具有聚集诱导荧光效应的碳量子点及其应用

1.本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种具有聚集诱导荧光效应的碳量子点及其应用。


背景技术：

2.碳点(cds)是一种具有低毒性、高生物相容性、可调节表面性质和显着抗光漂白性的光致发光纳米材料。由于这些优异的性能，碳点已经广泛应用于传感、生物成像、药物输送和防伪等各个领域。目前，由于共振能量转移(et)或直接π-π堆叠，仍然很少有成熟的技术来调节碳点的发射能带隙和避免聚集荧光淬灭(acq)效应。这些限制了碳点的开发和应用。学者们采用化学、物理和工程方法来防止发光团聚集体的形成，目的是减轻聚集荧光淬灭效应。然而，这些努力取得了有限的成功。
3.2001年，唐本忠的小组报告了一种有趣的现象，称为聚集诱导发射(aie)。聚集诱导发射荧光团很好地溶解在溶液中时是没有荧光发射的，但由于激活辐射衰减通道的分子内旋转(rir)的限制而在聚集时变得具有高强度信号的发射。最近，聚集诱导发射染料已被用于设计高荧光纳米粒子，这些纳米粒子已广泛用于细胞成像。
4.迄今为止，已经报道了聚集诱导发射荧光碳点(aie-cds)，并且已经提出了几种合理的策略来产生和增强它们在聚集状态下的荧光。然而，可调节多色发射aie-cds似乎很难建立。aie-cds荧光发射通常发生在碳点的表面，碳点表面的双重荧光发射对于构建分子内电荷转移(ict)供体-受体(d-a)共轭体具有吸引力。分子内电荷转移现象在荧光染料发光过程中很常见，随之而来的是d-a互共轭和电子转子现象的发生，这在碳点中并不常见。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种具有聚集诱导荧光效应的碳量子点及其应用。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种具有聚集诱导荧光效应的碳量子点，其通过以下步骤制备得到：
7.1)将三苯胺溶于冰醋酸中超声处理，得到混合物；
8.2)将所述混合物转移到反应釜中，加热下反应；
9.3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；
10.4)将所述浑浊液进行超声处理后离心，所得固体真空干燥，得到所述碳量子点。
11.优选的是，所述碳量子点在聚集状态时，于激发光下显示红色荧光；在分散状态时，于激发光下显示蓝色荧光。
12.优选的是，该具有聚集诱导荧光效应的碳量子点通过以下步骤制备得到：
13.1)将三苯胺溶于冰醋酸中，超声处理2-10分钟，得到混合物；
14.2)将所述混合物转移到反应釜中，150-250℃下持续反应6-24个小时；
15.3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；
16.4)将所述浑浊液超声处理3-10分钟后在8000-12000rpm下离心3-15分钟，重复2-4次，所得固体40-80℃下真空干燥，得到所述碳量子点。
17.优选的是，所述步骤3)中反应产物与去离子水的体积比控制为1:1。
18.优选的是，该具有聚集诱导荧光效应的碳量子点通过以下步骤制备得到：
19.1)将三苯胺溶于冰醋酸中，超声处理3分钟，得到混合物；
20.2)将所述混合物转移到反应釜中，200℃下持续反应12个小时；
21.3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；
22.4)将所述浑浊液超声处理5分钟后在10000rpm下离心5分钟，重复3次，所得固体60℃下真空干燥，得到所述碳量子点。
23.优选的是，该具有聚集诱导荧光效应的碳量子点通过以下步骤制备得到：
24.1)将245mg三苯胺溶于40ml冰醋酸中，超声处理3分钟，得到混合物；
25.2)将所述混合物转移到体积为50ml的以聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中于200℃下持续反应12个小时；
26.3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；
27.4)将所述浑浊液超声处理5分钟后在10000rpm下离心5分钟，重复3次，所得固体60℃下真空干燥，得到所述碳量子点。
