一种新颖骨架类型细胞松弛素及其在制备具有抗肿瘤活性的药物中的应用

9.名称为：boerelasin b
10.本发明的再一个目的是验证所述细胞松弛素boerelasin b对5种人源肿瘤细胞具有不同程度的细胞毒活性。
11.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
12.1、本发明揭示一种来源于湖北贝母内生真菌b.exigua的5/6/5/6/8五环体系新颖骨架类型细胞松弛素。
13.2、本发明提供一种具有抗肿瘤活性的细胞松弛素，对5种人源肿瘤细胞具有不同程度的细胞毒活性。
14.3、本发明拟保护其制药用途的细胞松弛素，可通过从植物内生真菌中提取纯化来获取，具有培养周期短暂、操作可行性高、无化学污染、绿色环保等优势。
附图说明
15.图1为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的氢谱图(800mhz,cdcl3)；
16.图2为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的碳谱图(201mhz,cdcl3)和dept图；
17.图3为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的hmqc图；
18.图4为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的hmbc图；
19.图5为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的1h-1
h cosy图；
20.图6为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的roesy图；
21.图7为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的hr-esi-ms图；
22.图8为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的实测ecd和计算ecd图。
具体实施方式
23.为使本技术的发明目的、

技术实现要素：
呈现得更加清楚，下面申请人将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。
24.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
25.下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.实施例1：
27.原料湖北贝母内生真菌boeremia exigua(简称：b.exigua)分离自湖北贝母新鲜植株的根部，贝母采自湖北省恩施土家族苗族自治州恩施市新塘乡双河社区，菌株自编号为贝21，经its序列测定结果对比得知，该序列与boeremia exigua的最大相似度高达100％，基因库登录号：mt154621.1。故将其鉴定为boeremia exigua，该菌株保藏于中南民族大学药学院微生物菌种库(已经公开，见：吕晓，叶可，马旭军等.湖北贝母内生真菌boeremia exigua化学成分及其抗炎活性研究[j].中南民族大学学报(自然科学版)，2022，41(2)：174-179)。
[0028]
上述湖北贝母内生真菌贝21的具体分离过程为：取湖北贝母(新鲜植株的根部)，用自来水冲洗干净后将其切成小块，经75％ v/v乙醇润洗60s，无菌水漂洗3次，0.1％升汞(1g氯化汞溶解于1000g蒸馏水中)浸泡消毒40s，无菌水再漂洗3次，用经过高压灭菌的过滤纸吸干水分，剪去湖北贝母根部两端的切口后从中间划开，在无菌条件下将这些小块接至
含有青链霉素混合液的马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基上，将其放置于25℃的恒温培养箱中培养。待真菌菌丝长出后，挑取菌丝进行纯化培养得到单一菌株，将所得单一菌株转移至装有pda培养基的试管中，放置于4℃冰箱中保存。
[0029]
采用燕麦固体发酵对该菌株贝21进行扩大发酵：活化菌株，将试管从冰箱取出，在无菌常温环境中放置1小时后，在无菌操作台下从试管中取直径为5mm左右的菌块接种至平板pda培养基上，待其生长约7天后，菌落长满pda，备用。燕麦培养基配比：燕麦50g/瓶，蒸馏水50ml/瓶，置于500ml培养瓶中，经120℃高温灭菌20分钟，冷却后在无菌环境中从平板pda培养基上挑取直径为5mm的菌块接种到燕麦培养基上，共272瓶，培养条件：在25℃下暗培养35d。
[0030]
权利要求书和说明书发明内容中所述化合物细胞松弛素的分离纯化过程：将上述发酵完成的燕麦固体培养基(共15kg)捣碎，用有机混合试剂(二氯甲烷-甲醇＝1:1，v/v)浸泡5次，每次24h。每次浸泡后离心，将5次离心后的提取液合并，减压浓缩蒸干溶剂后，加入少量水溶解，乙酸乙酯萃取5次，再将乙酸乙酯部分合并后减压浓缩得到粗提浸膏418.77g。用80-100目正相硅胶色谱柱层析(ch2cl
