与对过继细胞疗法的应答相关的T细胞表型的制作方法

与对过继细胞疗法的应答相关的t细胞表型
相关申请的交叉引用
1.本专利申请要求2020年9月8日提交的美国临时专利申请第63/075,536号的权益，将所述美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。关于联邦赞助的研究或开发的声明
2.本发明是在政府支持下由美国国立卫生研究院国家癌症研究所在项目号zia bc 010984和ziabc 011726下进行的。政府享有本发明的某些权利。以电子方式提交的材料通过引用并入
3.在此全文引入作为参考的是与本技术同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列列表，并如下定义：2021年9月7日提交的名为“756715_st25.txt”的一个134,069 byte ascii(text)文件。发明背景
4.使用t细胞的过继细胞疗法(act)可以在一些患者中产生阳性临床应答。然而，act成功用于治疗癌症和其它病况的几个障碍仍然存在。例如，t细胞表型对act在人类中的临床成功的影响尚未阐明。因此，需要制备用于act的细胞群体的改进方法。发明概述
5.本发明的一个实施方案提供了获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)从所述大量群体中特异性地选择具有包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-的表型的t细胞；以及(c)将(b)中选择的细胞与缺乏所述表型的细胞分离以获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体。
6.本发明的另一个实施方案提供了获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)从所述肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞；(c)从所述分离的肿瘤反应性t细胞中特异性地选择具有包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-的表型的t细胞；以及(d)将(c)中选择的细胞与缺乏所述表型的细胞分离以获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体。
7.本发明的另一个实施方案提供了获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从来自患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)从所述肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞；以及(c)修饰所述分离的肿瘤反应性t细胞以提供包含标志物cd39-和cd69-的表型，从而获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体。
8.本发明的另一个实施方案提供了制备富含具有cd3
+
cd39-cd69-表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从来自患者的肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞；以及(b)修饰所述分离的肿瘤反应性t细胞以(i)诱导一种或多种以下标志物的表达：ahnak
+
、al592183.1
+
、anxa1
+
、anxa4
+
、aqp3
+
、atm
+
、bin1
+
、c10orf54
+
、c11orf21
+
、c16orf54
+
、ccdc109b
+
、cd27
+
、cd52
+
、cd55
+
、cd8b
+
、cdc25b
+
、cdc42se1
+
、clec2b
+
、clic3
+
、cluap1
+
、crbn
+
、ctd-3184a7.4
+
、ddi2
+
、dnd1
+
、emp3
+
、epb41
+
、ern1
+
、faim3
+
、fam65b
+
、fbxl8
+
、fgfbp2
+
、gadd45b
+
、gimap4
+
、gimap7
+
、gpr155
+
、gzmm
+
、hsd17b11
+
、il10ra
+
、il7r
+
、isg20
+
、kansl1-as1
+
、klf2
+
、klhl24
+
、ldlrap1
+
、lef1
+
、lgals3
+
、linc00861
+
、litaf
+
、lyar
+
、mapkapk5-as1
+
、
med15
+
、miat
+
、mir142
+
、mxi1
+
、myc
+
、neat1
+
、nosip
+
、odf2l
+
、p2ry8
+
、pde6g
+
、pik3ip1
+
、plec
+
、plp2
+
、ppp2r5c
+
、pxn
+
、r3hdm4
+
、ramp1
+
、rasa3
+
、rasgrp2
+
、rcbtb2
+
、rnaset2
+
、rp11-395b7.4
+
、rp11-539l10.2
+
、rp11-640m9.1
+
、s100a10
+
、s100a4
+
、s100a6
+
、s1pr1
+
、s1pr4
+
、samd3
+
、sell
+
、sh3bp5
+
、sigirr
+
、slamf6
+
、slco3a1
+
、sorl1
+
、stk38
+
、synj2
+
、tcf7
+
、timp1
+
、tradd
+
、tsc22d3
+
、tspan32
+
、txnip
+
、ubxn11
+
、vcl
+
、vnn2
+
、ypel3
+
、zfp36l2
+
、znf276
+
和znf683
+
，和/或(ii)抑制一种或多种以下标志物的表达：acot7+、adam19+、agpat9+、agtrap+、aif1+、aspm+、atad2+、aurka+、aurkb+、birc3+、birc5+、brca1+、c15orf48+、casc5+、ccl3+、ccna2+、ccnb1+、ccnb2+、ccnd2+、cd38+、cd40lg+、cd69+、cd8b+、cdc20+、cdca3+、cdca8+、cdk1+、cdkn3+、cdt1+、cenpa+、cenpe+、cenpf+、cenpm+、cenpw+、cep55+、cish+、cks1b+、cks2+、clspn+、crtam+、csf2+、dlgap5+、dusp5+、dusp6+、dut+、egr1+、entpd1+、fen1+、gins2+、gtse1+、h2afx+、hist1h4c+、hla+dqa2+、hmmr+、ifi27+、ifng+、il2ra+、il5+、kiaa0101+、kif11+、kif23+、kpna2+、krt7+、mad2l1+、mcm7+、mki67+、mx1+、mybl2+、ncapg+、ndc80+、ndfip2+、nudt1+、nusap1+、orc6+、pbk+、pcna+、plk1+、rpl39l+、rrm2+、sgol2+、shcbp1+、smc2+、spc25+、stmn1+、tesc+、tk1+、tnf+、tnfrsf18+、tnfsf10+、top2a+、tpm4+、tpx2+、tuba1b+、tuba1c+、tubb+、tyms+、ube2c+、ube2s+、ube2t+、xcl1+和zwint+，其中(i)中诱导一种或多种所述标志物的表达和/或(ii)中抑制一种或多种所述标志物的表达诱导所述t细胞具有cd3
+
cd39-cd69-表型。
9.本发明的其它实施方案提供了根据本发明方法中的任一种获得的分离的或纯化的细胞群体和包含其的相关药物组合物。
10.本发明的另一个实施方案提供了治疗或预防哺乳动物中病况的方法，所述方法包括根据本发明方法中的任一种获得富含具有表型的t细胞的细胞群体，以及将所述细胞群体或包含所述细胞群体的药物组合物以有效治疗或预防哺乳动物中病况的量施用至所述哺乳动物，其中所述病况是癌症。
11.本发明的另一个实施方案提供了针对癌症患者选择疗法的方法，所述方法包括：(a)从来自患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)测量(i)具有或(ii)缺乏表型的大量群体中t细胞的比例，其中所述表型包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-；以及(c)将(i)具有或(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例与对照进行比较；以及(d)当(i)具有所述表型的t细胞的比例低于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照时，选择所述患者进行不是免疫疗法的疗法；或者(e)当(i)具有所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例低于所述对照时，选择所述患者进行免疫疗法。
12.本发明的另一个实施方案提供了治疗患者中癌症的方法，所述方法包括：接收针对癌症患者选择的疗法的鉴定，其中已经通过本发明方法中的任一种选择所述疗法；以及(i)当(i)具有所述表型的t细胞的比例低于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照时，通过向所述患者施用有效治疗所述患者中癌症的量的不是免疫疗法的疗法来治疗所述患者；或者(ii)当(i)具有所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例低于所述对照时，通过向所述患者施用有效治疗所述患者中癌症的量的免疫疗法来治疗所述患者。
13.本发明的另一个实施方案提供了预测癌症患者对免疫疗法的临床应答的方法，所
述方法包括：(a)从来自所述癌症患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)测量(i)具有或(ii)缺乏表型的大量群体中t细胞的比例，其中所述表型包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-‑
；以及(c)将(i)具有或(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例与对照进行比较；以及(d)当(i)具有所述表型的t细胞的比例低于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照时，将所述患者鉴定为可能对所述免疫疗法具有阴性临床应答；或者(e)当(i)具有所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例低于所述对照时，将所述患者鉴定为可能对所述免疫疗法具有阳性临床应答。附图中若干视图的简要说明
14.图1a是说明用于实施例中描述的研究的黑色素瘤群组患者act输注产物(i.p.)和方案的示意图。
15.图1b显示了来自所有患者i.p.的i.p.中活的cd45
+
cd3
+
细胞群集(左)，仅来自cr i.p.的群集(中间)以及仅来自nr i.p.的群集(右)的t-sne(t分布随机邻近嵌入)图。
16.图1c是显示每个群集中cr和nr i.p.细胞的百分比的图，针对所有群集通过邦费罗尼校正(bonferroni correction)调整的双侧wilcoxon秩和检验，*p＝0.0264。
17.图1d-1e是显示示出总的cd8
+
(1e)和总的cd3
+
(1f)的cd39-cd69-(dn)细胞的百分比的cr i.p.和nr i.p.样品(n＝38)的基于流式的独立验证结果的散点图。
18.图1f是显示cr i.p.和nr i.p.(n＝38)内输注细胞的总数目的散点图。
19.图1g是显示cr i.p.和nr i.p.(n＝38)中cd8
+
cd39-cd69-(dn)细胞的总数目的散点图。通过双侧wilcoxon秩和检验，*p《0.05**p《0.01。
20.图1h显示了通过输注的中值总细胞数目(左)和输注的中值cd8
+
cd39-cd69-(dn)细胞数目(右)分开的所有i.p.样品(n＝54)的无进展生存期(pfs)。
21.图1i显示了通过输注的中值细胞数目(左)和输注的中值cd39-cd69-细胞数目(右)分开的所有i.p.样品(n＝54)的黑色素瘤特异性生存期(mss)。“低”表示i.p.细胞小于所分析的亚组的中值的患者，以及“高”表示图1h-1i中具有i.p.的患者。分析大于亚组的中值的细胞。通过对数秩mantel-cox检验的p值显示在图1h-1i中。
22.图2a是来自cr和nr i.p.(5个cr，5个nr)的所有cd8
+
til的t-sne图。
23.图2b是代表在cr和nr i.p.内的s.cluster.a(顶部)和s.cluster.b(底部)的百分比的箱形图。s.cluster.a涵盖群集c0、c2、c5、c6和c7；s.cluster.b包含群集c1、c3、c4和c8。显示了通过双侧wilcoxon秩和检验，*p《0.05。
24.图2c是显示分析结果的条形图，其中每名患者i.p.由dn和dp基因标签分数进行评分，并且将它们的平均scgsea分数绘制在y轴上。比较cr与nr之间的平均dn和dp标签分数的双侧wilcoxon秩和检验，****p《0.0001。
25.图2d显示了散点图，其显示了在表示为％的每个亚组(亲本门)的验证组中(n＝38)患者i.p.的每个亚组(dn[cd39-cd69-]、sp[cd39-cd69
+
、cd39
+
cd69-]和dp[cd39
+
cd69
+
)内抑制性和记忆标志物的流式细胞术分析的结果。通过邦费罗尼多重比较校正的双侧wilcoxon秩和检验比较dn和其它亚组，*p《0.05**p《0.01***p《0.001****p《0.0001。流式细胞术分析显示了cd39-cd9-亚组中t细胞耗竭标志物的低表达。
[0026]
图2e是显示对dn和dp亚组的细胞内tcf7表达的流式细胞术分析的结果的图。直方图显示了代表性患者i.p.样品(顶部)，以及箱形图显示了18种i.p.的定量(底部)。通过双
侧wilcoxon秩和检验，***p《0.001。流式细胞术分析显示了cd39-cd69-亚组中t细胞干性因子tcf7的表达较高。
[0027]
图2f显示了示出代表性患者样品在抗cd3/抗cd28刺激48小时之前和之后的dn、sp和dp状态的表型的流式细胞术图(左)，以及定量刺激facs分选的dn亲本(圆圈)或facs分选的dp亲本(正方形)之后的子细胞的表型的点图。通过双侧wilcoxon秩和检验，***p《0.001，n＝6种i.p.
