一种敏感性荧光染料剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种敏感性荧光染料剂及其制备方法，属于荧光染料技术领域。


背景技术：

2.荧光分析法，通过荧光信号将微观的信息变化以宏观的形式显示出来，由于灵敏度高、选择性强、原位实时响应等优势，被广泛应用于识别与标记，同时也催动着荧光分子向更高亮度、更高稳定性发展，用于荧光分析的现有的有机小分子荧光染料，如罗丹明、花菁染料、荧光素等，但是本身会带有电荷，严重影响分子的标记性能、稳定性、相容性，罗丹明类荧光染料的亲脂性差，对细胞的穿透能力差；荧光素分子负离子容易被氧化为淬灭，不易穿透细胞膜；花菁染料的聚甲炔链极易被单线态氧进攻，烯烃的扭转导致量子产率降低等的。在超分辨与荧光染料检测技术蓬勃发展的时代，目前的研究大部是对单分子的有机小分子荧光染料进行基团修饰或结构，但是仍然存在荧光染料的穿透性、稳定性、相容性较差，在某些场合，具有一定的局限性。


技术实现要素：

3.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种敏感性荧光染料剂及其制备方法，该荧光染料剂具有良好的细胞穿透性、相容性、稳定性，且其制备简单方便。
4.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种敏感性荧光染料剂，由以下原料：磷脂、peg胆固醇衍生物、磷酸缓冲溶液、有机荧光染料组成，且有机荧光染料包裹在磷脂中；其中，有机荧光染料的质量为磷脂质量的41.3～46.5％，peg胆固醇衍生物的质量为磷脂质量的23.8～27.3％，磷酸缓冲溶液的质量为磷脂质量的1.6～2倍。
5.优选地，磷脂是由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸两种或者两种以上混合而成。
6.优选地，磷脂为由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰丝氨酸按照重量比1:0.3:0.45混合而成。
7.其中，磷脂为由磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺按照重量比1:0.0.68混合而成。
8.其中，磷脂为由磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸按照重量比1:0.82混合而成。
9.优选地，peg胆固醇衍生物为胆固醇-聚乙二醇-氨基、胆固醇-聚乙二醇-羧基或胆固醇-聚乙二醇-羟基的一种。
10.优选地，有机荧光染料为罗丹明6g、罗丹明123、罗丹明b、荧光素、花菁染料cy3、花菁染料cy3.5、花菁染料cy5、花菁染料cy5.5、花菁染料cy7、花菁染料cy7.5、花菁染料磺基-cy3、花菁染料磺基-cy5、花菁染料磺基-cy7等的一种。
11.优选地，磷酸缓冲溶液的ph为6～6.5。
12.本发明还提供了一种敏感性荧光染料剂的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)将磷脂加入到含有乙醇的纯水中，高速剪切30～35min后，先在25～30℃下进行第一次超声处理，再在40～45℃下进行第一次减压旋蒸，形成均质膜；
14.(2)将peg胆固醇衍生物溶解在磷酸缓冲溶液中，常压下在高速剪切30～35min，形成分散液；
15.(3)向均质膜中加入分散液，高速剪切进行分散乳化，再加入有机荧光染料，再继续高速剪切并加热至30～35℃水化45～50min，再进行25～30℃下第二次超声处理，过微孔滤膜除菌，得到敏感性荧光染料剂。
16.优选地，第一次、第二次超声处理：超声处理为间歇式超声，功率60～65w。
17.其中，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间为21～24s。
18.优选地，含有乙醇的纯水中，乙醇的质量分数为60～70％。
19.优选地，含有乙醇的纯水质量为磷脂的3～5倍。
20.本发明的有益效果：本发明的敏感性荧光染料剂是将荧光染料包裹在脂质体内，且使用peg胆固醇衍生物乳化分散，使荧光染料具有亲水溶性也具疏水性，进而增强荧光染料对细胞体的敏感性，提高荧光染料对细胞膜穿透性；同时脂质体包裹荧光染料，减少了荧光染料在成像传输过程的释放，提高了荧光染料在成像传输过程的稳定性；本发明的敏感性荧光染料剂中的脂质体分子粒径分散性好，还能够避免荧光染料的团聚，延长成像时间，成像效果好；本发明的敏感性荧光染料剂能够有效的实现荧光染料在体内的传递，提高荧光染料分子的标记性能，提高体内成像效果；本发明的敏感性荧光染料剂使用时无需有机溶剂辅助，能够减少毒性。
附图说明
21.图1为实施例1至实施例6及对比例5敏感性荧光染料剂中脂质体完整状态下的荧光强度；
22.图2为实施例1至实施例6及对比例5脂质体破裂后的荧光强度。
具体实施方式
23.为了对本发明作出更加清楚完整地说明，下面用具体实施例说明本发明，但并不是对发明的限制。
24.实施例1