28.本发明还提供一种如上所述的碳量子点在细胞成像中的应用，具体成像方法为：
29.将如上所述的碳量子点制备成浓度为20-100μg/ml的碳点溶液；
30.将细胞置于培养皿中进行培养，然后吸去培养基，向培养皿中加入含有碳点溶液的新培养基，并共同孵育120分钟，再去除所有液体并用pbs洗涤3次，然后用多聚甲醛溶液固定，孵育15分钟，最后通过共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。
31.本发明还提供一种如上所述的碳量子点在溶酶体定位中的应用，具体方法为：
32.将如上所述的碳量子点制备成浓度为20-100μg/ml的碳点溶液；
33.将活体细胞用碳点溶液预处理120分钟，然后通过共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。
34.本发明还提供一种如上所述的碳量子点在指纹识别中的应用，具体方法为：将该碳量子点粉末涂覆在需要进行指纹识别的表面，然后对该表面进行荧光成像，获取该表面上的指纹图像。
35.本发明还提供一种如上所述的碳量子点在生鲜食品运输时间的检测中的应用，具体方法为：生鲜食品封箱时，将该碳量子点加入装有水的密封管中，随生鲜食品一同运输，到货后，对密封管进行荧光检测，通过检测到的红色荧光强度判断生鲜食品的运输时间。
36.本发明的有益效果是：
37.本发明使用具有特殊非平面螺旋桨状构象的原料三苯胺(tpa)，合成了一种具有ict(内电荷转移)和aie(聚集诱导发射)属性的碳点t-cds，其不受聚集荧光淬灭效应的影响，在不同极性的溶液中具有可调节的多色发射；t-cds具有蓝色和红色双荧光发射，当溶解在溶剂中时，由于分子内的活跃旋转，碳点发出轻微的蓝色荧光；当t-cds遇到足够的水并随着时间的推移聚集时，分子内的旋转受到高度阻碍，碳点会呈现出明亮的红色荧光；
38.本发明的碳点，利用其荧光特性可在细胞成像、溶酶体定位、指纹识别等领域中进行应用；
39.本发明的碳点具有制备方法简单、原料廉价、细胞毒性低，成像效果好等特点，可实现规模化生产。
附图说明
40.图1为本发明的实施例1制备的碳点的透射电镜(tem)照片；
41.图2为本发明的实施例1制备的碳点的高分辨率透射电镜(hr-tem)图像；
42.图3为本发明的实施例1制备的碳点的红外图谱；
43.图4为本发明的实施例1制备的碳点的x射线光电子能谱；
44.图5为本发明的实施例1制备的碳点的双荧光发射示意图；
45.图6为本发明的实施例1制备的碳点的荧光光谱；
46.图7为本发明的实施例1制备的碳点的在不同溶剂中的荧光性能和光谱图；
47.图8为本发明的实施例1制备的碳点在不同加水时间下的荧光光谱；
48.图9为本发明的实施例1制备的碳点的细胞毒性测试结果；
49.图10为本发明的实施例2中采用实施例1制备的碳点的对hela细胞进行荧光成像的结果；
50.图11为本发明的实施例3中采用实施例1制备的碳点和商业染料对hela细胞的溶酶体进行共定位的测试结果；
51.图12为本发明的实施例3中采用实施例1制备的碳点进行指纹识别的结果。
具体实施方式
52.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
53.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
54.下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
55.实施例1
56.本实施例提供一种具有聚集诱导荧光效应的碳量子点，其通过以下步骤制备得到：
57.1)将245mg三苯胺溶于40ml冰醋酸中，超声处理3分钟，得到混合物；
58.2)将所述混合物转移到体积为50ml的以聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中于200℃下持续反应12个小时；
59.3)反应结束后待反应产物溶液(t-cds溶液)冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中(反应产物与去离子水的体积比为1:1)，溶液中立即形成固体粉末，得到浑浊液；