[0028]
图2g显示了图。来自icb前疗法的til由最高的dn和dp基因标签分数进行评分，以及平均的scgsea分数绘制在y轴上。来自响应病变的til用a表示，以及来自进行性病变的细胞用b表示。显示了细胞数目以及通过双侧wilcoxon秩和检验，****p《0.0001。
[0029]
图3a显示了代表性cr i.p.，其显示了新抗原特异性四聚体(顶部)以及大量cd8+til和cd8+四聚体+til的cd39/cd69表型(底部)的检测。四聚体类别下列出的象限内的数字代表每个cd8
+
四聚体
+
门内亚群的百分比。
[0030]
图3b显示了nr i.p.，其具有相当数目的新抗原(顶部)以及大量cd8
+
til和cd8
+
四聚体
+
til的cd39/cd69表型(底部)。四聚体类别下列出的象限内的数字代表每个cd8
+
四聚体
+
门内亚群的百分比。
[0031]
图3c显示了来自11名患者的每个单独四聚体的表示为四聚体
+
细胞的百分比的所有26个新抗原特异性t细胞群体内的dn、sp和dp表型。将cr和nr组合用于该数据分析(cr+nr)。通过双侧wilcoxon秩和检验，*p《0.05，****p《0.0001，然后进行邦费罗尼校正用于多重比较。
[0032]
图3d是显示按应答状态(cr对比nr)细分的26种新抗原特异性til的dn、sp和dp表型的图。对于每个亚组，通过crs与nr四聚体
+
细胞之间的双侧wilcoxon秩和检验，**p《0.01，***p《0.001。
[0033]
图3e是显示按应答状态(cr对比nr)细分的cd39阴性新抗原特异性四聚体
+
til(cd39-作为单一标志物)的图。通过双侧wilcoxon秩和检验，****p《0.0001。
[0034]
图3f是来自3713-cr i.p.的cd8
+
til的t-sne图，其显示了干细胞样dn和分化的dp基因标签的投影。虚线表示分析的干细胞样和分化的群集。
[0035]
图3g是显示针对每种新抗原特异性展示为总的neotcr
+
细胞的百分比的来自干细胞样c0群集和分化的c1群集的pt.3713neotcr
+
细胞的图。
[0036]
图3h是显示通过每个neotcr
+
克隆型的平均适合度分数(dn值减去dp scgsea分数)评分的所述克隆型的图。正值表示干细胞样表型中的克隆型富集，以及负值表示分化状态中的克隆型富集。
[0037]
图3i是显示在输注产物(第0天)中标准化至最初频率的外周血中来自pt.3713-cr i.p.的免疫显性srpx
mut neotcr克隆型的act后持久性的图。
[0038]
图3j是来自pt.4000-nr i.p.的cd8
+
til的t-sne图，其显示了干细胞样dn和分化的dp基因标签的投影(左)，抗原特异性遮蔽的新抗原特异性tcr的投影(右)。虚线表示分析的干细胞样和分化群集。
[0039]
图3k是显示通过如图3h所述的其平均适合度分数评分的每个neotcr
+
克隆型(hivep2
mut
、amph
mut
)的图。
[0040]
图3l是显示在输注产物中标准化至其频率的外周血中来自pt.4000-nr的
hivep2
mut
和amph
mut neotcr克隆型的act后持久性的图。由于疾病进展，在150天停止患者随访。
[0041]
图4a是在对ny-eso-1tcr疗法的完全应答者(eso.cr)的治疗后外周血中使用内源性人tcr追踪ny-eso-1tcr转导的(eso.tcr
+
)i.p.克隆的方案。
[0042]
图4b是显示根据tcr输注产物中dn(圆圈)和dp(正方形)表型的富集使用内源性人tcr的前20种eso.tcr
+
i.p.克隆的治疗后外周血持久性的图。具有(dn频率/dp频率)》1的克隆被定义为在dn状态富集；具有(dn频率/dp频率)《1的克隆被定义为在dp状态富集。
[0043]
图4c是通过cd39-cd69-干细胞样状态内的克隆型频率与i.p中cd39
+
cd69
+
分化状态内的克隆型频率的比率，比较act后第7天不可检测的克隆(非持久性)与act后第1846天长期持久性克隆的小提琴图。比率》1代表在dn状态富集，而比率《1代表在dp状态富集。通过双侧wilcoxon秩和检验，**p《0.01。
[0044]
图4d是将分选的dn和dp pmel转基因t细胞过继转移到具有建立的b16黑色素瘤肿瘤的小鼠中的方案。
[0045]
图4e是显示用两个剂量的pmel dn或dp t细胞处理的b16荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线的图。n＝6只小鼠/组。通过wilcoxon秩和检验计算的肿瘤生长动力学的*p《0.05**p《0.01。a代表未处理的。b代表用cd39
+
cd69
+
(3e5、5e5剂量)处理。c代表用cd39-cd69-(3e5剂量)处理。d代表用cd39-cd69-(5e5剂量)处理。
[0046]
图4f是显示用两个剂量的pmel dn或dp t细胞处理的b16荷瘤小鼠的存活曲线的图。n＝6只小鼠/组。通过wilcoxon秩和检验计算的肿瘤生长动力学的*p《0.05**p《0.01。虚线表示未处理的。a(正方形)代表用cd39
+
cd69
+
(3e5、5e5剂量)处理。b代表用cd39-cd69-(3e5剂量)处理。c代表用cd39-cd69-(5e5剂量)处理。
[0047]
图4g是干细胞样t细胞在免疫疗法和act成功中的作用以及处于干细胞样和终末分化状态的肿瘤突变反应性t细胞的矛盾性质的图示。
[0048]
图5a显示了用于cytof数据的t-sne投影的cytof数据的手动设门(左：活细胞门；右：cd45
+
dna(2n)单线态门(singlet gate))。
[0049]
图5b是说明用于cytof数据的数据处理流水线的示意图：将活化/耗竭标志物(ctla-4、pd-1、cd28、lag3、ox40、cd25、fas、4-1bb、hla-dr、cd39、cd69、icos)与分化标志物(例如cd2、cd3、cd4、cd8等)区分开以处理数据。将建立在k最近邻(knn)分类的分层聚集学习算法(hal-x)用于将细胞分类为22个群集，仅在分化标志物的表达上训练所述k最近邻(knn)分类，即“纯的分化群集(pdc)”。然后在这22个群集上测量活化/耗竭标志物的表达水平以生成特征矩阵。基于患者的临床应答，选择具有高辨别力的特征以建立患者的分类器(cr：完全应答；nr：进行性疾病)。
[0050]
图5c显示了基于活化/耗竭标志物分类患者的接受者操作特征(roc)：对于分析的17名患者，曲线下面积(auc)大于89％。这里呈现了五次迭代(“拆分”)，对应于患者样品的80％/20％拆分成随机的训练和测试亚组；“平均值”代表五次拆分中的平均roc；“基线”代表随机分类的roc。
[0051]
图6a显示了对来自一个代表性cr和nr i.p的cd8
+
t细胞设门的cd39和cd69表达点图(左图)和16种i.p的定量(右图)。顶部行代表两个患者的cytof数据以及底部行代表同一患者的流式细胞术分析。数字表示通过双侧wilcoxon秩和检验的p值。
[0052]
图6b显示了针对cd39-cd69-亚组分析的16种i.p.样品的流式细胞术与cytof分析之间的线性回归。
[0053]
图6c显示了在应答者与非应答者之间比较的38种验证i.p.中各种亚组的表达谱。数字表示在没有多次校正的情况下通过单独分析的双侧wilcoxon秩和检验的p值。
[0054]
图7a-7c显示了示出根据在输注产物中接受的til亚群的细胞数目的无进展生存期和黑色素瘤特异性生存期的图。7a：输注的i.p.细胞的pfs和mss除以cd8
+
细胞数目和cd39
+
cd69
+
(dp)细胞数目(在中值处)，得到高和低。7b：由指示细胞的低(虚线)、中和高三分位数的三分位数显示的i.p.中患者应答对总细胞数目和cd8
+
细胞数目缺乏剂量依赖性。7c：由指示细胞的低(虚线)、中和高三分位数的三分位数显示的i.p.中患者应答对cd39-cd69-(dn)细胞数目的剂量依赖性，以及对cd39
+
cd69
+
(dp)细胞数目缺乏剂量依赖性。箭头表示来自输注的dn细胞的统计上显著的三分位数分析。所有图中的数字通过mantel-cox对数秩检验指示p值。
[0055]
图8a显示了来自4种i.p.(2个cr，2个nr)定义的4420个cd39-cd69-细胞(具有cd39和cd69共表达的最后两个四分位的细胞)和cd39
+
cd69
+
细胞(共表达cd39和cd69的前两个四分位的细胞)的9335个单细胞(圆圈)上的cd39/cd69转录组分析。
[0056]
图8b显示了来自图8a的dn与dp亚组之间差异表达基因的火山图，其显示了统计上显著的目的基因。基因的完整列表列于表3中。
[0057]
图8c显示了图8b中所示的dn对比dp deg之间发现的基因数目的重叠以及图2b中所示的由应答者群集的无监督聚类所定义的s.cluster.a特异性基因。
[0058]
图9a显示了来自患者i.p.(3733-cr)的cd39-cd69-(dn)、cd39+cd69+(dp)和cd39-cd69+、cd39+cd69-(sp)状态的抑制性和记忆标志物的代表性流式细胞术图。数字表示％的亲本门(dn、sp和dp状态)。
[0059]
图9b显示了所示细胞表面标志物(n＝38种i.p.)的成对分析的总结。通过配对t检验，***p《0.001****p《0.0001。
[0060]
图10是显示在cd3/cd28刺激之后来自dn和dp亚组的分泌的细胞因子的图。从患者i.p(n＝5)中分离dn和dp亚组，并用抗cd3/cd28珠粒刺激48小时，然后对子细胞上清液中分泌的细胞因子进行多细胞因子分析。通过配对的wilcoxon检验，**p《0.05**p《0.01。
[0061]
图11a-11b是显示来自act i.p(n＝10)的til和来自sade-feldman样品群组的预icb处理cd8+til的平均表型适合度分数的图。平均适合度分数被定义为来自患者til的每个细胞的标准化dn与dp scgsea分数之差(dn减去dp)。图11a显示了来自图2c所示的cr、nr的act i.p.。图11b显示了来自图2g所示sade-feldman群组的预处理til。通过双侧wilcoxon检验，****p《0.0001。
[0062]
图12a显示了本研究中筛选的新抗原的hla限制性定义。
[0063]
图12b显示了对于本研究中筛选的患者，通过ifnγelispots针对突变体(正方形)和野生型(圆形)肽滴定来自i.p.的til或tcr所定义的新抗原特异性。另外的新抗原获自先前公开的研究。cdkn2af.s没有野生型。最后两个图面代表来自患者4000-nr的hivep2和amph neotcr，其被转导到健康pbl中并使用cd8
+
mtcrβ
+
亚组的4-1bb上调针对突变体和野生型肽进行滴定以证明neotcr特异性(在图3j-3l中使用)。
[0064]
图13显示了通过来自患者i.p.的四聚体进行的新抗原t细胞鉴定。来自11名患者
i.p.的所有26种新抗原显示在图3a-c中，通过双色四聚体(材料和方法)检测。数字表示每个患者i.p.内cd8+t细胞的％的新抗原特异性til。请注意，pt.3713具有其它新抗原，其是非四聚化的，但具有证实的neotcr。
[0065]
图14a显示了展示为针对每种neoag示出的干细胞样c0群集和分化的c1群集的百分比的3713neotcr
+
细胞。
[0066]
图14b显示了在i.p.中标准化至其频率，与图3i所示的srpx-neotcr数据相关的外周血中来自pt.3713-cr的其它亚优势neotcr克隆型的act后持久性。
[0067]
图15a显示了4000neotcr+细胞，其展示为针对每个neotcr特异性所示出的干细胞样c1/c5群集和分化的c0群集的百分比。
[0068]
图15b显示了针对每种新抗原特异性展示为总neotcr+细胞的百分比的来自干细胞样c1/c5群集和分化的c0群集的pt.4000-nr neotcr+细胞。
[0069]
图16a是体外增殖实验的方案。cd39-cd69-和cd39
+
cd69
+
cd8 t细胞从3733-cr i.p.通过facs分离的，并与自体3733-mel肿瘤细胞系共培养过夜。对来自dn和dp亚组(dn 4-1bb
+
、dp 4-1bb
+
)的肿瘤反应性cd8
+
4-1bb
+
细胞进行facs分离，并使用105个输入t细胞与辐照的饲养细胞重复进行快速扩增(rep，材料和方法)，以模拟act til输注产物。在完成rep培养实验时评估肿瘤反应性和细胞数目。
[0070]
图16b显示了在每个rep结束时获得的绝对细胞数目(左)和假定所有细胞作为随后输入的总肿瘤反应性理论细胞产量(右)。
[0071]
图16c显示了在与来自每个群体的自体3733-mel肿瘤系共培养之后，通过cd8
+
4-1bb上调评估每个rep'd亚组的肿瘤反应性。
[0072]
图16d显示了来自图s14c所示的一个生物重复的流式细胞术图。
[0073]
图17是说明本发明方法的各种实施方案的示意图。
[0074]
图18a是说明用于鉴定新抗原特异性肿瘤反应性干细胞样t细胞的精确标志物的示意图，所述新抗原特异性肿瘤反应性干细胞样t细胞在图3f的干细胞样cd39-cd69-(dn)群集中分化为旁观者干细胞样t细胞。
[0075]
图18b显示了来自图3f的旁观者dn t细胞与新抗原特异性t细胞亚组之间差异表达基因的火山图，显示了统计上显著的目的基因。基因的完整列表列于表4中。发明详述
[0076]
已经发现施用至癌症患者的cd39-cd69-t细胞群体可能与完全的癌症消退和/或t细胞持续性相关，以及施用至患者的cd39
+
cd69
+
t细胞群体可能与差的持续性相关。尽管施用至act应答者和无应答者的t细胞可以包括抗肿瘤新抗原反应性cd39
+
cd69
+
t细胞，但发现act应答者已经施用了cd39-cd69-新抗原特异性t细胞池，其在施用至act无应答者的t细胞中在很大程度上是缺乏的。与cd39
+
cd69
+
t细胞相比，肿瘤反应性cd39-cd69-t细胞可在患者体内提供增加的自我更新、扩增、持久性和抗肿瘤应答中的一种或多种。
[0077]
本发明的一个实施方案提供了获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法。可以将细胞群体施用至患者，例如用于治疗或预防癌症。
[0078]
所述方法可以包括从患者的肿瘤样品中获得大量的t细胞群体。肿瘤样品可以是例如来自原发性肿瘤的组织或来自转移性肿瘤部位的组织。因此，肿瘤样品可以通过任何合适的手段获得，包括但不限于抽吸、活组织检查或切除。
[0079]
所述方法还可以包括从大量群体中特异性地选择具有包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-的表型的t细胞。选择具有所述表型的t细胞可以包括将t细胞分选成单独的单一t细胞样品，以及分别检测一种或多种单一t细胞表达和/或不表达所述表型的一种或多种标志物。在本发明的一个实施方案中，特异性选择具有所述表型的t细胞包括进行单细胞转录组分析。
[0080]
可以使用例如铬单细胞基因表达溶液系统(10xgenomics,pleasanton,ca)(“chromium系统”)进行一种或多种单一t细胞表达和/或不表达一种或多种标志物的检测。chromium系统在逐个细胞的基础上对具有高通量数字基因表达的复杂细胞群体进行深度剖析。chromium系统向各细胞的cdna加条形码用于5’转录或t细胞受体(tcr)分析。例如，样品可以从10,000个细胞的输入开始，并产生约3000个细胞/样品的数据，平均约500个基因/细胞。
[0081]
在本发明的一个实施方案中，特异性选择具有所述表型的t细胞包括进行通过测序对转录组和表位的细胞索引(cite-seq)的分析。cite-seq描述在例如stoeckius等人,nat.methods,14(9):865
–
868(2017)中。简而言之，cite-seq将蛋白质标志物的基于抗体的检测与平行的许多单细胞的转录组图谱进行组合。寡核苷酸标记的抗体用于将细胞蛋白和转录组测量整合到有效的单细胞读出中。
[0082]
由于通过单细胞转录组分析产生的数据的高维度(例如，约3000个细胞/样品和约500个基因/细胞)，可以进行维度降低以分析标志物表达数据。因此，在本发明的一个实施方案中，特异性选择具有表型的t细胞包括进行t分布随机近邻嵌入(t-sne)分析。t-sne通过在二维或三维映射中给予每个数据点的位置来使高维数据可视化。t-sne描述在例如van der maaten和hinton,j.machine learning res.,9:2579-2605(2008)中。简而言之，在两个步骤中进行t-sne。在步骤1中，在规定了各种相邻点之间的关系的高维空间中创建概率分布。在步骤2中，重新创建尽可能地遵循该概率分布的低维空间。t-sne中的“t”来自t分布，其是在步骤2中使用的分布。“s”和“n”(“随机的”和“近邻”)来自邻近点中概率分布的使用。
[0083]
表型可以包括(i)一种或多种标志物的阳性表达，(ii)一种或多种标志物的阴性表达，或者(iii)一种或多种标志物的阳性表达与一种或多种标志物的阴性表达的组合。如本文所用，关于所示标记的表达，术语“阳性”(其可以缩写为“+”)意指与癌症患者的肿瘤样品中的其它t细胞相比，t细胞上调所示标志物的表达。上调的表达可以涵盖例如所示标志物的表达定量增加约0.2、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35或前述值中任两个的范围或更多的平均对数倍数变化(以2为基数)。关于所示标志物的表达，本文所用的术语“阴性”(其可缩写为
“‑”
)意指与癌症患者的肿瘤样品中的其它t细胞相比，t细胞下调所示标志物的表达。下调的表达可以涵盖例如所示标志物的表达定量降低约-0.2、约-0.5、约-1、约-2、约-3、约-4、约-5、约-6、约-7、约-8、约-9、约-10、约-11、约-12、约-13、约-14、约-15、约-16、约-17、约-18、约-19、约-20、约-21、约-22、约-23、约-24、约-25、约-26、约-27、约-28、约-29、约-30、约-31、约-32、约-33、约-34、约-35或前述值中任两个的范围或更多的平均对数倍数变化(以2为基数)。尽管下调的表达可涵盖所示标志物不存在表达，但下调也涵盖所示标志物存
在表达，虽然与癌症患者的肿瘤样品中的其它t细胞相比处于较低水平。
[0084]