2-meoh:100:0,50:1,20:1,10:1,5:1,v/v)梯度洗脱,并用薄层色谱(展开剂为氯仿：甲醇＝10:1，v/v；薄层层析硅胶板，青岛海洋化工厂)检测并显色，粗划段得到a
–
e五个组分。
[0031]
将c组分(二氯甲烷/甲醇的体积比为20:1时洗脱出的组分，洗脱剂用量为5个柱体积，15.5g)经过高效中压液相制备色谱(biotage sp1，反相填料材料：rp-18，20-45μm,fuji silysia chemical ltd.,japan)甲醇水体系(甲醇/水＝50:50,60:40,70:30,80:20,100:0,v/v)，流速20ml/min进行梯度洗脱，每个比例洗脱时间为60min。用薄层色谱(展开剂为氯仿：甲醇＝20:1，v/v；薄层层析硅胶板，青岛海洋化工厂)检测并显色，将相同或者类似的组分合并，最后合并成八个亚组分，按照极性由小到大依次标记为c1-c8。c6组分(甲醇/水的体积比为60:40时洗脱出的组分，3.6g)经正相硅胶色谱柱(200-300目),二氯甲烷甲醇体系(二氯甲烷/甲醇＝20:1,10:1,1:1,v/v)梯度洗脱，并用薄层色谱(展开剂为氯仿：甲醇＝10:1，v/v；薄层层析硅胶板，青岛海洋化工厂)检测并显色，将相同或者类似的组分合并，得到5个亚组分，按照极性由小到大依次标记为c6-1－c6-5。c6-2(二氯甲烷/甲醇的体积比为10:1时洗脱出的组分，洗脱剂用量为5个柱体积，68mg)经sephadex lh-20凝胶柱色谱(pharmacia fine chemical co.,ltd.,sweden)用甲醇洗脱(甲醇用量为10个柱体积)后，将所得24.7mg产物再经高效液相制备色谱(agilent 1260；色谱柱：agilent zorbax sb-c18，规格：9.4mm
×
150mm，5μm；乙腈-水：45:55-55:45，v/v；流速：4ml/min)梯度洗脱25min，制备得1.5mg本发明的化合物(保留时间为16.6min)。
[0032]
化合物的结构鉴定：将本实施例1制备所得的化合物细胞松弛素，加0.5ml的氘代氯仿溶解，用200μl移液枪转移至核磁管中，在核磁共振仪(德国布鲁克avance iii 600mhz)上检测氢谱、碳谱、二维谱图(如图1-6)确定了其相对构型，又经过计算ecd(如图8)确定了该化合物的立体构型。综合各理化数据解得该化合物的结构并将其命名为boerelasin b。
[0033]
所得细胞松弛素的核磁共振数据：
[0034][0035]
其他理化数据：
[0036]
外观：白色无定型粉末，根据高分辨质谱hresims([m+h]
+
，m/z 462.2640)。
[0037]
根据上述检测的结果，确认本实施例所得化合物的结构式为：
[0038][0039]
分子式：c
29h35
no4[0040]
实施例2：mts检测细胞活力
[0041]
mts法检测细胞活性原理：
[0042]
mts为一种全新的mtt类似物，全称为3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-tetrazoliu m，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原mts，生成可溶性的甲臜(formazan)化合物，甲臜的含量可以用酶标仪在490nm处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度od值推测出活细胞的数目。
[0043]
实验方法：
[0044]
1.接种细胞：将五种肿瘤细胞(中国科学院昆明植物研究所)分别用含10％胎牛血清的dmem培养基配成单个细胞悬液，以每孔约5000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μl，细胞提前12～24小时接种培养。
[0045]
2.加入待测化合物溶液：将实施例1所得化合物、顺铂、紫杉醇分别用dmso溶解，化合物以40μm、20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.62μm、0.31μm、0.16μm、0.08μm浓度复筛，每孔终体积200μl，每种处理均设3个复孔。
[0046]
3.显色：37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞(a549、smmc-7721、mcf-7、sw480)弃孔内全部培养液，每孔加mts溶液20μl和培养液(含10％胎牛血清的dmem培养基)100μl；悬浮细胞(hl-60)弃100μl培养上清液，每孔加20μl的mts溶液；设3个空白复孔(mts溶液20μl和培养液100μl的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
[0047]
4.比色：选择490nm波长，多功能酶标仪(multiskan fc)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(reed and muench法)计算化合物的ic
50
值。
[0048]