25.一种敏感性荧光染料剂，其具体制备方法步骤如下：
26.(1)将由磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺按照重量比1:0.0.68混合而成的磷脂10g加入到乙醇质量分数为70％的纯水30g中，高速剪切30～35min后，先在25～30℃下进行第一次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间21s，再在40～45℃下进行第一次减压旋蒸，形成均质膜；
27.(2)将胆固醇-聚乙二醇-氨基2.38g溶解在ph为6～6.5的磷酸缓冲溶液16g中，常压下在高速剪切30～35min，形成分散液；
28.(3)向均质膜中加入分散液，高速剪切进行分散乳化，再加入罗丹明b4.13g，再继续高速剪切并加热至30～35℃水化45～50min，再进行25～30℃下第二次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间21s，过微孔滤膜除菌，得到敏感性荧光染料剂。
29.实施例2
30.一种敏感性荧光染料剂，其具体制备方法步骤如下(1)将由磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸按照重量比1:0.82混合而成的磷脂10g加入到乙醇质量分数为65％的纯水40g中，高速剪切30～35min后，先在25～30℃下进行第一次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间24s，再在40～45℃下进行第一次减压旋蒸，形成均质膜；
31.(2)将胆固醇-聚乙二醇-氨基2.38g溶解在ph为6～6.5的磷酸缓冲溶液16g中，常压下在高速剪切30～35min，形成分散液；
32.(3)向均质膜中加入分散液，高速剪切进行分散乳化，再加入罗丹明b4.13g，再继续高速剪切并加热至30～35℃水化45～50min，再进行25～30℃下第二次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间24s，过微孔滤膜除菌，得到敏感性荧光染料剂。
33.实施例3
34.一种敏感性荧光染料剂，其具体制备方法步骤如下：
35.(1)将由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰丝氨酸按照重量比1:0.25:0.45混合而成的磷脂10g加入到乙醇质量分数为65％的纯水30g中，高速剪切30～35min后，先在25～30℃下进行第一次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间21s，再在40～45℃下进行第一次减压旋蒸，形成均质膜；
36.(2)将胆固醇-聚乙二醇-氨基2.38g溶解在ph为6～6.5的磷酸缓冲溶液16g中，常压下在高速剪切30～35min，形成分散液；
37.(3)向均质膜中加入分散液，高速剪切进行分散乳化，再加入罗丹明b4.13g，再继续高速剪切并加热至30～35℃水化45～50min，再进行25～30℃下第二次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间21s，过微孔滤膜除菌，得到敏感性荧光染料剂。
38.实施例4
39.本实施例4的敏感性荧光染料剂与实施例3相同，不同在于：本实施例4的磷脂由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰丝氨酸按照重量比1:0.3:0.45混合而成。
40.实施例5
41.本实施例5的敏感性荧光染料剂与实施例1相同，不同在于：本实施例6的peg胆固醇衍生物为胆固醇-聚乙二醇-羧基。
42.实施例6
43.本实施例6的敏感性荧光染料剂与实施例1相同，不同在于：本实施例6的peg胆固醇衍生物为胆固醇-聚乙二醇-羟基。
44.实施例7
45.一种敏感性荧光染料剂，其具体制备方法步骤如下：
46.(1)将由磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺按照重量比1:0.0.68混合而成的磷脂10g加入到乙醇质量分数为60％的纯水50g中，高速剪切30～35min后，先在25～30℃下进行第一次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间24s，再在40～45℃下进行第一次减压旋蒸，形成均质膜；
47.(2)将胆固醇-聚乙二醇-羧基2.58g溶解在ph为6～6.5的磷酸缓冲溶液20g中，常压下在高速剪切30～35min，形成分散液；
48.(3)向均质膜中加入分散液，高速剪切进行分散乳化，再加入罗丹明6g4.35g，再继续高速剪切并加热至30～35℃水化45～50min，再进行25～30℃下第二次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间24s，过微孔滤膜除菌，得到敏感性荧光染料剂。
49.实施例8