60.4)将所述浑浊液超声处理5分钟后在10000rpm下离心5分钟，重复3次，直至除去溶剂和剩余原料，所得固体60℃下真空干燥，得到所述碳量子点(碳点)。
61.该碳量子点在聚集状态时，于激发光下显示红色荧光；在分散状态时，于激发光下显示蓝色荧光。
62.参照图1，为实施例1制备的碳点的透射电镜(tem)照片，图2是碳点的高分辨率透射电镜(hr-tem)图像。从图1中可以看出，该碳点呈球形，且分散性良好。图2高分辨率图像清楚地呈现了碳点的精细结构，晶体距离为0.21nm。
63.参照图3，是碳点的红外图谱，可以看出与原料相比，碳点的红外光谱在3441cm-1
处有一个特征峰，该特征峰可归属于其表面的氨基和含氧官能团；在1640cm-1
附近出现了一些吸收带，这应该是酰胺羰基的吸收带，在1586和1491cm-1
附近出现的吸收带可能都对应c＝c的伸缩振动，1278cm-1
处的峰应该为c-nh化学键，傅里叶转换红外光谱的结果证实了碳点的表面存在氨基，酰胺等多种基团，证实了碳点的合成。
64.参照图4，是碳点的x射线光电子能谱，清晰地显示了在285.08ev、401.58ev和532.08ev处有三个峰，分别归属于c1s、n1s和o1s；c、n、o元素的原子比分别为56.85％、8.48％、34.67％。
65.参照图5，是碳点的双荧光发射示意图；在碳点的制备过程中，是以冰醋酸为溶剂，加入足量的水后，溶液瞬间由深蓝色透明变为蓝白色浑浊液，一段时间后，浑浊液由蓝白色变为浅绿色，耗时约2小时。在此期间，在480nm uv照射下，观察不同时间加水后的溶液。溶液由无荧光变为黄色荧光，最后变为红色荧光。产物溶液经纯化、离心、干燥后，可收集绿色粉末，粉末在480nm uv照射下仍显示红色荧光。
66.参照图6，是碳点的荧光光谱，说明了碳点在溶液和粉末形态下表现出不同的光学性质。图6(a)显示了当碳点在溶液中，随着激发波长的增加，荧光信号强度变强，在434nm处观察到最佳发射峰，对应的激发在380nm处，当激发波长超过400nm时，没有明显的荧光信号。图6(b)显示碳点粉末在不同激发波长下的荧光发射情况，当激发波长低于380nm时，碳点粉末的荧光信号与碳点溶液相似；当激发波长超过380nm时，荧光信号强度逐渐增大，激发发射波长为480nm，碳点粉末在633nm处发射最强，显示红色荧光。
67.参照图7，是碳点在不同溶剂中的荧光性能和光谱图，其说明了溶剂对荧光的影响。用不同溶剂(乙酸、乙醇、dmf、dmso和水)在1ml溶液中加入1mg碳点，荧光颜色如7(a)所示，发射光谱如7(b)所示。当以乙酸(溶剂极性ε＝6.2)为参比物时，乙醇(ε＝4.3)不改变溶液的荧光颜色，在480nm紫外辐射下几乎没有可见荧光；在dmf(ε＝6.4)或dmso(ε＝7.2)溶液中，主荧光峰出现在558nm处，荧光呈橙色；在水中(ε＝10.2)，在633nm处形成一个新的主峰，产生明亮的红色荧光。
68.参照图8，是不同加水时间下碳点的荧光光谱，图8(a)显示了所制的碳点溶液在阳光和480nm紫外辐射下的照片，其中以体积比1:1的比例添加水，时间跨度为0到48小时(溶剂是乙酸)；在加水的瞬间，粉末从溶液中沉淀出来，原来清澈的溶液变成了不透明的混浊液体，带有悬浮颗粒，溶液颜色随着时间的推移从蓝色变为绿色。在480nm的紫外线辐射下，溶液呈现出从浅黄色到鲜红色的荧光色。图8(b)和8(c)图显示了碳点溶液蓝色和红色区域的荧光光谱在加水后随不同沉淀时间的变化，随着沉淀时间的增加(从0到48h)，434nm处的荧光强度在8小时前缓慢增加，8小时后急剧下降(图8b中标示了8小时对应的曲线)；除此之外，加水6小时以上后，荧光峰出现在红色区域，荧光强度随加水时间增加而增加；在633nm处观察到最终的荧光峰。图8(d)图和8(e)分别直观地反映了434和633nm处荧光强度随加水
时间的变化。
69.参照图9，是碳点的细胞毒性测试结果，本实施例通过wst-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒对碳点的细胞毒性进行了评估：首先将hela细胞置于96孔板上培养24小时，然后加入不同浓度(0-1000μg/ml)的碳点溶液(溶解于dmso)培养24小时。其次，向每个孔中加入20μl的wst-1试剂，然后再次孵育40分钟。最后，用96孔板在450nm处读取混合物的吸光度。孵育条件均为37℃和5％co2。从图9的测试结果可以看出，在加入碳点浓度为0至1000μg/ml的浓度时，细胞存活率均在85％以上，证明了碳点的毒性较低，生物相容性好。