具体地选择具有所述表型的t细胞可以包括检测标志物在本文所述表型中的表达产物是否存在或测量所述表达产物的量。在这方面，特异性地选择具有所述表型的t细胞可以包括检测由所述表型的阳性表达的标志物编码的蛋白质的存在。可选地或另外，特异性地选择具有所述表型的t细胞可以包括检测由在所述表型中表达阴性的标志物编码的蛋白质的不存在。可选地或另外，特异性地选择具有所述表型的t细胞可以包括测量由在所述表型中表达阴性的标志物编码的蛋白质的量。可选地或另外，特异性地选择具有所述表型的t细胞可以包括测量由在所述表型中表达阳性的标志物编码的蛋白质的量。可选地或另外，特异性地选择具有所述表型的t细胞可以包括检测由所述表型的阳性表达的标志物编码的rna的存在。可选地或另外，特异性地选择具有所述表型的t细胞可以包括检测由在所述表型中表达阴性的标志物编码的rna的不存在。可选地或另外，特异性地选择具有所述表型的t细胞可以包括测量由表型的阳性表达的标志物编码的rna的量。可选地或另外，特异性地选择具有所述表型的t细胞可以包括测量由表型的阴性表达的标志物编码的rna的量。在本发明的一个实施方案中，特异性地选择具有所述表型的t细胞包括检测所述表型中一种或多种标志物的细胞表面表达的存在和/或不存在。在本发明的一个实施方案中，特异性地选择具有所述表型的t细胞包括测量所述表型中一种或多种标志物的细胞表面表达的量。
[0085]
在本发明的一个实施方案中，表型还包含一种或多种以下标志物：ahnak
+
、al592183.1
+
、anxa1
+
、anxa4
+
、aqp3
+
、atm
+
、bin1
+
、c10orf54
+
、c11orf21
+
、c16orf54
+
、ccdc109b
+
、cd27
+
、cd52
+
、cd55
+
、cd8b
+
、cdc25b
+
、cdc42se1
+
、clec2b
+
、clic3
+
、cluap1
+
、crbn
+
、ctd-3184a7.4
+
、ddi2
+
、dnd1
+
、emp3
+
、epb41
+
、ern1
+
、faim3
+
、fam65b
+
、fbxl8
+
、fgfbp2
+
、gadd45b
+
、gimap4
+
、gimap7
+
、gpr155
+
、gzmm
+
、hsd17b11
+
、il10ra
+
、il7r
+
、isg20
+
、kansl1-as1
+
、klf2
+
、klhl24
+
、ldlrap1
+
、lef1
+
、lgals3
+
、linc00861
+
、litaf
+
、lyar
+
、mapkapk5-as1
+
、med15
+
、miat
+
、mir142
+
、mxi1
+
、myc
+
、neat1
+
、nosip
+
、odf2l
+
、p2ry8
+
、pde6g
+
、pik3ip1
+
、plec
+
、plp2
+
、ppp2r5c
+
、pxn
+
、r3hdm4
+
、ramp1
+
、rasa3
+
、rasgrp2
+
、rcbtb2
+
、rnaset2
+
、rp11-395b7.4
+
、rp11-539l10.2
+
、rp11-640m9.1
+
、s100a10
+
、s100a4
+
、s100a6
+
、s1pr1
+
、s1pr4
+
、samd3
+
、sell
+
、sh3bp5
+
、sigirr
+
、slamf6
+
、slco3a1
+
、sorl1
+
、stk38
+
、synj2
+
、tcf7
+
、timp1
+
、tradd
+
、tsc22d3
+
、tspan32
+
、txnip
+
、ubxn11
+
、vcl
+
、vnn2
+
、ypel3
+
、zfp36l2
+
、znf276
+
和znf683
+
。在本发明的一个实施方案中，所述表型还包含在本段中列出的标志物中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100种或更多种。在本发明的一个实施方案中，所述表型还包含在本段中列出的所有标志物。
[0086]
在本发明的一个实施方案中，所述表型缺乏一种或多种以下标志物：acot7
+
、adam19
+
、agpat9
+
、agtrap
+
、aif1
+
、aspm
+
、atad2
+
、aurka
+
、aurkb
+
、birc3
+
、birc5
+
、brca1
+
、c15orf48
+
、casc5
+
、ccl3
+
、ccna2
+
、ccnb1
+
、ccnb2
+
、ccnd2
+
、cd38
+
、cd40lg
+
、cd69
+
、cd8b
+
、cdc20
+
、cdca3
+
、cdca8
+
、cdk1
+
、cdkn3
+
、cdt1
+
、cenpa
+
、cenpe
+
、cenpf
+
、cenpm
+
、cenpw
+
、cep55
+
、cish
+
、cks1b
+
、cks2
+
、clspn
+
、crtam
+
、csf2
+
、dlgap5
+
、dusp5
+
、dusp6
+
、dut
+
、egr1
+
、entpd1
+
、fen1
+
、gins2
+
、gtse1
+
、h2afx
+
、hist1h4c
+
、hla
+
dqa2
+
、hmmr
+
、ifi27
+
、ifng
+
、il2ra
+
、il5
+
、
kiaa0101
+
、kif11
+
、kif23
+
、kpna2
+
、krt7
+
、mad2l1
+
、mcm7
+
、mki67
+
、mx1
+
、mybl2
+
、ncapg
+
、ndc80
+
、ndfip2
+
、nudt1
+
、nusap1
+
、orc6
+
、pbk
+
、pcna
+
、plk1
+
、rpl39l
+
、rrm2
+
、sgol2
+
、shcbp1
+
、smc2
+
、spc25
+
、stmn1
+
、tesc
+
、tk1
+
、tnf
+
、tnfrsf18
+
、tnfsf10
+
、top2a
+
、tpm4
+
、tpx2
+
、tuba1b
+
、tuba1c
+
、tubb
+
、tyms
+
、ube2c
+
、ube2s
+
、ube2t
+
、xcl1
+
和zwint
+
。在本发明的一个实施方案中，所述表型缺乏在本段中列出的标志物中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100种或更多种。在本发明的一个实施方案中，表型缺乏本段中列出的所有标志物。
[0087]
在本发明的一个实施方案中，所述表型还包含一种或多种以下标志物：ahi1
+
、alox5ap
+
、anxa5
+
、cd68
+
、cd74
+
、cd99
+
、cdc27
+
、cdca7
+
、cish
+
、cotl1
+
、ctsh
+
、ctsw
+
、ddx60
+
、gtsf1
+
、hist1h2ag
+
、hla-dpa1
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmgn3
+
、igfbp3
+
、il32
+
、ints4
+
、itgae
+
、itgb1
+
、klrc3
+
、lgals1
+
、lime1
+
、pdcd1
+
、ppm1m
+
、prss57
+
、rab34
+
、rbpms
+
、s100a11
+
、s100a4
+
、snap47
+
、tnfrsf10a
+
、vsir
+
、zbp1
+
和znf683
+
。在本发明的一个实施方案中，所述表型还包含在本段中列出的标志物中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38种或更多种。在本发明的一个实施方案中，所述表型还包含本段中列出的所有标志物。在本段中描述的表型可以具有新抗原特异性t细胞的特征，并且将新抗原特异性t细胞与旁观者t细胞区分开来。本文所用的短语“旁观者t细胞”意指对不相关抗原(不是新抗原)具有抗原特异性的t细胞。
[0088]
在本发明的一个实施方案中，所述表型缺乏一种或多种以下标志物：aqp3
+
、asxl2
+
、cd6
+
、cldnd1
+
、eef1a1
+
、epb41
+
、ern1
+
、fcmr
+
、gimap4
+
、gimap7
+
、gnly
+
、gzmk
+
、il27ra
+
、linc01943
+
、mrpl57
+
、mt-co1
+
、mt-co2
+
、rgs10
+
、rpl13a
+
、rpl18
+
、rpl18a
+
、rpl37
+
、rpl41
+
、rplp0
+
、sfmbt2
+
、tpt1
+
和trgv10
+
。在本发明的一个实施方案中，所述表型缺乏在本段中列出的标志物中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26种或更多种。在本发明的一个实施方案中，所述表型缺乏在本段中列出的所有标志物。本段中一种或多种标志物的存在可以具有旁观者t细胞的特征，以及本段中一种或多种标志物的存在可以将旁观者t细胞与新抗原特异性t细胞区分开来。相反，缺乏本段中描述的一种或多种标志物的表型可以具有新抗原特异性t细胞的特征，并且将新抗原特异性t细胞与旁观者t细胞区分开来。
[0089]
表型还可以包含标志物cd8
+
和cd4
+
中的一种或两种。可选地，表型还包含标志物cd8-和cd4-中的一种或两种。
[0090]
所述方法还可以包括将具有所述表型的所选细胞与缺乏所述表型的细胞分离，以获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体。在这方面，所选细胞可以与未选择的细胞，即不具有表型的细胞物理分离。所选细胞可以通过任何合适的方法，诸如例如分选与未选择的细胞分离。
[0091]
通过本发明的方法富含具有表型的t细胞的细胞群体本身可用于多种应用中的任一种，例如用于治疗病况(例如癌症)的过继细胞疗法。可选地或另外，富含具有表型的t细胞的细胞群体可以是肿瘤反应性t细胞的来源。因此，在本发明的一个实施方案中，所述方
法还可以包括从分离的具有表型的t细胞中分离肿瘤反应性t细胞。本发明方法的这种实施方案的说明性实例通过图17的项1a、1b和1c的集合显示。
[0092]
可以以本领域已知的多种方式中的任一种从分离的具有表型的t细胞中分离肿瘤反应性t细胞。用于分离肿瘤反应性t细胞的技术的实例描述在例如pasetto等人,cancer immunol.res.,4:734
–
743(2016)；parkhurst等人,clin.cancer res.,23:2491
–
2505(2017)；cohen等人,j.clin.invest.,125:3981
–
3991(2015)；lu等人,mol.ther.,26(2):1-10(2018)；us 2020/0056237；us 2017/0218042；wo 2017/048614；以及us 2020/0095548中。
[0093]
肿瘤反应性t细胞可对新抗原具有抗原特异性。本文所用的短语“抗原特异性的”和“抗原特异性”意指t细胞能够特异性结合并免疫识别抗原或其表位，使得t细胞与抗原或其表位的结合引发免疫应答。新抗原是一类在表达的蛋白质中由癌症特异性突变产生的癌抗原。术语“新抗原”涉及由癌细胞表达的肽或蛋白质，其包括与由正常(非癌性)细胞表达的相应野生型(非突变)肽或蛋白质相比的一个或多个氨基酸修饰。新抗原可以是患者特异性的。“癌症特异性突变”是体细胞突变，其存在于肿瘤或癌细胞的核酸中但不存在于相应的正常(即非肿瘤或非癌性)细胞的核酸中。
[0094]
在本发明的另一个实施方案中，肿瘤反应性t细胞可以首先从肿瘤样品中分离，然后具有表型的t细胞选自那些分离的肿瘤反应性t细胞。本发明方法的这种实施方案的说明性实例由图17的项1a、2a和2b的集合示出。
[0095]
在这方面，本发明的一个实施方案提供了获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括从患者的肿瘤样品中获得大量的t细胞群体。如本文关于本发明的其它方面所述，可以从肿瘤样品中获得大量的t细胞群体。
[0096]
所述方法还可以包括从肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞。这可以以本领域已知的多种方式中的任一种来实现。从肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞的技术的实例描述在例如pasetto等人,cancer immunol.res.,4:734
–
743(2016)；parkhurst等人,clin.cancer res.,23:2491
–
2505(2017)；cohen等人,j.clin.invest.,125:3981
–
3991(2015)；lu等人,mol.ther.,26(2):1-10(2018)；us 2020/0056237；us 2017/0218042；wo 2017/048614以及us 2020/0095548中。
[0097]
所述方法还可以包括从分离的肿瘤反应性t细胞中特异性地选择具有包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-的表型的t细胞，以及将所选细胞与缺乏所述表型的细胞分离，以获得富含具有表型的t细胞的细胞群体。所述表型可如本文关于本发明的其它方面所述。具有所述表型的t细胞的特异性选择和所选细胞与缺乏所述表型的细胞的分离可以如本文关于本发明的其它方面所述进行。
[0098]
与没有所述表型的t细胞相比，具有所述表型的肿瘤反应性t细胞可以在患者体内提供增加的自我更新、扩增、持久性和抗肿瘤应答中的一种或多种。因此，预期修饰肿瘤反应性t细胞以具有所述表型也可提供t细胞群体，其在患者体内提供这些优点中的任何一种或多种。本发明方法的这种实施方案的说明性实例通过图17的项1a、2a和2b的集合显示。
[0099]
因此，本发明的一个实施方案提供了获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括从患者的肿瘤样品中获得大量的t细胞群体，以及从肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞。从患者的肿瘤样品中获得大量的t细胞群体以及从肿瘤样品中分离肿瘤反应
性t细胞可以如本文关于本发明的其它方面所述进行。
[0100]
所述方法还可以包括修饰分离的肿瘤反应性t细胞以提供包含标志物cd39-和cd69-的表型，从而获得富含具有表型的t细胞的细胞群体。修饰分离的肿瘤反应性t细胞以提供cd39-cd69-表型可以以本领域已知的任何合适的方式进行。例如，可以用cd39抑制剂和cd69抑制剂处理分离的肿瘤反应性t细胞。
[0101]
在本发明的一个实施方案中，cd39抑制剂是抑制cd39mrna和cd39蛋白中的一种或两种的表达的任何合适的试剂。cd39抑制剂可以是长度至少约10个核苷酸的核酸，其特异性地结合并互补于编码cd39 mrna和cd39蛋白中的一种或两种的靶核酸或其互补物。可以将cd39抑制剂引入分离的肿瘤反应性t细胞中，其中所述细胞能够在足以分别干扰cd39和cd39蛋白中的一种或两种的表达的时间和条件下以有效量表达cd39和cd39蛋白中的一种或两种。
[0102]
在本发明的一个实施方案中，cd69抑制剂是抑制cd69mrna和cd69蛋白中的一种或两种的表达的任何合适的试剂。cd69抑制剂可以是长度至少约10个核苷酸的核酸，其特异性地结合并互补于编码cd69 mrna和cd69蛋白中的一种或两种的靶核酸或其互补物。可以将cd69抑制剂引入分离的肿瘤反应性t细胞中，其中所述细胞能够在足以分别干扰cd69 mrna和cd69蛋白中的一种或两种的表达的时间和条件下以有效量表达cd69 mrna和cd69蛋白中的一种或两种。
[0103]
在本发明的一个实施方案中，cd39抑制剂和cd69抑制剂中的一种或两种可以是分别抑制cd39或cd69表达的人工工程化的核酸酶。例如，可以使用基因组编辑技术抑制分离的肿瘤反应性t细胞中cd39和cd69表达中的一种或两种。基因组编辑技术可以通过使用人工工程化的核酸酶在基因组中插入、替换或去除dna来改变靶细胞中的基因表达。这种核酸酶的实例可以包括锌指核酸酶(zfn)(gommans等人,j.mol.biol.,354(3):507-519(2005))、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)(zhang等人,nature biotechnol.,29:149-153(2011))、crispr/cas系统(cheng等人,cell res.,23:1163-71(2013))和工程化的兆核酸酶(riviere等人,gene ther.,21(5):529-32(2014))。核酸酶在基因组中的靶向位置产生特异性双链断裂(dsb)，并使用细胞中的内源性机制通过同源重组(hr)和非同源末端连接(nhej)来修复诱导的断裂。这种技术可用于实现分离的肿瘤反应性t细胞中cd39和cd69中的一种或两种的抑制。因此，在本发明的一个实施方案中，cd39抑制剂和cd69抑制剂中的一种或两种是crispr-cas试剂、锌指试剂或talen试剂。talen试剂可以包含转录激活因子样效应物(tale)，其结合cd39或cd69基因和talen。锌指试剂可包含结合cd39或cd69基因的锌指核酸酶。
[0104]
在本发明的一个实施方案中，所述方法使用crispr/cas系统。因此，本发明的方法可以包括将编码cas内切核酸酶的核酸和编码单向导rna(sgrna)分子的核酸引入分离的肿瘤反应性t细胞中，其中sgrna与分离的肿瘤反应性t细胞中的cd39或cd69基因杂交，并且在sgrna与cas内切核酸酶之间形成复合物，使得cas内切核酸酶在cd39或cd69基因中引入双链断裂。cas内切核酸酶的非限制性实例包括casl b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csnl和csxl2)、caslo、csyl、csy2、csy3、csel、cse2、cscl、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmrl、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csbl、csb2、csb3和csxl7。优选地，cas内切核酸酶是cas9。优选地，sgrna与cd39或cd69基因特异性地杂交，使得sgrna
