结果，若检测到种间杂交f1杂种具有父母本扩增谱带，或具有父本特异扩增谱带，据此判断其为真杂种；
11.步骤5，观察杂种形态确认种间杂种的真实性：对种间杂交f1杂种叶片、皮孔形态性状进行观察与统计，若检测到杂种出现父本特异性状或双亲均不具有的新性状，则确认杂种的真实性。
12.用于桦木杂种鉴定的ssr标记引物具体如下：
13.引物编号：fjh-29，上游引物：5
’‑
ccattccagttagccacgat-3’(seq id no.1)，下游引物：5
’‑
atggcaagtagattcctgcg-3’(seq id no.2)；
14.引物编号：fjh-65，上游引物：5
’‑
aagatgctaatgccgatggt-3’(seq id no.3)，下游引物：5
’‑
tgccatcaaccctattcacc-3’(seq id no.4)；
15.引物编号：fjh-67，上游引物：5
’‑
ggcgcaaatcaaacgataat-3’(seq id no.5)，下游引物：5
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gctccgttgaatccagtctc-3’(seq id no.6)。
16.具体地，步骤1中，取种间杂交f1杂种和亲本叶片用液氮冷冻研磨后采用ctab法提取dna，利用分光光度计检测dna浓度和纯度，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。
17.具体地，步骤2中，ssr反应体系为：模板dna(100ng/μl)1μl，2
×
premix taq 5μl，上游引物(10μmol)0.2μl，下游引物(10μmol)0.2μl，超纯水3.6μl。
18.具体地，步骤2中，pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸10min。
19.具体地，步骤3中，毛细管电泳检测方法：取装有pcr扩增产物的96孔板，每个孔加入无菌水以防蒸干(例如，取装有pcr扩增产物的96孔板，a、b、c三行每个孔加入10μl无菌水，d、e、f三行每个孔加入20μl无菌水，g、h两行每个孔加入30μl无菌水)，然后将96孔板放置于qsep100全自动核酸蛋白分析系统，电泳参数设置为上样电压4kv，上样时间10s，样本分离电压6kv，样本分离时间300s，检测长度范围为15～1000bp，分辨率为2～4bp，size marker和alignment marker为c109100-100a(台湾光鼎)；
20.所述qsep100全自动核酸蛋白分析系统来源于台湾光鼎。
21.具体地，步骤4中，毛细管电泳结果分析：(1)以alignment marker为模板，校正size marker和样本峰值表20bp和1000bp的峰值；(2)打开size marker峰值表，选取参照标尺，进行片段计算，完成对size marker和样本峰值的校准；(3)新建对比档，选入亲本和子代毛细管电泳结果，整合“signal alignment”和“time alignment”,各样本间signal纵向偏移量调整为16，读取ssr位点峰值进行鉴定。
22.具体的，若检测到种间杂交f1杂种具有父母本扩增谱带，或父本特异扩增谱带，据此判断其为真杂种。
23.具体地，步骤5中，确认杂种的真实性：对种间杂交f1杂种及亲本叶片和皮孔差异进行观察与统计，若检测到杂种出现父本特异性状或双亲均不具有的新性状，即判定其为真实杂种。
24.本发明具有如下有益效果：
25.本发明是一种利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，利用ssr标记技术对桦木种间杂交f1代杂种dna进行了pcr扩增，使用毛细管电泳检测扩增产物，并结合谱带和植株形态确定f1杂种的真实性。本发明提供的ssr标记引物重复性好、特异性强；本发明方法具有高效、低成本、周期短和能够早期筛选等优点，能够替代传统杂种鉴定的方法，实现河桦与福建桦种间杂交f1杂种的精确鉴定，具有重要实际应用价值。
附图说明
26.以下结合附图对本发明做进一步详细描述。
27.图1种间杂交f1杂种dna 1％琼脂糖凝胶电泳检测图。
28.图2种间杂种f1杂种17号和24号及其亲本fjh-29扩增峰图及电泳图。
29.图3种间杂种f1杂种17号和24号及其亲本fjh-65扩增峰图及电泳图。
30.图4种间杂种f1杂种17号和24号及其亲本fjh-67扩增峰图及电泳图。
31.图5种间杂交f1杂种及其亲本叶片比对图。
具体实施方式
32.实施例
33.步骤1，种间杂交f1杂种及其亲本的dna提取；
34.具体地，取种间杂交f1杂种和亲本叶片用液氮冷冻研磨后采用ctab法提取dna，利用分光光度计检测dna浓度和纯度，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。结果如图1所示。
35.步骤2，设计特异ssr引物，建立pcr反应体系以及扩增反应程序；
36.具体地，所述引物为：
37.引物编号：fjh-29，上游引物：5
’‑
ccattccagttagccacgat-3’(seq id no.1)，下游引物：5
’‑
atggcaagtagattcctgcg-3’(seq id no.2)；