50.一种敏感性荧光染料剂，其具体制备方法步骤如下(1)将由磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸按照重量比1:0.82混合而成的磷脂10g加入到乙醇质量分数为65％的纯水30g中，高速剪切30～35min后，先在25～30℃下进行第一次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间21s，再在40～45℃下进行第一次减压旋蒸，形成均质膜；
51.(2)将胆固醇-聚乙二醇-羟基2.73g溶解在ph为6～6.5的磷酸缓冲溶液18g中，常压下在高速剪切30～35min，形成分散液；
52.(3)向均质膜中加入分散液，高速剪切进行分散乳化，再加入花菁染料cy7 4.65g，再继续高速剪切并加热至30～35℃水化45～50min，再进行25～30℃下第二次超声处理，在功率60～65w下，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间21s，过微孔滤膜除菌，得到敏感性荧光染料剂。
53.对比例1
54.本对比例1的敏感性荧光染料剂与实施例1相同，不同在于：本对比例1的磷脂为磷脂酰胆碱。
55.对比例2
56.本对比例2的敏感性荧光染料剂与实施例1相同，不同在于：本对比例2的磷脂为磷脂酰乙醇胺。
57.对比例3
58.本对比例3的敏感性荧光染料剂与实施例1相同，不同在于：本对比例3的磷脂为磷脂酰丝氨酸。
59.对比例4
60.本对比例4的敏感性荧光染料剂与实施例1相同，不同在于：本对比例4的步骤(2)中是胆固醇2.38g溶解在ph为6～6.5的磷酸缓冲溶液16g中。
61.对比例5
62.本对比例5的敏感性荧光染料剂与实施例1相同，不同在于：本对比例5的第一次、第二次超声处理为连续超声，超声时间为21。
63.对比例6
64.本对比例6的敏感性荧光染料剂与实施例1相同，不同在于：本对比例6的第一次、第二次超声处理为间歇式超声，每隔2s中超声一次，一次超声2s，超声总时间24s。
65.效果实施例
66.1、取上述实施例1至实施例6、对比例1至对比例6制备的敏感性荧光染料剂，在30～35℃下减压旋蒸浓缩，干燥后，经测试，结果如表1所示。
[0067][0068]
通过上表1，本发明的敏感性荧光染料剂，与对比例1至对比例3相比，经浓缩、干燥后，实施例1至实施例8具有较高的包封率，包封率大于91％，粒径分布均一，分散性更好；与对比例5和对比例6相比，实施例1至实施例8具有更高的包封率，包封率大于91％，粒径更小，粒径大小在110左右，放置一段时间，其粒径也基本没变化，分散性也更好；进而本发明的敏感性荧光染料剂具有良好的稳定性。
[0069]
2、取上述实施例1至实施例6制备的包裹罗丹明b的敏感性荧光染料剂，测定其脂质体完整状态下的荧光强度以及脂质体破裂后的荧光强度，结果如图1所示的脂质体完整状态下的荧光强度，结果如图2所示的脂质体破裂后的荧光强度；
[0070]
从图1和图2中发现，在脂质体完整状态下的荧光是猝灭的，脂质体破裂后，荧光可以得到恢复，而且脂质体包裹的包封率越高，脂质体破裂后期荧光染料的强度越高，表明了脂质体包裹荧光染料，可以有效避免荧光染料在输送过程中被淬灭，结合表1，表明脂质体的包封率高，有助于减少荧光染料在成像传输过程的释放，能够提高荧光染料在成像传输过程的稳定性，有助于延长成像时间、提高成像效果；实施例4、实施例3与实施例1、实施例2相比，实施例4、实施例3以由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰丝氨酸混合而成的磷脂对荧光染料的包封率更好；实施例1、实施例2、实施例5、实施例6与对比例5相比，采用胆固醇-聚乙二醇-氨基、胆固醇-聚乙二醇-羧基或胆固醇-聚乙二醇-羟基等peg胆固醇衍生物对磷脂分散乳化，在脂质体破裂后，peg胆固醇衍生物提高荧光染料敏感性，提高了荧光强度。
[0071]
除了对罗丹明b进行了脂质体包裹，实施例7还提供了包裹罗丹明6g、实施例8还提供了包裹花菁染料cy7，另外，还经过大量实验对罗丹明123、荧光素、花菁染料cy3、花菁染料cy3.5、花菁染料cy5、花菁染料cy5.5、花菁染料cy7.5、花菁染料磺基-cy3、花菁染料磺基-cy5、花菁染料磺基-cy7等不同的荧有机荧光染料进行了实验，在脂质体完整状态下的荧光染料的荧光强度及脂质体破裂的荧光染料的荧光强度的结果与图1、图2的趋势类似，
所以，本发明的敏感性荧光染料剂在脂质体完整状态下的荧光是猝灭的，脂质体破裂后，荧光可以得到恢复，而且脂质体包裹的包封率越高，脂质体破裂后期荧光染料的强度越高，表明了脂质体包裹荧光染料，可以有效避免荧光染料在输送过程中被淬灭，能够减少荧光染料在成像传输过程的释放，能够提高荧光染料在成像传输过程的稳定性，有助于延长成像时间、提高成像效果；本发明的敏感性荧光染料剂的脂质体使得荧光染料剂具有很好的细胞穿透性、相容性、稳定性。
[0072]
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