分别与cd39或cd69基因杂交，并且分别不与不是cd39或cd69基因的任何其它基因杂交。因此，在本发明的一个实施方案中，cd39抑制剂和cd69抑制剂中的一种或两种可以是crispr-cas试剂。crispr-cas试剂可包含进入分离的肿瘤反应性t细胞的编码cas内切核酸酶的核酸和编码单向导rna(sgrna)分子的核酸，其中sgrna与分离的肿瘤反应性t细胞中的cd39或cd69基因杂交。
[0105]
所述方法还可以包括分别缺失cd39基因和cd69基因中的一种或两种的全部或部分以降低cd39基因和cd69基因中的一种或两种的表达。cd39基因和cd69基因中的一种或两种的表达可降低任何量，例如降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。优选地，cd39基因和cd69基因中的一种或两种的表达降低，使得分别不存在cd39基因和cd69基因中的一种或两种的可检测表达。
[0106]
在一些实施方案中，使用rna干扰(rnai)。在这方面，cd39抑制剂和cd69抑制剂中的一种或两种可以包含rnai试剂。在一个实施方案中，rnai试剂可以包含小干扰rna(sirna)、短发夹mirna(shmir)、microrna(mirna)或反义核酸。
[0107]
sgrna或rnai试剂，例如sirna、shrna、mirna和/或反义核酸可包含突出端。也就是说，不是所有的核苷酸都需要结合靶序列。所用的sgrna或rnai核酸的长度可以是至少约19、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180、至少约200、至少约220、至少约240、约19至约250、约40至约240、约60至约220、约80至约200、约60至约180、约80至约160和/或约100至约140个核苷酸。
[0108]
sgrna或rnai试剂，例如sirna或shrna，可以由包含在盒，例如，较大的核酸构建体，如适当的载体中的核苷酸序列编码。这种载体的实例包括慢病毒和腺病毒载体以及本文关于本发明的其它方面所述的其它载体。合适载体的实例描述在aagaard等人,mol.ther.,15(5):938-45(2007)中。当作为较大核酸构建体的一部分存在时，所得核酸可以比包含的sgrna或rnai核酸长，例如长度大于约70个核苷酸。在一些实施方案中，所用的rnai试剂切割靶mrna。在其它实施方案中，所用的rnai试剂不切割靶mrna。
[0109]
可使用任何类型的合适sgrna、sirna、mirna和/或反义核酸。在一个实施方案中，反义核酸包含与编码cd39 mrna和cd39蛋白中的一种或两种的核酸或其互补物(或编码cd69 mrna和cd69蛋白中的一种或两种的核酸或其互补物)的至少约8个、至少约15个、至少约19个或约19至约22个核苷酸互补的核苷酸序列。在一个实施方案中，sirna可以包含例如反式作用sirna(tasirna)和/或重复相关的sirna(rasirna)。在另一个实施方案中，mirna可以包含例如短发夹mirna(shmir)。
[0110]
在本发明的一个实施方案中，cd39抑制剂和cd69抑制剂中的一种或两种可以在某种程度上，例如在dna、rna或其它调节水平抑制或下调编码蛋白的表达。在这方面，与缺乏cd39抑制剂的t细胞相比，包含cd39抑制剂的分离的肿瘤反应性t细胞不表达cd39 mrna和cd39蛋白中的一种或两种，或者表达较低水平的cd39 mrna和cd39蛋白中的一种或两种。类似地，与缺乏cd69抑制剂的t细胞相比，包含cd69抑制剂的分离的肿瘤反应性t细胞不表达cd69 mrna和cd69蛋白中的一种或两种，或者表达较低水平的cd69 mrna和cd69蛋白中的一种或两种。根据本发明的一个实施方案，cd39抑制剂或cd69抑制剂可以分别靶向cd39基因或cd69基因的核苷酸序列或者由其编码的mrna。表1中列出了人cd39和cd69序列的实例。根据本发明可以使用其它cd39和cd69序列。人和小鼠反义核酸是可商购获得的(例如，来自
origene technologies,inc.,rockville,md或sigma-aldrich,st.louis,mo)，并且可以使用编码本文公开的cd39和cd69蛋白的核酸序列和常规技术制备。表1表1
[0111]
根据本发明的一个实施方案，cd39抑制剂和cd69抑制剂可以分别靶向选自5’非翻译区(5’utr)、3’非翻译区(3’utr)以及cd39和cd69的编码序列的核苷酸序列，它们的互补物以及它们的任意组合。可以使用任何合适的cd39或cd69靶序列。在本发明的一个实施方案中，cd39抑制剂的序列可以针对具有seq id no:1的序列的人cd39设计，但也可以识别seq id no:3的序列(反之亦然)。在本发明的一个实施方案中，cd39抑制剂的序列可以针对表1中列出的7个cd39核苷酸序列中的任一个进行设计，但也识别表1中列出的其它6个核苷酸序列中的任一个或多个。cd39和cd69抑制剂可以分别针对任何适当的cd39或cd69 dna或mrna序列进行设计。
[0112]
在本发明的另一个实施方案中，cd39抑制剂和cd69抑制剂中的一种或两种是分别在表观遗传上抑制cd39或cd69表达的试剂。基因表达的表观遗传修饰涉及基因表达的改变，其不涉及潜在dna序列的改变。表观遗传修饰涉及表型的改变，而基因型没有改变，这继而影响细胞如何读取基因。
[0113]
当然，本发明的方法可以使用两种或更多种cd39抑制剂，它们中的任一种可以彼此相同或不同。同样地，本发明的方法可以使用两种或更多种cd69抑制剂，它们中的任一种可以彼此相同或不同。
[0114]
可选地或另外，可以通过修饰分离的肿瘤反应性t细胞以诱导和/或抑制多种标志物中的一种或多种的表达而在分离的肿瘤反应性t细胞中诱导cd39-cd69-表型。在这方面，本发明的一个实施方案提供了制备富含具有cd3
+
cd39-cd69-表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括从患者的肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞。从患者的肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞可以如本文关于本发明的其它方面所述进行。
[0115]
所述方法还可以包括修饰分离的肿瘤反应性t细胞以(i)诱导一种或多种以下标
志物的表达：ahnak
+
、al592183.1
+
、anxa1
+
、anxa4
+
、aqp3
+
、atm
+
、bin1
+
、c10orf54
+
、c11orf21
+
、c16orf54
+
、ccdc109b
+
、cd27
+
、cd52
+
、cd55
+
、cd8b
+
、cdc25b
+
、cdc42se1
+
、clec2b
+
、clic3
+
、cluap1
+
、crbn
+
、ctd-3184a7.4
+
、ddi2
+
、dnd1
+
、emp3
+
、epb41
+
、ern1
+
、faim3
+
、fam65b
+
、fbxl8
+
、fgfbp2
+
、gadd45b
+
、gimap4
+
、gimap7
+
、gpr155
+
、gzmm
+
、hsd17b11
+
、il10ra
+
、il7r
+
、isg20
+
、kansl1-as1
+
、klf2
+
、klhl24
+
、ldlrap1
+
、lef1
+
、lgals3
+
、linc00861
+
、litaf
+
、lyar
+
、mapkapk5-as1
+
、med15
+
、miat
+
、mir142
+
、mxi1
+
、myc
+
、neat1
+
、nosip
+
、odf2l
+
、p2ry8
+
、pde6g
+
、pik3ip1
+
、plec
+
、plp2
+
、ppp2r5c
+
、pxn
+
、r3hdm4
+
、ramp1
+
、rasa3
+
、rasgrp2
+
、rcbtb2
+
、rnaset2
+
、rp11-395b7.4
+
、rp11-539l10.2
+
、rp11-640m9.1
+
、s100a10
+
、s100a4
+
、s100a6
+
、s1pr1
+
、s1pr4
+
、samd3
+
、sell
+
、sh3bp5
+
、sigirr
+
、slamf6
+
、slco3a1
+
、sorl1
+
、stk38
+
、synj2
+
、tcf7
+
、timp1
+
、tradd
+
、tsc22d3
+
、tspan32
+
、txnip
+
、ubxn11
+
、vcl
+
、vnn2
+
、ypel3
+
、zfp36l2
+
、znf276
+
和znf683
+
和/或(ii)抑制一种或多种以下标志物的表达：acot7
+
、adam19
+
、agpat9
+
、agtrap
+
、aif1
+
、aspm
+
、atad2
+
、aurka
+
、aurkb
+
、birc3
+
、birc5
+
、brca1
+
、c15orf48
+
、casc5
+
、ccl3
+
、ccna2
+
、ccnb1
+
、ccnb2
+
、ccnd2
+
、cd38
+
、cd40lg
+
、cd69
+
、cd8b
+
、cdc20
+
、cdca3
+
、cdca8
+
、cdk1
+
、cdkn3
+
、cdt1
+
、cenpa
+
、cenpe
+
、cenpf
+
、cenpm
+
、cenpw
+
、cep55
+
、cish
+
、cks1b
+
、cks2
+
、clspn
+
、crtam
+
、csf2
+
、dlgap5
+
、dusp5
+
、dusp6
+
、dut
+
、egr1
+
、entpd1
+
、fen1
+
、gins2
+
、gtse1
+
、h2afx
+
、hist1h4c
+
、hla
+
dqa2
+
、hmmr
+
、ifi27
+
、ifng
+
、il2ra
+
、il5
+
、kiaa0101
+
、kif11
+
、kif23
+
、kpna2
+
、krt7
+
、mad2l1
+
、mcm7
+
、mki67
+
、mx1
+
、mybl2
+
、ncapg
+
、ndc80
+
、ndfip2
+
、nudt1
+
、nusap1
+
、orc6
+
、pbk
+
、pcna
+
、plk1
+
、rpl39l
+
、rrm2
+
、sgol2
+
、shcbp1
+
、smc2
+
、spc25
+
、stmn1
+
、tesc
+
、tk1
+
、tnf
+
、tnfrsf18
+
、tnfsf10
+
、top2a
+
、tpm4
+
、tpx2
+
、tuba1b
+
、tuba1c
+
、tubb
+
、tyms
+
、ube2c
+
、ube2s
+
、ube2t
+
、xcl1
+
和zwint
+
，其中(i)中的诱导一种或多种标志物的表达和/或(ii)中的抑制一种或多种标志物的表达诱导t细胞具有cd3
+
cd39-cd69-表型。在本发明的一个实施方案中，所述方法还可以包括修饰分离的肿瘤反应性t细胞以诱导本段的(i)中列出的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100种标志物的表达。在本发明的一个实施方案中，所述方法还可以包括修饰分离的肿瘤反应性t细胞以诱导本段的(i)中列出的所有标志物的表达。在本发明的一个实施方案中，所述方法还可以包括修饰分离的肿瘤反应性t细胞以抑制本段的(i)中列出的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100种标志物的表达。在本发明的一个实施方案中，所述方法还可以包括修饰分离的肿瘤反应性t细胞以抑制本段的(ii)中列出的所有标志物。诱导和抑制一种或多种标志物的表达可以以本领域已知的多种方式中的任一种进行。例如，本文关于本发明的其它方面所述的基因组编辑技术可用于诱导和/或抑制一种或多种标志物在分离的肿瘤反应性t细胞中的表达。在本发明的另一个实施方案中，可以修饰(例如，电穿孔、转导或转染)分离的肿瘤反应性t细胞以包含编码一种或多种标志物的核酸。可以在重组表达载体中携带编码一种或多种标志物的核酸。
[0116]
在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括在细胞表达外源性tcr的条件下，将编码外源性tcr的核酸引入富含具有表型的t细胞的细胞群体中的细胞。“外源性”意指tcr不是t细胞天然的(天然存在于t细胞上)。外源性tcr可以是重组tcr。重组tcr是通过重组表达一种或多种外源性tcrα、β、γ和/或δ链编码的基因而产生的tcr。重组tcr可以包含完全衍生自单一哺乳动物物种的多肽链，或者重组tcr可为由衍生自两种不同哺乳动物物种的tcr的氨基酸序列组成的嵌合或杂合tcr。例如，抗原特异性tcr可以包含衍生自鼠tcr的可变区和人tcr的恒定区，使得tcr是“人源化的”。对癌抗原(例如新抗原)具有抗原特异性的任何外源性tcr可用于本发明的方法中。tcr通常包含两条多肽(即多肽链)，如tcr的α链、tcr的β链、tcr的γ链、tcr的δ链或以上的组合。tcr的这种多肽链是本领域已知的。癌抗原特异性tcr可包含任何氨基酸序列，条件是tcr能够特异性结合并免疫识别癌抗原或其表位。可用于本发明方法的外源性tcr的实例包括但不限于例如美国专利7,820,174、7,915,036、8,088,379、8,216,565、8,431,690、8,613,932、8,785,601、9,128,080、9,345,748、9,487,573、9,879,065和美国专利申请公开号2013/0116167和2014/0378389中所公开的那些，其各自通过引用并入本文。
[0117]
在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括在细胞表达car的条件下，将编码嵌合抗原受体(car)的核酸引入富含具有表型的t细胞的群体中的细胞。通常，car包含与tcr的跨膜和细胞内结构域融合的抗体的抗原结合结构域，例如单链可变片段(scfv)。因此，car的抗原特异性可以由特异性结合癌抗原或其表位的scfv编码。对癌抗原具有抗原特异性的任何car可用于本发明的方法中。可用于本发明方法的car的实例包括但不限于例如美国专利8,465,743、9,266,960、9,765,342、9,359,447、9,765,342、9,868,774、10,072,078和10,287,350中公开的那些，其各自通过引用并入本文。
[0118]
本文所用的术语“癌抗原”是指仅由或主要由肿瘤细胞或癌细胞表达或过度表达，使得抗原与肿瘤或癌症相关的任何分子(例如蛋白质、多肽、肽、脂质、碳水化合物等)。癌抗原可以另外由正常非肿瘤或非癌细胞表达。然而，在这种情况下，正常非肿瘤或非癌细胞的癌抗原的表达不如肿瘤或癌细胞的表达稳健。在这方面，与正常非肿瘤或非癌细胞的抗原的表达相比，肿瘤或癌细胞可以过表达抗原或以显著更高的水平表达抗原。此外，癌抗原可以另外由不同发育或成熟状态的细胞表达。例如，癌抗原可以另外由胚胎或胎儿期的细胞表达，这些细胞通常在成年宿主中不存在。可选地，癌抗原可以另外由干细胞或前体细胞表达，这些细胞通常在成年宿主中不存在。癌抗原的实例包括但不限于间皮素、cd19、cd22、cd30、cd70、cd276(b7h3)、gp100、mart-1、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、血管内皮生长因子受体2(vegfr-2)、trp-1、trp-2、酪氨酸酶、人乳头瘤病毒(hpv)16e6、hpv 16e7、ny-br-1、ny-eso-1(also known as cag-3)、ssx-2、ssx-3、ssx-4、ssx-5、ssx-9、ssx-10、mage-a1、mage-a2、brca、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、mage-a12、her-2等。在本发明的一个实施方案中，癌抗原可以是突变抗原，其由肿瘤或癌细胞表达或过表达，并且不由正常非肿瘤或非癌细胞表达。这种癌抗原的实例可以包括但不限于突变的kras和突变的p53。对癌抗原具有抗原特异性的t细胞可以有利地降低或避免与正常组织的交叉反应性，诸如例如，使用对次要组织相容性抗原具有抗原特异性的t细胞可以发生所述交叉反应性。在本发明的一个实施方案中，癌抗原是新抗原。
[0119]
癌抗原可以是由任何癌症或肿瘤(包括本文所述的癌症和肿瘤)的任何细胞表达的抗原。癌抗原可以是仅一种类型的癌症或肿瘤的癌抗原，使得所述癌抗原与仅一种类型的癌症或肿瘤相关或者具有仅一种类型的癌症或肿瘤的特性。可选地，癌抗原可以是一种以上类型的癌症或肿瘤的癌抗原(例如，可以具有一种以上类型的癌症或肿瘤的特性)。例如，癌抗原可以由乳腺癌细胞和前列腺癌细胞表达，而正常非肿瘤或非癌细胞则完全不表达。
[0120]
也可以用编码外源性(例如，重组的)tcr或其它重组受体的一种或多种核酸转化，例如转导或转染富含具有包含内源性癌抗原特异性tcr(例如，癌症新抗原特异性tcr)的表型的t细胞的细胞群体。这种外源性受体，例如tcr，可以赋予转化的t细胞对除内源性tcr天然特异性抗原以外的另外抗原的特异性。这可以但不一定导致产生具有双重抗原特异性的t细胞。
[0121]
在本发明的一个实施方案中，将编码外源性tcr或car的核酸引入任何合适的重组表达载体中。出于本文的目的，术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mrna、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列并且载体在足以使mrna、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，所述构建体允许宿主细胞表达mrna、蛋白质、多肽或肽。本发明的载体整体上不是天然存在的。然而，部分载体可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于dna和rna，其可以是单链或双链的，合成的或部分获自天然来源，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间连键或者两种类型的连键。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连键不会阻碍载体的转录或复制。可用于本发明方法的重组表达载体的实例包括但不限于质粒，病毒载体(逆转录病毒载体、γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体)和转座子。然后可以通过任何合适的技术，诸如例如基因编辑、转染、转化或转导，如例如green and sambrook,molecular cloning:a laboratory manual(4