70.实施例2
71.本实施例提供实施例1制备的碳量子点在细胞成像中的应用，具体成像方法为：
72.将实施例1制备的碳量子点制备成浓度为20-100μg/ml的碳点溶液；
73.将细胞置于培养皿中进行培养，然后吸去培养基，向培养皿中加入含有碳点溶液的新培养基，并共同孵育120分钟，再去除所有液体并用pbs洗涤3次，然后用多聚甲醛溶液固定，孵育15分钟，最后通过共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。
74.参照图10，为一种实施例中采用实施例1制备的碳点对hela细胞进行荧光成像的结果：将hela细胞置于共聚焦培养皿中进行培养24小时，然后吸去培养基，向培养皿中加入2ml含有50μg/ml的碳点溶液的新培养基，并共同孵育120分钟，再去除所有液体并用pbs洗涤3次，然后用dapi(一种与dna强结合的荧光染料，专门用于细胞核染色)复染，孵育1小时；再多聚甲醛溶液固定，孵育15分钟，最后使用40x物镜通过共聚焦显微镜对hela细胞进行荧光成像。成像结果如图10，dapi将hela细胞中央核染成蓝色，而碳点主要分布在外周细胞质中，呈现红色荧光，这些结果表明碳点主要分布在细胞质中；因此，该碳点可用于细胞内成像。
75.实施例3
76.本实施例提供实施例1制备的碳量子点在溶酶体定位中的应用，具体方法为：
77.将权利要求1-6中任意一项所述的碳量子点制备成浓度为20-100μg/ml的碳点溶液；
78.将活体细胞用碳点溶液预处理120分钟，然后通过共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。
79.参照图11，为一种实施例中采用实施例1制备的碳点和商业染料lyso-tracke green对hela细胞的溶酶体进行共定位的测试结果：活体hela细胞用50μg/ml的碳点溶液预处理120分钟，然后用100nm溶酶体商业染料lyso-tracke green孵育30分钟，使用40x物镜通过共聚焦显微镜观察hela细胞的荧光。从图11看出，碳点的红色荧光图像与lyso-tracker green的绿色荧光图像重叠良好，说明该碳点能被用于监测活细胞中的溶酶体。
80.实施例4
81.本实施例提供实施例1制备的碳量子点在指纹识别中的应用，具体方法为：将该碳量子点粉末涂覆在需要进行指纹识别的表面，然后对该表面进行荧光成像(480nm的激发光下)，获取该表面上的指纹图像。
82.参照图12，为将碳点粉末涂覆在玻璃片表面进行指纹识别的结果，可以看出，由于该碳点荧光信号的高对比度，所有样本的脊型，如拱、环和螺旋，分类为一级，可以清楚地识别；部分放大的特征点，如中心点，分叉点，终止点等也可以观察清楚。
83.实施例5
84.本发明还提供一种如上所述的碳量子点在生鲜食品运输时间的检测中的应用，具体方法为：生鲜食品封箱时，将该碳量子点加入装有水的密封管中，随生鲜食品一同运输，到货后，对密封管进行荧光检测，通过检测到的红色荧光强度判断生鲜食品的运输时间。
85.由于低温不会影响该碳量子点的荧光信号，且碳量子点在水中不溶，并随时间的推移会逐渐聚集而能够被激发呈现红色荧光，所以，在这一过程中，在激发光下红色荧光逐渐增强，且该变化程度与时间正相关，所以红色荧光(例如480nm的激发光下，633nm处的红色荧光)增强的值p1与时间t呈正相关，通过p1能够推算出运输时间t，从而可判断生鲜食品的新鲜程度。
86.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

技术特征：