38.引物编号：fjh-65，上游引物：5
’‑
aagatgctaatgccgatggt-3’(seq id no.3)，下游引物：5
’‑
tgccatcaaccctattcacc-3’(seq id no.4)；
39.引物编号：fjh-67，上游引物：5
’‑
ggcgcaaatcaaacgataat-3’(seq id no.5)，下游引物：5
’‑
gctccgttgaatccagtctc-3’(seq id no.6)。
40.具体地，ssr反应体系为：模板dna(100ng/μl)1μl，2
×
premix taq 5μl，上游引物(10μmol)0.2μl，下游引物(10μmol)0.2μl，超纯水3.6μl。
41.具体地，pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸10min。
42.步骤3，使用qsep100全自动核酸蛋白分析系统对ssr扩增产物进行毛细管电泳检测；
43.具体地，毛细管电泳检测方法：取装有pcr扩增产物的96孔板，a、b、c三行每个孔加入10μl无菌水，d、e、f三行每个孔加入20μl无菌水，g、h两行每个孔加入30μl无菌水，然后将96孔板放置于qsep100全自动核酸蛋白分析系统(台湾光鼎)，电泳参数设置为上样电压4kv，上样时间10s，样本分离电压6kv，样本分离时间300s，检测长度范围为15～1000bp，分辨率为2～4bp，size marker和alignment marker为c109100-100a(台湾光鼎)。
44.步骤4，真实杂种的鉴定；分析毛细管电泳的结果，若检测到种间杂交f1杂种具有父母本扩增谱带，或具有父本特异扩增谱带，据此判断其为真杂种。
45.具体地，毛细管电泳结果分析：(1)以alignment marker为模板，校正size marker和样本峰值表20bp和1000bp的峰值；(2)打开size marker峰值表，选取参照标尺，进行片段计算，完成对size marker和样本峰值的校准；(3)新建对比档，选入亲本和子代毛细管电泳结果，整合“signal alignment”和“time alignment”,各样本间signal纵向偏移量调整为16，读取ssr位点峰值进行鉴定。
46.步骤5，观察杂种形态进一步确认种间杂种的真实性；对种间杂交f1杂种叶片、皮孔等形态性状进行观察与统计，若检测到杂种出现父本特异性状或双亲均不具有的新性状，则进一步确认杂种的真实性。
47.如图2，母本河桦在229bp检测到特征峰、带，父本福建桦在239bp检测到特征峰、带，种间杂种f1杂种17号和24号分别在229bp和239bp处检测到特征峰、带，表明种间杂种f1杂种17号和24号同时具有父母本的特征峰、带，尤其具有父本福建桦239bp处特征峰、带(箭头所指)，据此判定其为真实杂种。
48.如图3，母本河桦在217bp检测到特征峰、带，父本福建桦在188bp检测到特征峰、带，种间杂种f1杂种17号和24号分别在217bp和188bp处检测到特征峰、带，表明种间杂种f1杂种17号和24号同时具有父母本的特征峰、带，尤其具有父本福建桦188bp处特征峰、带(箭头所指)，据此判定其为真实杂种。
49.如图4，母本河桦在225bp检测到特征峰、带，父本福建桦在244bp检测到特征峰、带，种间杂种f1杂种17号和24号分别在225bp和244bp处检测到特征峰、带，表明种间杂种f1杂种17号和24号同时具有父母本的特征峰、带，尤其具有父本福建桦244bp处特征峰、带(箭头所指)，据此判定其为真实杂种。
50.如图5，其中母本河桦叶片的叶缘锯齿数量少，分布疏松，且锯齿较为圆钝；父本福建桦叶片的叶缘锯齿数量多，分布紧凑，且锯齿较为尖锐；种间杂种f1杂种叶片的叶缘锯齿数量、分布情况和锯齿尖锐程度均介于父母本之间，属于不同于父母本的新性状。
51.表1种间杂交f1杂种和母本河桦、父本福建桦茎干的皮孔密度
[0052][0053]
见表1，母本河桦的皮孔密度为114.24个/cm2，父本福建桦的皮孔密度为7.49个/cm2，而种间杂交f1杂种的皮孔密度为43.10个/cm2，介于母本和父本之间，对三个品种桦木的皮孔密度进行方差分析，结果表明，显著值(p值)为4.3846e-10，即闽桦、河桦和种间杂种三者之间在皮孔密度上存在显著差异，即皮孔密度是不同于父母本的新性状。
[0054]
综上所述，结合ssr分子标记和形态性状比对结果，证明种间杂交f1杂种17号和24号为河桦和福建桦的真实杂种。

技术特征：
1.一种利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，种间杂交f1杂种及其亲本的dna提取；步骤2，设计特异ssr引物，建立pcr反应体系以及扩增反应程序；步骤3，使用qsep100全自动核酸蛋白分析系统对ssr扩增产物进行毛细管电泳检测；步骤4，真实杂种的鉴定：分析毛细管电泳的结果，若检测到种间杂交f1杂种具有父母本扩增谱带，或具有父本特异扩增谱带，据此判断其为真杂种；步骤5，观察杂种形态确认种间杂种的真实性：对种间杂交f1杂种叶片、皮孔形态性状进行观察与统计，若检测到杂种出现父本特异性状或双亲均不具有的新性状，则确认杂种的真实性。2.如权利要求1所述利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特征在于，步骤1中，取种间杂交f1杂种和亲本叶片用液氮冷冻研磨后采用ctab法提取dna，利用分光光度计检测dna浓度和纯度，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。3.如权利要求1所述利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特征在于，步骤2中，设计引物具体如下：引物编号：fjh-29，上游引物：5