th ed.),cold spring harbor laboratory press(2012)中所述的，将载体依次引入分离的t细胞群体中。许多转染技术是本领域已知的，并且包括，例如，磷酸钙dna共沉淀、deae-葡聚糖、电穿孔、阳离子脂质体介导的转染、钨颗粒促进的微粒轰击、磷酸锶dna共沉淀。噬菌体或病毒载体可以在合适的包装细胞中生长感染性颗粒之后引入宿主细胞中，其中许多包装细胞是可商购获得的。
[0122]
在本发明的一个实施方案中，本文所述的本发明方法中的任一种还包括扩增通过所述方法获得的富含具有表型的t细胞的群体中的细胞数目。t细胞数目的扩增可通过本领域已知的许多方法中的任一种来实现，所述方法如例如美国专利8,034,334；美国专利8,383,099；美国专利申请公开号2012/0244133；dudley等人,j.immunother.,26:332-42(2003)以及riddell等人,j.immunol.methods,128:189-201(1990)中所述。在一个实施方案中，通过用一种或多种非特异性t细胞刺激物和一种或多种细胞因子培养t细胞来进行t细胞数目的扩增。非特异性t细胞刺激物的实例包括但不限于辐照的同种异体饲养细胞、辐照的自体饲养细胞、抗cd3抗体、抗4-1bb抗体和抗cd28抗体中的一种或多种。在优选的实施方案中，非特异性t细胞刺激物可以是与珠粒缀合的抗cd3抗体和抗cd28抗体。任何一种或多种细胞因子可以用于本发明的方法中。可用于扩增细胞数目的示例性细胞因子包括白介素(il)-2、il-7、il-21和il-15。在一个实施方案中，通过将t细胞与okt3抗体、il-2和饲养
pbmc(例如，辐照的同种异体pbmc)一起培养来进行t细胞数目的扩增。
[0123]
本发明的一个实施方案还提供了根据本发明方法中的任一种获得的分离的或纯化的细胞群体。通过本发明方法产生的富含具有表型的t细胞的细胞群体可以提供多种优点中的任何一种或多种。与cd39
+
cd69
+
t细胞相比，通过本发明方法产生的富含具有cd39-cd69-表型的t细胞的细胞群体可以在患者体内提供增加的自我更新、扩增、持久性和抗肿瘤应答中的一种或多种。
[0124]
本文所用的术语“分离的”意指已经从其天然环境中移除。如本文所用，术语“纯化的”意指纯度增加，其中“纯度”是相对术语，并且不一定解释为绝对纯度。例如，纯度可以是至少约50％，可以是大于约60％，约70％或约80％，约90％或可以是约100％。
[0125]
通过本发明方法产生的富含具有表型的t细胞的细胞群体可以是基本上同质的群体，其中该群主要包括通过本文所述的本发明方法中的任一种产生的t细胞。通过本发明方法产生的富含具有表型的t细胞的细胞群体也可以是细胞的克隆群体，其中群体的所有细胞都是单一t细胞的克隆。在本发明的一个实施方案中，细胞群体是包含t细胞的克隆群体，所述t细胞包含编码本文所述的外源性tcr或car的重组表达载体。
[0126]
预期通过本文所述的本发明方法中的任一种制备的富含具有表型的t细胞的细胞群体可以包含在组合物，如药物组合物中。在这方面，本发明的实施方案提供了获得药物组合物的方法，所述药物组合物包含富含具有表型的t细胞的细胞群体，所述方法包括根据本文所述的本发明方法中的任一种获得富含具有表型的t细胞的细胞群体；以及将富含具有表型的t细胞的细胞群体与药学上可接受的载体组合以获得包含富含具有表型的t细胞的细胞群体的药物组合物。
[0127]
优选地，载体是药学上可接受的载体。关于药物组合物，载体可以是常规用于施用细胞的那些载体中的任一种。这种药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的并且容易为公众所获得。优选药学上可接受的载体是在使用条件下没有有害副作用或毒性的载体。
[0128]
载体的选择可以部分地通过用于施用富含具有表型的t细胞的细胞群体的特定方法来确定。因此，本发明的药物组合物有多种合适的制剂。合适的制剂可以包括用于肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、瘤内或腹膜内施用的那些制剂中的任一种。一种以上的途径可以用于施用富含具有表型的t细胞的细胞群体，并且在某些情况下，特定的途径可以提供比另一种途径更立即和更有效的应答。
[0129]
优选地，富含具有表型的t细胞的细胞群体通过注射，例如静脉内施用。用于注射的细胞的合适的药学上可接受的载体可以包括任何等渗载体，诸如例如生理盐水(约0.90％w/v的nacl水溶液、约300mosm/l nacl水溶液或约9.0g nacl/升水)，normosol r电解质溶液(abbott,chicago,il)，plasma-lyte a(baxter,deerfield,il)，约5％葡聚糖水溶液或林格氏乳酸盐。在一个实施方案中，药学上可接受的载体补充有人血清蛋白。
[0130]
出于本发明的目的，施用的剂量，例如t细胞的数目应该足以在合理的时间范围内在哺乳动物中实现例如治疗或预防应答。例如，所施用的t细胞数目应在从施用时间起约2小时或更长，例如12至24小时或更长的时间内足以结合癌抗原，或者治疗或预防癌症。在某些实施方案中，该时间段甚至可以更长。所施用的t细胞数目将通过例如待施用的特定t细胞群体的功效和哺乳动物(例如人)的状况以及待治疗的哺乳动物(例如人)的体重来确定。
[0131]
用于确定所施用的t细胞数目的许多测定是本领域已知的。出于本发明的目的，可
以使用以下测定来确定向哺乳动物施用的起始数目：其包括在各自给予不同数目的t细胞的一组哺乳动物中，比较向哺乳动物施用给定数目的这种t细胞时靶细胞裂解的程度或一种或多种细胞因子，诸如例如ifn-γ和il-2分泌的程度。通过本领域已知的方法可以测定在施用一定数目后靶细胞裂解或细胞因子诸如例如ifn-β和il-2分泌的程度。细胞因子诸如例如il-2的分泌也可以提供t细胞制剂的质量(例如表型和/或有效性)的指示。
[0132]
所施用的t细胞数目也将由可能伴随特定t细胞群体的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。通常，主治医师将考虑各种因素，如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、施用途径和所治疗病症的严重程度，决定治疗每个个体患者的t细胞的数目。作为实例，但并不旨在限制本发明，待施用的t细胞的数目可以是每次输注约10x 106个至约10x 10
11
个细胞，每次输注约10x 109个至约10x 10
11
个细胞或每次输注约10x 107个至约10x 109个细胞。
[0133]
预期根据本发明的方法产生的富含具有表型的t细胞的细胞群体可用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法中。在这方面，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物中癌症的量向哺乳动物施用本文所述的任何药物组合物或t细胞群体。
[0134]
本发明的一个实施方案还包括在施用t细胞之前对哺乳动物进行淋巴清除。淋巴清除的实例包括但不限于非清髓性淋巴清除化疗、清髓性淋巴清除化疗、全身照射等。
[0135]
本文所用的术语“治疗”和“预防”以及由其衍生的词语不一定意味着100％或完全的治疗或预防。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在的益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。在这方面，本发明的方法可以提供任何量的任何水平的哺乳动物中的癌症的治疗或预防。此外，由本发明方法提供的治疗或预防可以包括所治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或多种状况或症状的治疗或预防。另外，出于本文的目的，“预防”可以涵盖延迟疾病或其症状或状况的发作或复发。
[0136]
出于本发明方法(其中施用了t细胞群体)的目的，t细胞可以是哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。
[0137]
关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症，包括白血病(例如，b细胞白血病)、肉瘤(例如，滑膜肉瘤、成骨肉瘤、子宫平滑肌肉瘤和肺泡状横纹肌肉瘤)、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、肝细胞癌、胶质瘤、头颈癌、急性淋巴细胞癌，急性髓样白血病、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞癌、结肠癌症(例如结肠癌)、食道癌、宫颈癌、胃肠类癌瘤、下咽癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和膀胱癌中的任一种。
[0138]
本文所述的cd39-cd69-t细胞表型可用于为癌症患者选择疗法。因此，本发明的实施方案提供了为癌症患者选择疗法的方法。所述方法可以包括从患者的肿瘤样品中获得大量的t细胞群体。如本文关于本发明的其它方面所述，可以从肿瘤样品中获得大量的t细胞群体。
[0139]
所述方法还可以包括测量大量群体中具有表型的t细胞的比例，其中所述表型包
括标志物cd3
+
、cd39-和cd69-；以及将具有所述表型的t细胞的比例与对照进行比较。可选地或另外，所述方法还可以包括测量所述大量群体中缺乏表型的t细胞的比例，其中所述表型包括标志物cd3
+
、cd39-和cd69-；以及将缺乏所述表型的t细胞的比例与对照进行比较。对照可以是例如已经进行的研究的结果，以确定在特定群组，例如特定癌症类型中向对act的应答者或无应答者施用的输注产物中具有(或缺乏)所述表型的t细胞的比例。例如，如图1e所示，大于10％(总群体中具有表型的t细胞)的中值可以被定义为针对黑色素瘤而言对act(在完全应答者中发现)的潜在应答的预后。如图5a-5c所示，可以以》80％的精确度对患者输液产品进行分类。可以使用本领域已知的任何合适的方法，例如流式细胞术测量大量群体中具有表型的t细胞的比例。
[0140]
所述方法还可以包括当(i)具有表型的t细胞的比例低于对照或(ii)缺乏表型的t细胞的比例等于或高于对照时，选择所述患者进行不是免疫疗法的疗法；或者(e)当(i)具有表型的t细胞的比例等于或高于对照或(ii)缺乏表型的t细胞的比例低于对照时，选择所述患者进行免疫疗法。
[0141]
本发明的另一个实施方案提供了治疗患者中癌症的方法。所述方法可以包括接收为癌症患者所选择的疗法的鉴定，其中所述疗法已经通过本文关于本发明的其它方面所述的任何方法来选择。所述方法还可以包括(i)当(i)具有表型的t细胞的比例低于对照或(ii)缺乏表型的t细胞的比例等于或高于所述对照时，通过以有效治疗患者中癌症的量向所述患者施用不是免疫疗法的疗法来治疗所述患者；或者(ii)当(i)具有表型的t细胞的比例等于或高于对照或(ii)缺乏表型的t细胞的比例低于对照时，通过以有效治疗患者中癌症的量向所述患者施用免疫疗法来治疗所述患者。对照可以如本文关于本发明的其它方面所述。
[0142]
免疫疗法涵盖通过激活或阻抑免疫系统来治疗癌症。免疫疗法的实例包括但不限于nk细胞疗法、t细胞疗法、b细胞疗法、免疫检查点阻断疗法、嵌合抗原受体(car)疗法、抗体疗法、免疫系统调节剂疗法、抗癌疫苗疗法或以上的任何组合。在本发明的一个实施方案中，免疫疗法是act、免疫检查点阻断疗法、免疫系统调节剂疗法、t细胞疗法和/或car疗法。
[0143]
不是免疫疗法的疗法的实例包括但不限于手术切除、化疗、放疗、干细胞疗法、激素疗法、靶向药物抑制剂疗法或以上的任何组合。
[0144]
本发明的另一个实施方案提供了预测癌症患者对免疫疗法的临床应答的方法。所述方法可以包括从癌症患者的肿瘤样品中获得大量的t细胞群体。如本文关于本发明的其它方面所述，可以从肿瘤样品中获得大量的t细胞群体。所述方法还可以包括测量大量群体中(i)具有或(ii)缺乏表型的t细胞的比例，其中所述表型包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-，其可以如本文关于本发明的其它方面所述进行。
[0145]
所述方法还可以包括将(i)具有或(ii)缺乏表型的t细胞的比例与对照进行比较。所述方法还可以包括当(i)具有表型的t细胞的比例低于对照或(ii)缺乏表型的t细胞的比例等于或高于对照时，将患者鉴定为可能对免疫疗法具有阴性临床应答。相反，所述方法可以包括当(i)具有表型的t细胞的比例等于或高于对照或(ii)缺乏表型的t细胞的比例低于对照时，将患者鉴定为可能对免疫疗法具有阳性临床应答。对照可以如本文关于本发明的其它方面所述。
[0146]
预测癌症患者对免疫疗法的临床应答的方法可以在向患者施用免疫疗法之前、在
向患者施用免疫疗法之后，或在向患者施用免疫疗法之前和在向患者施用免疫疗法之后进行。
[0147]
以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例
[0148]
在实施例1-5中描述的实验中使用以下材料和方法。til的产生
[0149]
手术切除转移性黑色素瘤肿瘤沉积物，并如先前所述(tran等人,j.immunother.,31:742
–
751(2008)；dudley等人,j.immunother.,26:332
–
342(2003))通过酶消化产生的单细胞悬液或2-3mm3肿瘤碎块的平板培养处理用于肿瘤浸润性淋巴细胞的生成。如先前所述(jin等人,j.immunother.,35:283
–
292(2012))，通过在含有辐照的pbmc、抗cd3抗体和il-2的培养物中快速扩增淋巴细胞来产生临床输注产物。临床方案
[0150]
所有患者都登记在由国家癌症研究所nih的机构研究委员会批准的以下实验性til和il-2act方案(nct00001832、nct00513604、nct01319565、nct01468818、nct01585415或nct01993719)之一(goff等人,j.clin.oncol.,34:2389
–
2397(2016)；dudley等人,clin.cancer res.,16:6122
–
6131(2010))。获得知情同意书，并根据赫尔辛基宣言中提出的原则进行记录。要求患者为18岁以上，具有可测量的转移性黑色素瘤，具有良好的性能状态，没有全身性感染，没有接受先前的抗pd-1靶向治疗，并且有资格接受高剂量il-2治疗。另外，对于nct01319565，要求患者有资格接受全身照射(tbi)。方案治疗由环磷酰胺和氟达拉滨的非清髓化疗方案组成，然后是单次输注自体til和高剂量il-2以耐受。一个亚组的患者在细胞输注之前在化疗期间接受tbi。进行基线横断面成像，并使用实体瘤中的应答评价标准(recist)1.0以周期性间隔评价疾病的程度。结果分为完全应答(cr)、部分应答(pr)或进行性疾病(nr)。研究群组描述
[0151]
根据临床应答和样本可用性从临床方案中抽取患者样品。为了排除影响cd8 til分化状态的先前免疫疗法的影响，排除已经接受先前抗pd-1免疫疗法或基因工程化t细胞或tcr疗法的患者。不排除接受先前抗ctla-4疗法的患者。对于本研究，完全应答者(cr)被定义为根据recist 1.0标准经历完全应答的任何患者。在act后疾病进展的患者(nr，无应答者)中，为了集中于til显示完全缺乏抗肿瘤功效的那些患者，并排除肿瘤固有的治疗失败(如由于治疗引起的获得性抗性)，无应答者被严格确定为act后任何时间靶病变经历不超过10％减少的进行性疾病的患者亚组。因此，这些标准从本研究中排除了疾病稳定的患者和部分应答者，产生了可用于分析的54名具有活的til输注产物样品的患者。分析中使用的临床终点是无进展生存期(pfs)或黑色素瘤特异性生存期(mss)，其被定义为从治疗开始到事件时间的时间长度(黑色素瘤、归因于黑色素瘤的死亡或censor)。质谱流式技术染色
[0152]
将冷冻的患者act输注产物样品在温的培养基中解冻，在不含任何细胞因子的含有dna酶的til培养基(含有10％人血清、l-谷氨酰胺和anti-anti的rpmi)中静置过夜。除非另有说明，所有试剂均来自fluidigm。将细胞首先与含5μm顺铂的pbs溶液一起孵育以标记
死细胞。然后将细胞洗涤并重悬于maxpar细胞染色缓冲液(mcsb)(fluidigm,south san francisco,ca)中。将人fc受体阻断溶液(biolegend,san diego,ca)加入到每个样品中，并在室温下孵育10分钟。所有金属标记的抗体均购自fluidigm。用qdot-链霉亲和素缀合物(thermo fisher scientific,waltham,ma)检测生物素抗人cd39(biolegend)。将抗体在mcsb中稀释至验证最小通道溢出的浓度，加入到每个样品中，并在室温下孵育30分钟，第一染色由抗cd39组成，以及第二染色由所有其它金属偶联的抗体+链霉亲和素(qdot-链霉亲和素缀合物)组成。在每次染色之后，用mcsb洗涤细胞两次。然后将细胞在含1.6％多聚甲醛(milliporesigma,burlington,ma)的pbs溶液中固定15分钟。通过将cell-id intercalator-ir加入到maxpar fix and perm buffer(fluidigm)中至125nm的最终浓度来制备细胞嵌入溶液。将细胞与细胞嵌入溶液在4℃下孵育过夜。然后将细胞用mcsb洗涤一次以及用maxpar water(fluidigm)洗涤两次。最后，将细胞以106个细胞/ml的细胞浓度重悬于含有eq four element calibration beads(fluidigm)的水溶液中，并在cytof数据采集之前立即过滤到细胞滤器盖管中。如先前所述(bendall等人,science.332:687
–
696(2011))，在helios mass cytometer(fluidigm)上获得数据。质谱流式数据的计算方法和统计分析
[0153]
用软件开发者推荐的normalizer算法(finck等人,cytometry a.,83:483
–
494(2013))对原始质谱流式数据进行标准化。使用定制的python脚本流水线(在github.com/immunodynamics/cytof-processing获得)分析数据。首先使用[eq4-顺铂-]和[cd45