1.一种具有聚集诱导荧光效应的碳量子点，其特征在于，其通过以下步骤制备得到：1)将三苯胺溶于冰醋酸中超声处理，得到混合物；2)将所述混合物转移到反应釜中，加热下反应；3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；4)将所述浑浊液进行超声处理后离心，所得固体真空干燥，得到所述碳量子点。2.根据权利要求1所述的具有聚集诱导荧光效应的碳量子点，其特征在于，所述碳量子点在聚集状态时，于激发光下显示红色荧光；在分散状态时，于激发光下显示蓝色荧光。3.根据权利要求1所述的具有聚集诱导荧光效应的碳量子点，其特征在于，其通过以下步骤制备得到：1)将三苯胺溶于冰醋酸中，超声处理2-10分钟，得到混合物；2)将所述混合物转移到反应釜中，150-250℃下持续反应6-24个小时；3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；4)将所述浑浊液超声处理3-10分钟后在8000-12000rpm下离心3-15分钟，重复2-4次，所得固体40-80℃下真空干燥，得到所述碳量子点。4.根据权利要求3所述的具有聚集诱导荧光效应的碳量子点，其特征在于，所述步骤3)中反应产物与去离子水的体积比控制为1:1。5.根据权利要求4所述的具有聚集诱导荧光效应的碳量子点，其特征在于，其通过以下步骤制备得到：1)将三苯胺溶于冰醋酸中，超声处理3分钟，得到混合物；2)将所述混合物转移到反应釜中，200℃下持续反应12个小时；3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；4)将所述浑浊液超声处理5分钟后在10000rpm下离心5分钟，重复3次，所得固体60℃下真空干燥，得到所述碳量子点。6.根据权利要求5所述的具有聚集诱导荧光效应的碳量子点，其特征在于，其通过以下步骤制备得到：1)将245mg三苯胺溶于40ml冰醋酸中，超声处理3分钟，得到混合物；2)将所述混合物转移到体积为50ml的以聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中于200℃下持续反应12个小时；3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；4)将所述浑浊液超声处理5分钟后在10000rpm下离心5分钟，重复3次，所得固体60℃下真空干燥，得到所述碳量子点。7.一种如权利要求1-6中任意一项所述的碳量子点在细胞成像中的应用，具体成像方法为：将权利要求1-6中任意一项所述的碳量子点制备成浓度为20-100μg/ml的碳点溶液；将细胞置于培养皿中进行培养，然后吸去培养基，向培养皿中加入含有碳点溶液的新培养基，并共同孵育120分钟，再去除所有液体并用pbs洗涤3次，然后用多聚甲醛溶液固定，孵育15分钟，最后通过共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。8.一种如权利要求1-6中任意一项所述的碳量子点在溶酶体定位中的应用，具体方法为：
将权利要求1-6中任意一项所述的碳量子点制备成浓度为20-100μg/ml的碳点溶液；将活体细胞用碳点溶液预处理120分钟，然后通过共聚焦显微镜对细胞进行荧光成像。9.一种如权利要求1-6中任意一项所述的碳量子点在指纹识别中的应用，具体方法为：将该碳量子点粉末涂覆在需要进行指纹识别的表面，然后对该表面进行荧光成像，获取该表面上的指纹图像。10.一种如权利要求1-6中任意一项所述的碳量子点在生鲜食品运输时间的检测中的应用，具体方法为：生鲜食品封箱时，将该碳量子点加入装有水的密封管中，随生鲜食品一同运输，到货后，对密封管进行荧光检测，通过检测到的红色荧光强度判断生鲜食品的运输时间。

技术总结
本发明公开了一种具有聚集诱导荧光效应的碳量子点及其应用，该碳点通过以下步骤制备得到：1)将三苯胺溶于冰醋酸中超声处理，得到混合物；2)将所述混合物转移到反应釜中，加热下反应；3)反应结束后冷却至室温，然后将反应产物加入到去离子水中，得到浑浊液；4)将所述浑浊液进行超声处理后离心，所得固体真空干燥，得到所述碳量子点。本发明制备的具有ICT(内电荷转移)和AIE(聚集诱导发射)属性，当溶解在溶剂中时，由于分子内的活跃旋转，碳点发出轻微的蓝色荧光；当T-CDs遇到足够的水并随着时间的推移聚集时，分子内的旋转受到高度阻碍，碳点会呈现出明亮的红色荧光；其可应用于细胞成像、溶酶体定位、指纹识别等领域。指纹识别等领域。指纹识别等领域。


技术研发人员：梅茜 寇馨月 董文飞 李力 葛明锋 常智敏
受保护的技术使用者：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
技术研发日：2022.11.03
技术公布日：2023/8/9