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ccattccagttagccacgat-3’，下游引物：5
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atggcaagtagattcctgcg-3’；引物编号：fjh-65，上游引物：5
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aagatgctaatgccgatggt-3’，下游引物：5
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tgccatcaaccctattcacc-3’；引物编号：fjh-67，上游引物：5
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ggcgcaaatcaaacgataat-3’，下游引物：5
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gctccgttgaatccagtctc-3’。4.如权利要求1所述利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特征在于，步骤2中，ssr反应体系为：模板dna(100ng/μl)1μl，2
×
premix taq 5μl，上游引物(10μmol)0.2μl，下游引物(10μmol)0.2μl，超纯水3.6μl。5.如权利要求1所述利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特征在于，步骤2中，pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸10min。6.如权利要求1所述利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特征在于，步骤3中，毛细管电泳检测方法：取装有pcr扩增产物的96孔板，每个孔加入无菌水以防蒸干，然后将96孔板置于qsep100全自动核酸蛋白分析系统，电泳参数设置为上样电压4kv，上样时间10s，样本分离电压6kv，样本分离时间300s，检测长度范围为15～1000bp，分辨率为2～4bp，size marker和alignment marker为c109100-100a；所述qsep100全自动核酸蛋白分析系统来源于台湾光鼎。7.如权利要求1所述利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特征在于，步骤4，毛细管电泳结果分析：(1)以alignment marker为模板，校正size marker和样本峰值表20bp和1000bp的峰值；(2)打开size marker峰值表，选取参照标尺，进行片段计算，完成对size marker和样本峰值的校准；(3)新建对比档，整合“signal alignment”和“time alignment”，各样本间signal纵向偏移量调整为16，读取ssr位点峰值进行鉴定。8.如权利要求7所述利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特
征在于，若检测到种间杂交f1杂种具有父母本扩增谱带，或父本特异扩增谱带，据此判断其为真杂种。9.如权利要求1所述利用ssr分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交f1杂种的方法，其特征在于，步骤5中，确认杂种的真实性：对种间杂交f1杂种及亲本叶片和皮孔差异进行观察与统计，若检测到杂种出现父本特异性状或双亲均不具有的新性状，即判定其为真实杂种。

技术总结
本发明提供了一种利用SSR分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交F1杂种的方法，涉及生物技术领域。本发明是一种利用SSR分子标记鉴定河桦与福建桦种间杂交F1杂种的方法，利用SSR标记技术对桦木种间杂交F1代杂种DNA进行了PCR扩增，使用毛细管电泳检测扩增产物，并结合谱带和植株形态确定F1杂种的真实性。本发明提供的SSR标记引物重复性好、特异性强；本发明方法具有高效、低成本、周期短和能够早期筛选等优点，能够替代传统杂种鉴定的方法，实现河桦与福建桦种间杂交F1杂种的精确鉴定，具有重要实际应用价值。际应用价值。际应用价值。


技术研发人员：林二培 黄华宏 陈雪迎 庄和必
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：2022.11.08
技术公布日：2023/8/9