+
dna(2n)]手动门将数据设门为活的单态细胞(图5a)。使用分层聚集学习(hal-x)进行基于表面标志物表达的分化群集的自动鉴定。定制编程算法(图5b)依赖于高密度区域的交叉验证鉴定，然后在鉴定22个具有不同表面标志物表达模式的白细胞群体的表面标志物的35维空间中进行快速随机森林分类。然后hal-x标记所有样品中的所有细胞并计算每个白细胞群体的反双曲正弦和标准化频率。支持向量机(svm)算法使用til特征来确定样品是否取自经历完全应答(cr)或进行性疾病(nr)的患者(图5c和表2)。表2显示了基于t细胞输注产物的表型(n＝1700次运行)对患者的临床结果进行分类的混淆矩阵。真阳性(tp)、真阴性(tn)、假阳性(fp)假阴性(fn)。随后的分析优先考虑了10个活化特征，其根据患者的临床结果对患者进行了最佳的svm分类。表2质谱流式群集可视化
[0154]
为了使从患者输注产物获得的480万个细胞的cytof数据可视化，使用了flowjo v10.5.3软件(ashland,or)。数据在活的dna
+
、顺铂-、cd45
+
细胞上进行设门，随后在cd3
+
细胞上进行设门以获得250万个连接的t细胞。在flowjo软件上将来自所有患者样品的连接的t细胞降采样到100,000个细胞，并且将门和样品id重新转移到降采样的群体中。使用barnes-hut近似插件在程序上利用以下参数进行降维和聚类：困惑度：90，学习速率(eta):200，迭代：1000，θ:0.5，并且在t-sne空间上可视化(van der maaten等人,machine learning,87:pp.33
–
55(2012))。使用flowjo软件上的自动设门功能定义群集。将每种标志
物的群集频率和蛋白质表达输出，进行z标度，并使用r v3.5.2统计环境(r.c.team,r:a language and environment for statistical computing.vienna,austria:r foundation for statistical computing(2014))进行分析。流式细胞术表型分析
[0155]
将冷冻的患者act i.p.样品解冻并静置过夜，在til培养基(含有10％人血清的rpm1)和dna酶中没有任何细胞因子。将i.p.细胞在染色缓冲液(1x pbs,0.5％ bsa,2mm edta)中洗涤一次并用以下抗体染色：抗cd3-apc-cy7、(sk7；1:25、bd biosciences、franklin lakes、nj)、抗cd8-pe-cy7(rpa-t8、1:300、bd biosciences)、抗cd4-bv785(okt4；1:66、biolegend、san diego、ca)、抗cd39-fitc(a1；1:200、biolegend)、抗cd69-apc(fn50；1:25、bd biosciences、franklin lakes、nj)、抗pd-1-af700(eh12.2h7；1:66、biolegend)、抗tim3-bv650(7d3；1:100、bd biosciences)、抗cd62l-bv421(dreg-56；1:50、biolegend)、抗slamf6-pe(hsf6.4.20、1:50、bd biosciences)、抗cd27-bv421(o323、1:50、biolegend)。将样品在冰上孵育30分钟，然后洗涤两次，并重悬在含有碘化丙啶的染色缓冲液中以排除死细胞。对于tcf7的细胞内染色。将i.p.til洗涤两次并根据制造商的说明使用true-nuclear transcription factor buffer set(biolegend)固定。将固定的和透性化的细胞洗涤一次，然后加入抗tcf7-pe抗体(1:50)保持20分钟，洗涤两次，然后用如上所述的cd3、cd8、cd39和cd69抗体进行染色。对于新抗原，四聚体表型分析样品首先用四聚体染色，然后加入上述抗体。在bd lsrfortessa细胞分析仪(bd biosciences)上获得样品并在flowjo v10.5.3软件上分析。在两个独立的生物学重复中获得每名患者的dn、dp、sp和单独标志物的频率，并且将中值％用于比较cr和nr。统计分析
[0156]
对于cytof可视群集比较，首先使用shapiro-wilk检验评估应答者和无应答者群集的正常性，然后通过wilcoxon秩和检验比较它们的频率。用邦费罗尼多重校正对p-值进行校正，并考虑α为0.05的统计显著性。使用双侧wilcoxon秩和检验以标准统计显著性水平*p《0.05**p《0.01***p《0.001****p《0.0001类似地分析cr与nr i.p.之间的所有流式细胞术比较。使用卡普兰一梅尔估计量(kaplan-meier estimator)进行存活分析(pfs和mss)。简而言之，通过调整用％的cd3
+
细胞输注的总报道细胞，然后计算cd3的cd8、dn和dp％，以估计每位患者输注的总cd8细胞、输注的总dn细胞和输注的dp细胞，首先计算在i.p.中输注的中值t细胞数目。中值用于使高细胞数目对比低细胞数分层(图1a-1i)，以及细胞数目的三分位数(图6a-6c)用于使针对每个群体输注的低细胞数目、中细胞数母和高细胞数目分层。mantel-cox对数秩检验用于确定具有计算的危险比(hr)的患者之间存活分布的统计显著性。使用配对的t检验比较dn对比dp标志物表达和祖先-子代群体，以及使用配对的wilcoxon检验进行多细胞因子比较。对于四聚体分析，所有新抗原特异性til表示为％的四聚体
+
以及使用针对用于多组比较的邦费罗尼校正调整的wilcoxon秩和检验进行cr对比nr亚组分析。对于差异基因表达分析，0.1的错误发现率(fdr)用于确定deg基因。由于scrna数据是非参数的，因此使用通过比较的总细胞数目校正的wilcoxon秩和检验进行所有cr与nr比较。
[0157]
用wilcoxon秩和检验进行患者中tcr cdr3s的比较。所有的统计分析在graphpad v7.05或在r统计计算环境v3.5.2(rproject.org)(r.c.team,r,同上)中进行。
新抗原鉴定
[0158]
肿瘤全外显子组测序(wes)：从新鲜肿瘤(frtu)中纯化基因组dna(gdna)，并根据制造商的建议，使用qiagen allprep dna/rna试剂盒(qiagen,venlo,netherlands)从自体单采样品中匹配正常的。全外显子组文库制备和测序由novogene(novogene corporation inc.,sacramento,ca)使用用于外显子组捕获的agilent sureselectxt2 human all exon v6 kit和以～200x中靶覆盖率用于配对末端的2
×
150bp测序的illumina平台进行。用于先前公开的患者肿瘤的另外wes由personal genome diagnostics,the broad institute和在surgery branch,nci对肿瘤组织和正常外周血细胞进行，如先前所述(parkhurst等人,cancer discov.,9:1022
–
1035(2019))。
[0159]
外显子组变体调用：使用来自novocraft的novoalign mpi对人类基因组构建hg19进行比对。用picard’s markduplicates工具标记重复数。根据gatk最佳实践工作流程进行indel重新排列和碱基重新校准。使用varscan2、somaticsniper、strelka和mutect调用变体。在变体调用后，使用gatk combinevariants工具合并vcf文件，并用annovar进行注释。保留调用变体的参数如下：肿瘤和正常覆盖率大于10，变体等位基因频率为7％或更高，变体读数计数为4或更高，以及四个调用者中的两个鉴定突变。
[0160]
rna-seq比对、加工和变体调用：使用star双通法对人基因组构建hg19进行比对。使用picard’s markduplicates工具标记和分选重复数。然后使用gatk splitntrim工具拆分和修整读数，之后如对全部外显子组数据进行的那样进行indel重新排列和碱基重新校准。使用最终的重新校准的bam文件创建一个pileup文件，并且仅使用varscan2调用变体。
[0161]
串联小基因筛选：将设计为25mer，以突变氨基酸为中心并且涵盖肿瘤突变的小基因连接成tmg(每名患者有10-12个tmg，每个tmg有15-20个小基因)，并在pcrna6sl质粒(genscript,nj)中合成，用于要在如前所述((robbins等人,nat.med.,19:747
–
752(2013)；parkhurst等人,cancer discov.,9:1022
–
1035(2019)；tran等人,science,344:641
–
645(2014)；zacharakis等人,nat.med.,24:724
–
730(2018))的新抗原鉴定中使用的体外rna转录(mmessage ivt kit,thermo fisher scientific)。简而言之，如先前所述(parkhurst等人,cancer discov.,9:1022
–
1035(2019)；zacharakis等人,nat.med.,24:724
–
730(2018))生成自体患者来源的未成熟树突细胞(dc)或cd40l激活的b细胞，并利用由患者的i类hla分子中的任一种加工和呈递的单独tmg rna(btx或lonza 4d)进行电穿孔。将患者i.p.或预输注的til解冻，在具有il-2的til培养基中静置过夜，然后在第二天与rna电穿孔的自体apc共培养，并经由如前所述(parkhurst等人,cancer discov.,9:1022
–
1035(2019))的elispot释放干扰素γ细胞因子和通过4-1bb表达的til活化来评价识别。一旦在初步筛选中获得tmg的阳性“击中”，使用fmoc内部化学来合成来自每个潜在tmg击中的预测的候选hla i类最小肽。在独立的反卷积实验(10μg/ml)中对自体apc进行肽脉冲以评价ifnγelispot和4-1bb til活化从而鉴定候选最小新表位。然后以hplc纯度(genscript,nj)重新合成潜在的最小肽，以进一步用于hla-限制性图谱(如下所述)和突变特异性。通过在自体apc上以不同浓度肽脉冲hplc级野生型和突变型肽，然后与til或tcr转导的细胞共培养进行突变特异性测试以确定突变型和野生型肽的滴定(图11a-11b)。
[0162]
hla限制性图谱：使用患者特异性hla i类等位基因进行cos7细胞的快速转染。将针对每个单独的hla等位基因(100ng/孔)和含有突变的新抗原的串联小基因(tmg)(50ng/
profiling kit(takara bio,shiga,japan,cat#634432)或takara smarter human sctcr a/b profiling kit
–
96(takara bio,usa)将四聚体
+
或tmg反应性til分选到板中。简而言之，将来自目的群体的单细胞分选到96孔板的孔中，并使用smart技术进行cdna合成和扩增以掺入细胞条形码。进一步扩增对应于tcrα和tcrβ转录物的cdna，并准备用于在illumina miseq仪器上测序。使用miseq reagent kit v3(600个循环)(illumina,san diego,ca,ms-102-3003)通过配对末端，2
×
300bp读段进行测序。通过mixcr包(milaboratory.com/software/mixcr/)测定读段提取和克隆性计数。两种方法都产生了tcr，其在pmsgv1载体中用鼠恒定tcr重建，其被转导到健康供体pbl中用于如上所述的野生型和突变型新表位的体外测试(pasetto等人,cancer immunol.res.,4:734
–
743(2016)；parkhurst等人,clin.cancer res.23:2491
–
2505(2017))。单细胞转录组分析
[0167]
单细胞捕获和文库制备：通过在4℃下在摇摆桶式离心机中以300g使细胞沉淀5分钟，在含有0.04％ bsa的pbs中洗涤til两次。使用ao-pi在lunafl自动荧光细胞计数器(logos biosystems,south korea)上对细胞的细胞活力进行计数。将细胞分离并裂解，然后使用铬控制器用3’基因表达化学v3.0或5’免疫细胞谱分析化学v1.0和v1.1(10x genomics,pleasanton,ca)进行单细胞条形码逆转录mrna。根据相应的用户指南进行单细胞cdna扩增、tcr富集和文库制备。使用3’gex v3.0对以下患者i.p.的转录组进行测序：2984-nr、2990-nr、3504-nr 3408-nr、3870-nr、3905-cr、3418-cr、3664-cr、3733-cr、3835-cr。使用5’gex+tcr v1.0对以下患者i.p.的组合的rna转录组和tcr鉴定进行测序：3713-cr和4000-nr。
[0168]
单细胞测序：在插入读段长度为98个碱基对的nextseq 550测序仪上对单细胞基因表达文库进行测序。对于含有富含tcr的文库的样品，通过在miseq或nextseq 550测序仪上进行配对末端150个碱基对测序来对vdj区进行测序。
[0169]
scrna数据处理：使用cell ranger 3.0pipeline(10x genomics)处理测序输出。简而言之，将测序输出多路分解(demultiplexed)并转换成fastq文件集。将与基因表达文库相关的fastqs与10x genomics(refdata-cellranger-grch38-3.0.0)提供的grch38参考进行比对，对于tcr文库，为refdata-cellranger-vdj-grch38-alts-ensembl-3.1.0。独特的分子标识符-(umi-)折叠读取计数归因于单独的细胞条形码以产生单细胞基因表达矩阵，并且在tcr文库的情况下，产生包括α和β序列的单细胞tcr克隆型列表。评价测序和单细胞测定性能以确保可靠的基因表达和tcr克隆型结果，其中对于基因表达，靶读取深度为每个单细胞超过30,000个平均读取，对于vdj数据集为每个单细胞超过5,000个平均读取。产生了代表每个细胞条形码的每个注释基因的umi折叠读取计数的基因表达矩阵。将所有细胞中少于200个基因的细胞和少于5个读取计数的基因从表达矩阵中过滤掉。基于tcr可变cdr3β核苷酸序列来定义tcr克隆型，并且排除具有两种不同tcr可变cdr3β核苷酸序列的单细胞(可能是双联体)。将表达矩阵转化为tpm，并将细胞条形码用于与相关tcr克隆型唯一匹配。从scrna分析中排除由转录组限定的cd4细胞。首先用卷积方法将细胞标准化(lun等人,genome biol.,17:75(2016))。然后使用随机主成分分析分解标准化的数据(halko等人,siam review,53:217
–
288(2011))。
[0170]
scrna分析：所有的scrna和sctcr分析都使用r package seurat v2.4进行
(butler等人,nat.biotechnol.,36:411
–
420(2018))。对于应答者和无应答者的scrna转录组分析，将单一批量校正的基因表达矩阵用作输入。简而言之，通过回归出高度可变的基因和线粒体基因，然后标准化和定标，对基因表达矩阵进行标准预处理。生成主成分(pc)，并将elbow和jackstraw图用于定义用于聚类的重要pc。由群集的pc生成t-sne图；定义群集和超群集用于比较cr和nr。通过使用默认参数比较各个群集来获得s.cluster a和b的群集标志物。对于组合的scrna/sctcr i.p.分析(3713-cr和4000-nr)，生成每名患者的单独基因表达矩阵。排除所有的trav/trbv基因以在seurat处理前去除作为聚类偏倚来源的内源性tcr表达。对于两个群集解决方案，进行第一和第二主成分的较低分辨率聚类，然后分析所有cr和nr细胞的频率分布以表示超级群集a和超级群集b。在seurat上通过默认参数获得每个群集的单独群集标志物。
[0171]
组合的scrna和sctcr分析：使用tcrb和tcra cdr3序列将与单独细胞条形码相关的新表位反应性tcr克隆型(neotcr)生成到独立的元数据文件中。在随后的分析中包括对tcra或tcrb具有良好质量读取的细胞。将neotcr
+
细胞条形码元数据反向投影到患者群集内鉴定的t-sne转录组群集上，并且如下所述对dn/dp基因标签进行评分。如上所述，去除内源性细胞tcr以降低作为聚类偏倚来源的trav/trbv基因表达。从分析中排除转录组的预处理失败的细胞，即使它们具有完整的tcrb/tcra读取亦如此。
[0172]
基因差异表达(deg)分析：来自患者i.p.(3664-cr、3733-cr、3408-nr、3504-nr)中单细胞的entpd1(cd39)和cd69转录物表达用于定义cd39-cd69-细胞(cd39的最后两个四分位数，cd69 tpm)和cd39
+
cd69
+
细胞(cd39的前两个四分位数，cd69 tpm)(图6a)。用fdr《0.1和倍数变化为0.5的edger包生成dn与dp单细胞之间的det比较。对于公共的基因标签分析，生成了基因标签矩阵，其衍生自由限于cd8 t细胞的人基因集和其它基因集(总共568个基因集)选择的immunesigdb(godec等人,immunity,44:194
–
206(2016))。如之前在(gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)中所述，在r上使用默认参数运行gsea。富含cd39-cd69-和cd39
+
cd69
+
的前100个统计上显著的基因分别被认为是dn和dp基因标签。
[0173]