5.阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(cisplatin)和紫杉醇(paclitaxel)两个阳性化合物对照，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(reed and muench法)计算化合物的ic
50
值。细胞存活率的计算公式为：细胞存活率％＝药物组/空白组
×
100％。
[0049]
实验结果：
[0050]
结果表明本发明的化合物boerelasin b对smmc-7721(人肝癌细胞)、a549(人肺癌细胞)表现出显著的细胞毒活性，ic
50
《10μm，对hl-60(人白血病细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞)具有明显抑制活性，ic
50
值为14.16μm、19.21μm，与阳性对照药顺铂相当；对sw480(人结肠癌细胞)有较好抑制活性，ic
50
值为30.56μm。
[0051]
表1：boerelasin b、顺铂和紫杉醇对五种肿瘤细胞的ic
50
(μm)值
[0052]

技术特征：
1.一种新颖骨架类型的细胞松弛素类化合物，其结构式为：2.根据权利要求1所述的细胞松弛素类化合物，其特征在于，化合物的结构式为：3.一种权利要求1或2所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用燕麦固体发酵对湖北贝母内生真菌b.exigua进行扩大培养，然后将发酵完成的燕麦固体培养基捣碎并用有机混合试剂浸泡提取，将提取液浓缩至干，再加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取；2)对乙酸乙酯萃取液进行硅胶柱分离，得到a-e五个组分；3)对c组分进行中压液相制备色谱分离，得到c1-c8八个亚组分；4)对c6组分进行硅胶柱分离，得到c6-1—c6-5五个亚组分；5)c6-2组分经凝胶柱色谱分离后，将所得产物再经高效液相制备色谱纯化，即得所述的化合物。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中的有机混合试剂是体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂；燕麦培养基配比：燕麦与蒸馏水的固液比为1g:1ml，经120℃高温灭菌后备用；扩大培养的条件：在25℃下暗培养35d。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中硅胶柱分离的条件包括：以二氯甲烷-甲醇为洗脱液，按体积比为100:0、50:1、20:1、10:1以及5:1的比例依次进行洗脱，tlc检测，得五个洗脱组分，其中展开剂为氯仿：甲醇＝10:1，v/v。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中的中压液相制备色谱分离的条件包括：rp-18色谱柱，以甲醇-水为洗脱液，按体积比为50:50、60:40、70:30、80:20以及100:0的比例依次进行洗脱，流速为20ml/min，每个比例洗脱时间为60min，tlc检测，得八个洗脱亚组分，其中展开剂为氯仿：甲醇＝20:1，v/v。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中硅胶柱分离的条件包括：以二氯甲烷-甲醇为洗脱液，按体积比为20:1、10:1、1:1的比例依次进行洗脱，tlc检测，得五个洗脱组分，其中展开剂为氯仿：甲醇＝10:1，v/v。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中的凝胶柱色谱以甲醇为洗脱
液；步骤5)中的高效液相制备色谱的条件包括：c18色谱柱，以乙腈和水的混合溶剂为洗脱液，按乙腈和水的初始体积比为45:55，最终体积比为55:45进行梯度洗脱25min，流速为4ml/min。9.权利要求1或2所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。10.权利要求1或2所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞smmc-7721、a549、hl-60、mcf-7和/或sw480生长的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及医药化学技术领域，具体公开了从湖北贝母内生真菌Boeremia exigua中分离得到的一个5/6/5/6/8五环体系的新颖骨架类型的细胞松弛素类化合物，将其命名为boerelasin B。采用MTS法评估其对5种人源肿瘤细胞的细胞毒活性，生物活性评价显示该化合物对5种人源肿瘤细胞具有不同程度的细胞毒活性，其中对SMMC-7721（人肝癌细胞）、A549（人肺癌细胞）表现出显著的细胞毒活性，IC


技术研发人员：石宝宝 田淳 吕晓 艾洪莲 李正辉
受保护的技术使用者：中南民族大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/9