技术特征：
1.一种敏感性荧光染料剂，其特征在于，由以下原料：磷脂、peg胆固醇衍生物、磷酸缓冲溶液、有机荧光染料组成，且有机荧光染料包裹在磷脂中；其中，有机荧光染料的质量为磷脂质量的41.3～46.5％，peg胆固醇衍生物的质量为磷脂质量的23.8～27.3％，磷酸缓冲溶液的质量为磷脂质量的1.6～2倍。2.根据权利要求1所述的一种敏感性荧光染料剂，其特征在于，磷脂是由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸两种或者两种以上混合而成。3.根据权利要求2所述的一种敏感性荧光染料剂，其特征在于，磷脂为由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰丝氨酸按照重量比1:0.3:0.45混合而成。4.根据权利要求1所述的一种敏感性荧光染料剂，其特征在于，peg胆固醇衍生物为胆固醇-聚乙二醇-氨基、胆固醇-聚乙二醇-羧基或胆固醇-聚乙二醇-羟基的一种。5.根据权利要求1所述的一种敏感性荧光染料剂，其特征在于，有机荧光染料为罗丹明6g、罗丹明123、罗丹明b、荧光素、花菁染料cy3、花菁染料cy3.5、花菁染料cy5、花菁染料cy5.5、花菁染料cy7、花菁染料cy7.5、花菁染料磺基-cy3、花菁染料磺基-cy5或花菁染料磺基-cy7的一种。6.根据权利要求1所述的一种敏感性荧光染料剂，其特征在于，磷酸缓冲溶液的ph为6～6.5。7.一种用于权利要求1所述的一种敏感性荧光染料剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将磷脂加入到含有乙醇的纯水中，高速剪切30～35min后，先在25～30℃下进行第一次超声处理，再在40～45℃下进行第一次减压旋蒸，形成均质膜；(2)将peg胆固醇衍生物溶解在磷酸缓冲溶液中，常压下在高速剪切30～35min，形成分散液；(3)向均质膜中加入分散液，高速剪切进行分散乳化，再加入有机荧光染料，再继续高速剪切并加热至30～35℃水化45～50min，再进行25～30℃下第二次超声处理，过微孔滤膜除菌，得到敏感性荧光染料剂。8.根据权利要求7所述的一种敏感性荧光染料剂的制备方法，其特征在于，第一次、第二次超声处理：超声处理为间歇式超声，功率60～65w。9.根据权利要求8所述的一种敏感性荧光染料剂的制备方法，其特征在于，每隔2s中超声一次，一次超声3s，超声总时间为21～24s。

技术总结
本发明公开了一种敏感性荧光染料剂及其制备方法，敏感性荧光染料剂由以下原料：磷脂、PEG胆固醇衍生物、磷酸缓冲溶液、有机荧光染料组成，且有机荧光染料包裹在磷脂中；制备过程先将磷脂形成均质膜，再将PEG胆固醇衍生物、磷酸缓冲溶液形成分散液，再将均质膜、有机荧光染料在分散液分散乳化，制备得到敏感性荧光染料剂。本发明荧光染料剂具有良好的细胞穿透性、相容性、稳定性，且其制备简单方便。且其制备简单方便。且其制备简单方便。


技术研发人员：向国兵 施琦 陈功俊
受保护的技术使用者：南京溯远基因科技有限公司
技术研发日：2023.04.19
技术公布日：2023/8/14