单细胞基因标签分析：从单样品基因集富集分析(ssgsea)修改的单细胞基因集富集分析(scgsea)是一种基于等级的基因标签度量，其在每个样品的基础上计算基因列表相对于rna表达(bioconductor.org/packages/release/bioc/html/gsva.html)中所有其它基因的表达分数(等人,genome biol.,17:231(2016))。简而言之，将具有条形码的标准化scrna til i.p.数据用作基因组列表的输入。所有基因标签的scgsea分数进行z-标度，用于细胞和样品的交叉标签比较。使用r包corrplot生成来自单一t细胞的各种基因标签之间的聚类相关矩阵。将dn和dp scgsea分数的前两个四分位数投影到t-sne图上以鉴定富含相应基因标签的群集。平均dn和dp scgsea分数用于使用wilcoxon秩和检验评估应答者和无应答者。将表型适合度分数计算为每个细胞的dn和dp scgsea分数之差(dn减去dp)，表明在单细胞水平相对干细胞样表型的富集。计算每名患者i.p.的平均适合度分数，并将其在act和icb的应答者和无应答者之间进行比较。对于dn和dp亚组与基因标签的交叉研究比较，使用包corrplot在来自单一t细胞的各种基因标签之间构建相关矩阵，并在分层聚类之后展示。对于tcr克隆型比较，计算表达特定neotcr的所有细胞的平均scgsea分数，将其投影在t-sne图上，并在克隆型之间进行比较。短期til刺激
[0174]
将患者i.p.解冻，在无细胞因子的情况下静置过夜，并且将dn(cd39-cd69-)和dp(cd39
+
cd69
+
)亚组进行流式分选并静置1小时。然后在圆底96孔板中用板结合的抗cd3/cd28(invitrogen,waltham,ma)刺激每个til群体的105个细胞保持48小时。刺激的til的多细胞因子分析
[0175]
在cd3/cd28刺激48小时后，将含有刺激的til的96孔板以300g离心5分钟，并按照制造商的说明，在技术重复中，使用v-底板对25μl澄清的上清液进行cd8/nk panel legendplex(cat.#740267,biolegend)测定。在bd lsrfortessa细胞分析仪(bd biosciences)上通过流式细胞术分析捕获的细胞因子。生成每种细胞因子的标准曲线，并使用制造商软件(来自biolegend的vigenetech v8)生成来自刺激的til群体的分泌的细胞因子的浓度。体外抗肿瘤til扩增实验
[0176]
将3733-cr i.p.解冻并在无细胞因子的情况下静置过夜。第二天，通过流式分选分离cd39-cd69-(dn)和cd39
+
cd69
+
(dp)cd8t细胞；将dn、dp和大量的i.p.t细胞与自体3733-mel肿瘤细胞系以1:1的比例共培养过夜。将肿瘤反应性细胞从dn、dp和大量群体(dn 4-1bb
+
、dp 4-1bb
+
和大量4-1bb
+
)的cd8
+
4-1bb
+
中流式分选，并且对105个细胞进行快速扩增(rep)，如前所述(dudley等人,j.immunother.,26:332
–
342(2003))。在每次rep结束时，对细胞进行计数，并且对105个所得细胞进行另外的rep，同时将其余细胞冷冻保存。在第三次rep完成时，解冻并回收冷冻保存的样品，并且通过与自体3733-mel肿瘤细胞系以1:1的比率以生物学的一式三份共培养来评估肿瘤反应性，其中4-1bb
+
作为肿瘤反应性的读数。在每次rep结束时评估活细胞数目。对于理论的细胞扩增产量计算(图16b)，％的4-1bb
+
肿瘤反应性部分表示为％的总cd8
+
活细胞，以及来自1e5个细胞的总细胞产量用于推断理论肿瘤特异性细胞产量。cdr3β调查测序与追踪
[0177]
将冷冻保存的输注产物或pbl样品解冻，测试活力并计数。首先针对包括所示cd39和cd69在内的标志物对细胞进行流式分选，或者将细胞直接沉淀，速冻，并送往adaptive biotechnologies(seattle,wa)，用于基因组dna提取和immunoseq tcrb调查测序(v4)(pasetto等人,cancer immunol.res.,4:734
–
743(2016))。然后在来自给定患者的不同样品中比较已知新抗原反应性cdr3β的频率。ny-eso-1-反应性tcr表型分析
[0178]
对于涉及来自用ny-eso-1-特异性tcr转导的细胞处理的患者(eso.cr)的t细胞的测序的实验，针对apc、cd39-pe和cd69-fitc缀合的cd8,ny-eso-1tcr(hla-a*02:01-sllmwitqc(seq id no:17)肽四聚体(proimmune,uk)对解冻的i.p.染色，以及分离三个群体用于cdr3β调查测序：cd8+ny-eso-1tcr+(大量)、cd8+ny-eso-1tcr+cd39-cd69-(dn)和cd8+ny-eso-1tcr+cd39+cd69+(dp)。通过将内源性cdr3β序列标准化为ny-eso-1-特异性tcr构建体(cassyvgntgelff)(seq id no:18)的cdr3β的频率来估计tcr转导的细胞内的真实内源性cdr3β频率。在图4b中，使用标准化的表达ny-eso-1tcr的i.p cdr3β数据，基于给定克隆在分选的dn细胞中的频率与其在分选的dp细胞中的频率的比率，将输注袋中的前20个克隆分成dn富集的和dp富集的，dn/dp比率》1的任何克隆被认为是dn富集的，以及dn/dp比率《1的任何克隆被认为是dp富集的。对于图4c，将1311个最常见的克隆定义为在大量、dn
和dp群体中存在的那些克隆。根据它们在从i.p分选的细胞的dn和dp群体内的频率的比率分析它们的短期(7天)和长期(51个月)持久性。鼠t细胞培养
[0179]
分离pmel脾细胞，用人gp100(25-33)肽进行脉冲，并在60iu il2和完全小鼠t细胞培养基存在下扩增5天，如先前所述(24)。(klebanoff等人,clin.cancer res.,17:5343
–
5352(2011))。收集第5天的细胞，在il2存在下用板结合的抗cd3(2μg/ml)和可溶性cd28(1μg/ml)再刺激，并扩增直至第10天。在培养10天之后，将细胞分成dn(cd39-cd69-)和dp(cd39+cd69+)用于肿瘤治疗实验。鼠肿瘤治疗
[0180]
成年6-8周龄雌性b6 ncr(b6；ly5.2
+
)小鼠购自nci frederick的charles river laboratories。将从the jackson laboratory(bar harbor,me)获得的b6.sjl-ptprca pepcb/boyj(ly5.1
+
)小鼠维持在无特定病原体的条件下。对于肿瘤治疗实验，向6-8周龄的雌性b6小鼠注射3.5
×
105个过表达嵌合人/小鼠gp100抗原kvprnqdwl(seq id no:19)(aa25
–
33)的b16黑色素瘤细胞系(hanada等人,jci insight,4(2019),doi:10.1172/jci.insight.124405)。使肿瘤细胞生长10天，并且在注射t细胞之前，荷瘤小鼠接受6gy的全身辐照。一天后，用facs分选的dn(cd39-cd69-)和dp(cd39
+
cd69
+
)以两个剂量(每只小鼠3e5，5e5)处理动物。在指定剂量下体外活化并扩增pmel t细胞10天。包括接受1
×
pbs的对照小鼠作为对照。所有处理的动物每天接受12μg il-2腹腔内注射持续三天。所有肿瘤测量均由独立的研究者双盲进行。atac测序分析
[0181]
使用具有非常敏感标志的bowtie2将atac-seq fastq文件与基因组构建38进行比对。对齐的bam文件已经使用picard的标志物重复工具删除了重复项。去除线粒体读取并在峰查找类型dnase设置下使用homer v4.11.1调用峰。bedtools用于合并重叠的峰并记录每个样品的每个峰内的5’端读取的计数。将该计数矩阵用作edger的输入以使用estimateglmtagwisedisp函数来鉴定差异区域。然后使用glmfit和glmlrt进行似然比检验。如果峰的fdr q值《＝0.01，则峰被确定为显著的。
[0182]
转录因子基序分析：从2020年07月07日的cis-bp数据库下载所有人转录因子基序。将gomer(sade-feldman等人,cell,176:404(2019)；liu等人,genome res.,16:1517
–
1528(2006))用于生成每个基序的所有差异峰的结合分数。使用前n个高达3000评分的峰，将python’s scipy.stats hypergeom模块用于计算对于双阳性和双阴性峰的每个基序的背景峰速率(用于生成每个基序的背景速率的非显著峰)的最小超几何平均测试。然后使用python’s statsmodels.sandbox.stats.multicomp multipletests模块，通过bejamini-hochberg fdr校正p值，将每个测试视为独立的。实施例1
[0183]
本实施例证明了施用的t细胞中的cd39-cd69-t细胞表型与对act的阳性应答相关。
[0184]
对表型差异进行了比较，所述表型差异能够区分向已经对疗法具有完全应答的患者(完全应答者，cr，n＝24))施用的act输注产物(i.p.)与向在act后疾病进展的患者(无应答者，nr,n＝30)施用的act输注产物(i.p.)(图1a)。这些act i.p.来自iv期转移性黑色素瘤患者的群组，其已经用自体体外扩增的til治疗并且没有经历基因工程化t细胞疗法或抗
pd-1阻断形式的先前免疫疗法(goff等人,j.clin.oncol.,34:2389
–
2397(2016)；dudley等人,clin.cancer res.,16:6122
–
6131(2010))。
[0185]
通过质谱流式技术(cytof)对来自7个cr和9个nr的480万个i.p.til的发现集的初始单细胞分析显示了34种细胞表面标志物的异质性表达。til cytof谱的监督分析鉴定了在cr或nr中普遍出现的群集(图1b)。群集1在cr i.p中相对于nr i.p丰富4倍(校正的p＝0.0264，图1c)，对应于具有丰富的cd44、cd27和cd28以及低表达的tim3的cd8
+
t细胞，在先前研究中表征为记忆样(sade-feldman等人,cell,176:404(2019))和干细胞样(jansen等人,nature,576:465
–
470(2019))t细胞。值得注意的是，群集1也具有低表达的抑制性标志物cd39和t细胞活化标志物cd69。基于机器学习的t细胞活化/耗竭状态的无监督聚类根据患者的临床结果对患者进行分类进一步证实了cd69和cd39表达是最具临床相关性的两个显著特征(图5a-5c)。值得注意的是，具有高表达的cd39和cd69，但低水平的cd44、cd27和cd28的群集2的频率在nr i.p.中比在cr i.p.中高。尽管这种差异不是统计上显著的(图1c)。
[0186]
将cd8
+
cd39-cd69-细胞定义为群集1成员的16个发现样品的流式细胞术分析以高置信度总结了质谱流式数据(图6a-6b)。通过多参数流式细胞术对一组独立的38i.p的评价显示相对于nr i.p.，cd8
+
cd39-cd69-til群体的频率在cr i.p.中高2.5倍(p＝0.0096，％的cd3)，支持了该亚组与act应答之间的关联(图1d-e)。尽管输注的t细胞的总数目在这组38个患者样品中在cr与nr i.p.之间没有显著差异，但输注的cd8
+
cd39-cd69-细胞的总数目在cr i.p.中比在nr i.p.中高4倍(p＝0.0031，图1f-g)。查询单个标志物，在cd8+tim3+til和对act无应答之间存在适度的关联趋势(图6c)。分析来自所有54名患者的患者存活，发现在患者输注产物中包含大部分cd8
+
til的输注的cd39
+
cd69
+
t细胞的绝对数目(图6c)在该群组中不显著影响黑色素瘤特异性生存期(mss)或无进展生存期(pfs)(图7a-7c)，i.p.中较高数目的cd8
+
cd39-cd69-细胞与改善的无进展生存期(pfs,p《0.0001,hr＝0.255,95％置信区间(ci)0.1257至0.5186,图1h)和黑色素瘤特异性生存期(mss,p《0.0001,hr＝0.217,95％ ci 0.101至0.463,图1i)以剂量依赖的方式显著相关(图7a-7c，三分位数分析)。此外，输注产物中cd8
+
cd39-cd69-与cd8
+
cd39
+
cd69
+
细胞的比例显著影响mss和pfs，表明该群组中的act应答与较高数量的cd8
+
cd39-cd69-细胞的输注有关，而与较少的cd8
+
cd39
+
cd69
+
til的输注无关。实施例2
[0187]
本实施例证明了阳性应答相关的cd39-cd69-til处于祖记忆干细胞样状态，而cd39
+
cd69
+
til处于终末分化状态。
[0188]
为了进一步探讨cd8
+
cd39-cd69-til(群集1，双阴性：dn)和i.p.占优势的cd8
+
cd39
+
cd69
+
til(群集2，双阳性：dp)的潜在意义，评价了这两个亚组的转录组谱(图8a)。dn til具有增加的静止t干细胞标志物klf2、tcf7、s1pr1、lef1、il7r、cd27和sell(cd62l)的表达，而dp til表达在分化的活化t细胞中发现的cd38、mk167、gitr、gzma、tnf和ifng(图8b，表3)。通过单细胞转录组分析(scrna)对来自10名患者i.p.(5cr,5nr)的20,672个cd8
+
til的无监督聚类定义了8个群集(图2a)。对来自cr和nr i.p.的til分布的分析表明它们分离成由s.clustera(超级群集a，包括群集c0、c2、c5、c6、c7)和s.cluster.b(超级群集b，包括群集c1、c3、c4、c8)定义的两群集解决方案(sade-feldman等人,cell,176:404(2019))。应答者
til更多地分布在s.clustera中(p＝0.0317)，而s.cluster.b主要包括无应答者til(p＝0.03，图2b)。s.clustera中的til富含dn基因标签(81％重叠，图8c)，而s.cluster.b中的til富含dp基因标签。与这些分析一致，通过dn和dp基因标签的单细胞基因组富集分析(scgsea)对cr til和nr til进行评分，表明cr til平均具有更高的dn分数，而nr til具有更高的dp分数(对于两者，p《4.5
×
10-12
，图2c)。表3
[0189]
通过流式细胞术在来自验证样品的cd39/cd69 til亚组内分析抑制性和记忆标志物的细胞表面表达(n＝38种i.p.，图2d)。观察到相对于单阳性(sp、cd39
+
cd69-和cd39-cd69
+
)和dp亚组，在dn亚组中耗竭标志物pd-1和tim3的较低细胞表面表达和共表达(图2d，图9a-9b)。相反，相对于在sp群体内具有可变表达的dp亚组，记忆标志物cd62l和cd27及祖标志物slamf6的表达在dn中增加(图2d，图9a-9b)。相对于dp til，记忆干细胞样t细胞标志物tcf7的蛋白质表达在dn til中高5倍(p＝0.0002,n＝18种i.p.，图2e)，这与scrna分析一致。虽然输注产物中的dn til表达较高水平的slamf6和tcf7转录物，但共表达tcf7和slamf6的til在dn亚组中没有显著富集，并且在描绘与该患者亚组中存活益处相关的til方面，将slamf6加入到dn中作为表面标志物与单独的dn相当。相比之下，相对于dn til，dp til具有显著更高的效应物和耗竭相关转录因子tox的转录物和蛋白表达。值得注意的是，虽然dn til的转录谱与外周血干细胞记忆(scm)t细胞的转录谱类似(gattinoni等人,nat.med.,17:1290
–
1297(2011)；lugli等人,j.clin.invest.,123:594
–
599(2013))，但典型的scm标志物cd95和ccr7的细胞表面表达与患者til输注产物中的dn表型无关。
[0190]
为了评估cd39-cd69-i.p.til是否是干细胞样t细胞，分离dn和dp亚组并使用板结合的抗cd3/抗cd28刺激。在t细胞受体(tcr)刺激后，dn til经历自我更新，并产生单一阳性和cd39
+
cd69
+
dp子群体，而刺激的dp til大部分保持在相同的dp状态，表明dn祖状态(n＝6种i.p,图2f)。子群体的时间进程动力学表明基本上所有的dn til都经历cd69活化，但在初始刺激之后5天，一部分dn til(中值＝17％)回到cd39-cd69-干细胞样状态。相比之下，在tcr刺激之后，cd39
+
亲本群体(cd39sp和dp)似乎终末分化成稳定的cd39
+
cd69
+
状态。另外，当dp和dn til响应于多克隆刺激而分泌类似水平的il-2、ifnγ、gzma、gzmb和穿孔素时，dn til刺激导致分泌的il-17a、tnf-α、il-4、sfasl和颗粒溶素的水平高于dp til(图10)。总之，这些结果表明act应答相关的cd39-cd69-til处于能够分化成其它亚组的祖记忆干细胞样状态，而输注产物占优势的cd39
+
cd69
+
til处于终末分化状态。
[0191]
为了理解输注产物中这两种til状态的关键调节物，从三种患者输注产物中分离匹配的dn和dp til，并使用atac(染色质转座酶可及性测定)测序分析它们的表观遗传谱。查询dn和dp til的开放染色质区中4314个人转录因子(tf)基序的存在。干细胞样dn til内的开放染色质区富含sox和c2h2-zf家族tf(包括klf4、tcf7、lef1和tcf7l1)的许多结合位点，这与分化较低的人t细胞的那些一致(sade-feldman等人,cell,176:404(2019)；lynn等人,nature,576:293
–
300(2019))。相比之下，dp til内的染色质区广泛富含bzip tf fosl1、fos、junb和jund的多个结合基序，表明表观遗传印记可能参与维持由慢性肿瘤细胞活化引起的终末分化状态(lynn等人,nature,576:293
–
300(2019)；blank等人,nat.rev.immunol.,19:665
–
674(2019))。
[0192]
为了理解i.p.中的til状态是否对应于新鲜肿瘤内的那些状态，来自先前黑色素瘤icb应答研究的6001cd8
+
t细胞的转录组谱(sade-feldman等人,cell,176:404(2019))使用上述的dn和dp基因标签进行再分析(图2g)。发现在免疫检查点治疗之前，来自icb应答病变的til具有比非应答病变更高的cd39-cd69-标签分数(p＝1.9
×
10-10
)，而来自icb期间进展的病变的til具有更高的cd39
+
cd69
+
标签分数(p《2.2
×
10-16
)。利用来自其它最近研究的t细胞功能障碍和祖基因标签进行的分层聚类相关分析显示cd39-cd69-til的标签与icb应答相关记忆和祖耗竭的til最相似，而cd39
+
cd69
+
til的基因标签与tox
+
和与不良icb应答相关的终末耗竭的til高度相关(sade-feldman等人,cell,176:404(2019)；miller等人,nat.immunol.,20:326
–
336(2019)；scott等人,nature,571:270
–
274(2019)；tirosh等人,science,352:189
–
196(2016))。开发了表型适合度分数，定义为dn干细胞样标签与dp分化标签之差(dn减去dp)，并对来自act i.p.和黑色素瘤icb til的scrna进行评分。单细胞适合度分数再次证实与无应答者til相比，应答者til平均具有更多的干细胞样适合度(图11a-11b)。这些数据表明在act应答者输注产物中发现的干细胞样til类似于在icb应答中发现的那些。实施例3
[0193]
本实施例证明了，至少在黑色素瘤act的情况下，并非所有的cd39-til都是旁观者t细胞，并且应答者在cd39-干细胞样状态下保留一定比例的肿瘤新抗原反应性til。
[0194]
在缺乏抗肿瘤t细胞的特异性分析的大量til群体上进行对干细胞样和分化的人til亚组的先前研究(sade-feldman等人,cell,176:404(2019)；jansen等人,nature,576:465
–
470(2019))。鉴于最近的发现表明新抗原特异性til几乎仅是cd39
+
，而cd39-til代表旁
观者细胞(simoni等人,nature,557:575
–
579(2018)；duhen等人,nat.commun,9:2724(2018))，试图确定与act应答相关的cd39-cd69-干细胞样状态是否存在于i.p中的新抗原反应性t细胞群体内。使用先前描述的串联小基因新抗原筛选平台(parkhurst等人,cancer discov.,9:1022
–
1035(2019)；tran等人,science,344:641
–
645(2014)；zacharakis等人,nat.med.,24:724
–
730(2018)；tran等人,n.engl.j.med.,375:2255
–
2262(2016))，定义了26种来自i.p.的hla i类限制性新抗原用于表型评价(n＝11名患者，图12a-12b和13)。由干细胞样和分化的til亚组的cd39/cd69表达定义的亚组在如代表性cr和nr中所示的hla-新抗原四聚体
+
til中容易检测到(图3a-3b)。对所有26个新抗原特异性t细胞群体的组合分析表明，它们主要以cd39
+
cd69
+
终末分化状态存在，这与报道新抗原特异性t细胞的cd39富集的其它研究一致(中值dp＝62.7％，图3c)(simoni等人,nature,557:575
–
579(2018))。然而，通过act应答状态的数据分层显示了在来自cr i.p(中值＝8.8％)的新抗原特异性til中dn细胞的频率显著高于nr i.p(中值＝0.5％,p＝1.2
×
10-4
，图3d)。cd39作为单一标志物表明，相对于nr til，cr til中的cd39阴性(cd39-)新抗原反应性til高20倍(中值＝23.6％,p＝1.86
×
10-5
，图3e)。对肿瘤特异性细胞的调整显著增强cr与nr输注产物之间的差异，其中在cr中的新抗原特异性dn til高23倍(中值＝2.3
×
108个细胞)，以及在cr中的cd39-til高40.4倍(中值＝1.06
×
109个细胞)。cr与nr输注产物之间新抗原反应性til或新抗原反应性cd39
+
或dp til的总数目没有发现差异。这些结果表明，至少在黑色素瘤act输注产物的情况下，并非所有的cd39-til都是先前报道的旁观者t细胞，并且肿瘤新抗原反应性til的亚组在cr中以cd39-干细胞样状态存在。此外，这些数据表明肿瘤反应性新抗原特异性til在分化亚组中的富集不一定对应于它们处于干细胞样状态的频率。
[0195]
为了探索在单细胞转录组水平上新抗原特异性til的干细胞样和分化状态的异质性，利用限定的新抗原反应性tcr对来自cr(pt.3713)和nr(pt.4000)的i.p.进行组合的scrna和sctcr测序(图3f-3l)(prickett等人,cancer immunol.res.,4:669
–
678(2016)；pasetto等人,cancer immunol res.,4:734
–
743(2016)；parkhurst等人,clin.cancer res.,23:2491
–
2505(2017)；cohen等人,j.clin.invest.,125:3981
–
3991(2015))。
[0196]
来自应答者pt.3713的i.p.由两个主要的群集c0和c1支配，其中c0代表干细胞样dn状态，以及c1代表分化的dp状态(图3f)。20种新抗原特异性tcr
+
(neotcr
+
)克隆型的投影显示了在两个群集中的广泛分布(图3f-3g)。免疫显性的srpx突变特异性neotcr(srpx
mut
)在群集c0中富集，而其它neotcr在两个群集内的流行度不同(图3g)。facs分选的dn和dp i.p til的cdr3β测序证实了这种观察(图14a)。srpx
mut neotcr
+
单细胞的更精细分析表明这些克隆型中的9/10(和所有neotcr克隆型中的15/20)富含阳性表型适合度分数(图3h)。由于先前的研究已经表明t细胞固有的差异潜在地影响act后的克隆型持久性(gattinoni等人,nat.med.,17:1290
–
1297(2011)；rosenberg等人,clin.cancer res.,17:4550
–
4557(2011))，因此分析患者3713的act后外周血。tcr库测序显示大多数neotcr克隆型(18/20)持续长达75个月，这与从祖干细胞样状态srpx
mut
进行til扩增的想法一致(图3i，其它neotcr：图14b)。有趣的是，在靶向相同新表位的10种srpx
mut-neotcr中，一个具有最低表型适合度分数的克隆型(tcr-51)在频率上下降，并且仅在治疗后3个月才变得不可检测(图3h-3i)。
[0197]
无应答者pt.4000i.p.的组合scrna和sctcr测序显示两个主要干细胞样群集(c1、
c5)和一个主要分化群集(c0)(图3j)。然而，neotcr+细胞(hivep2
mut
、amph
mut
)主要集中在分化的c0群集中(～60％,图3j,15a-15b)。来自pt.4000的scgsea分数表明两种neotcr克隆型均具有阴性表型适合度分数(图3k)。与3713-cr持久性克隆型形成鲜明对比，pt.4000neotcr不能在act后持续扩增，相反，在治疗后，两种输注的neotcr克隆型在外周血中迅速下降(图3l)。这些结果支持先前的观察和其它公开的报道，这些报道将细胞治疗应答与治疗后tcr持久性联系起来(rosenberg等人,clin.cancer res.,17:4550
–
4557(2011)；zhou等人,immunity,33:229
–
240(2010)；kalos等人,sci.transl.med.,3:95ra73(2011))。实施例4
[0198]
本实施例证明了具有cd39-cd69-表型的t细胞介导抗肿瘤活性和tcr持久性。
[0199]
虽然在实施例1-3中描述的结果表明t细胞固有的表型差异与act后的持续性相关，但另外的因素如tcr针对可变肿瘤抗原的亲合力也可在t细胞持续性中起作用。为了解决这个问题，在转移性滑膜细胞肉瘤患者中进行t细胞持久性的探索性分析，所述患者在过继转移用靶向单一hla-a*02:01限制性ny-eso-1表位的tcr转导的自体pbmc后经历cr。将内源性人tcrβ序列用作条形码以追踪治疗后血液中tcr转导的群体内的干细胞样dn克隆和分化的dp克隆(图4a)(d’angelo等人,cancer discov.,8:944
–
957(2018))。前20种eso tcr
+
i.p.克隆型中有14种富含干细胞样dn状态，而6种富含分化的dp状态。干细胞样克隆在tcr转移后5年的时间内显示其频率的逐渐降低，而分化的克隆在患者的治疗后血液中迅速下降至较小的频率(图4b)。在前1311个克隆中，当与持久性差的克隆(在处理后7天检测不到的那些，n＝122)相比时，在i.p.中长期持久性克隆(在act后51个月可检测到，n＝790)在干细胞样状态下显著富集(p＝0.0035，图4c)。这些分析表明固有的干细胞样表型可以调节act后t细胞克隆型的行为，尽管需要在靶向其它抗原的tcr和car试验中对较大患者群组进行进一步研究以检验这些假设。
[0200]
该发现表明用cd39-cd69-肿瘤反应性til进行治疗可导致优越的肿瘤控制。该假设首先通过从cr i.p.(pt.3733)分离肿瘤反应性dn和dp群体进行体外测试，通过与自体3733-mel肿瘤细胞系共培养以选择肿瘤反应性til，然后进行多轮快速扩增以评价它们的增殖潜能和肿瘤识别(图16a)。发现肿瘤反应性干细胞样dn亚组的扩增比分化的dp亚组约高一千倍(图16b)。干细胞样dn亚组维持肿瘤识别，而分化的dp亚组在随后的几轮扩增后失去肿瘤反应性(图16c-16d)。
[0201]
为了评估干细胞样dn和分化的dp亚组的体内抗肿瘤效果，从体外扩增的pmel转基因tcr脾细胞中分离cd39-cd69-和cd39
+
cd69
+
cd8
+
鼠t细胞群体，并进行将分离的亚组过继转移到植入有经工程化以表达人gp100抗原的b16-f10黑色素瘤的小鼠中(图4d)(hanada等人,jci insight,4(2019),doi:10.1172/jci.insight.124405)。虽然3
×
105或5
×
105个分化的dp pmel t细胞的过继转移对肿瘤控制和小鼠存活具有适度的影响，但是相同数目的干细胞样dn t细胞的转移以剂量依赖性方式导致显著的肿瘤消退和改善的存活(图4e-4f)。数据还表明富含肿瘤反应性(例如cd39
+
cd69
+
)的抗肿瘤新抗原特异性til亚组可能是在体内具有相对差的增殖潜能的终末分化的til(图4g)(van der leun等人,nat.rev.cancer.20:218
–
232(2020))。实施例5
[0202]
本实施例证明了区分新抗原特异性t细胞和旁观者t细胞的基因表达谱的鉴定。
[0203]
对干细胞样群集c0进行单细胞转录组数据的再分析(图14a)，以鉴定干细胞样群集内新抗原特异性t细胞与旁观者t细胞之间基因表达的选择性是否存在任何差异，如图18a所示。
[0204]
结果如图18b所示。如图18b所示，观察到差异基因表达，其中相对于旁观者t细胞(图18b的左侧)，在干细胞样新抗原特异性t细胞(图18b的右侧)中选择的基因被上调。
[0205]
差异表达的基因和倍数变化值显示在表4中。在表4中，正的logfc值表明与癌症患者的肿瘤样品中的其它t细胞相比，所示基因在cd39-cd69-新抗原特异性t细胞中的表达更高。负的logfc值表明与癌症患者的肿瘤样品中的其它t细胞相比，所示基因在cd39-cd69-旁观者t细胞中的表达更高。表4
[0206]
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文，其程度如同每篇参考文献均被单独且具体地指明为通过引入并入本文并在本文整体阐述。
[0207]
在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)术语“一个”和“一种”和“该”和“至少一种”以及类似指代物的使用应被解释为涵盖了单数和复数两种，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一种”之后是一项或多项的列表(例如，“a和b中的至少一种”)的使用应理解为意指选自所列项(a或b)的一项或所列项(a和b)的两种或更多种的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。
[0208]
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述说明书之后，那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。本发明人期望本领域技术人员适当地采用这样的变型，并且本发明人有意以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求书中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指出或另外与上下文明显
矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。

技术特征：
1.获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从来自患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)从所述大量群体中特异性地选择具有包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-的表型的t细胞；以及(c)将(b)中选择的所述细胞与缺乏所述表型的细胞分离以获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括从分离的具有所述表型的t细胞中分离肿瘤反应性t细胞。3.获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从来自患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)从所述肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞；(c)从所述分离的肿瘤反应性t细胞中特异性地选择具有包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-的表型的t细胞；以及(d)将(c)中选择的所述细胞与缺乏所述表型的细胞分离以获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中选择所述分离的具有所述表型的t细胞包括进行t分布随机近邻嵌入(t-sne)分析。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中选择所述分离的具有所述表型的t细胞包括进行通过测序的转录组和表位细胞索引(cite-seq)的分析。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中选择所述分离的具有所述表型的t细胞包括检测所述t细胞中是否存在编码所述表型的一种或多种标志物的rna。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中选择所述分离的具有所述表型的t细胞包括检测所述t细胞是否存在所述表型的一种或多种标志物的细胞表面表达。8.获得富含具有表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从来自患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)从所述肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞；以及(c)修饰所述分离的肿瘤反应性t细胞以提供包含标志物cd39-和cd69-的表型，从而获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体。9.制备富含具有cd3
+
cd39-cd69-表型的t细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从来自患者的肿瘤样品中分离肿瘤反应性t细胞；以及(b)修饰所述分离的肿瘤反应性t细胞以(i)诱导一种或多种以下标志物的表达：ahnak
+
、al592183.1
+
、anxa1
+
、anxa4
+
、aqp3
+
、atm
+
、bin1
+
、c10orf54
+
、c11orf21
+
、c16orf54
+
、ccdc109b
+
、cd27
+
、cd52
+
、cd55
+
、cd8b
+
、cdc25b
+
、cdc42se1
+
、clec2b
+
、clic3
+
、cluap1
+
、crbn
+
、ctd-3184a7.4
+
、ddi2
+
、dnd1
+
、emp3
+
、epb41
+
、ern1
+
、faim3
+
、fam65b
+
、fbxl8
+
、fgfbp2
+
、gadd45b
+
、gimap4
+
、gimap7
+
、gpr155
+
、gzmm
+
、hsd17b11
+
、il10ra
+
、il7r
+
、isg20
+
、kansl1-as1
+
、klf2
+
、klhl24
+
、ldlrap1
+
、lef1
+
、lgals3
+
、linc00861
+
、litaf
+
、lyar
+
、mapkapk5-as1
+
、med15
+
、miat
+
、mir142
+
、mxi1
+
、myc
+
、neat1
+
、nosip
+
、odf2l
+
、p2ry8
+
、pde6g
+
、pik3ip1
+
、plec
+
、plp2
+
、ppp2r5c
+
、pxn
+
、r3hdm4
+
、ramp1
+
、rasa3
+
、rasgrp2
+
、rcbtb2
+
、rnaset2
+
、rp11-395b7.4
+
、rp11-539l10.2
+
、rp11-640m9.1
+
、
s100a10
+
、s100a4
+
、s100a6
+
、s1pr1
+
、s1pr4
+
、samd3
+
、sell
+
、sh3bp5
+
、sigirr
+
、slamf6
+
、slco3a1
+
、sorl1
+
、stk38
+
、synj2
+
、tcf7
+
、timp1
+
、tradd
+
、tsc22d3
+
、tspan32
+
、txnip
+
、ubxn11
+
、vcl
+
、vnn2
+
、ypel3
+
、zfp36l2
+
、znf276
+
和znf683
+
，和/或(ii)抑制一种或多种以下标志物的表达：acot7
+
,adam19
+
,agpat9
+
,agtrap
+
,aif1
+
,aspm
+
,atad2
+
,aurka
+
,aurkb
+
,birc3
+
,birc5
+
,brca1
+
,c15orf48
+
,casc5
+
,ccl3
+
,ccna2
+
,ccnb1
+
,ccnb2
+
,ccnd2
+
,cd38
+
,cd40lg
+
,cd69
+
,cd8b
+
,cdc20
+
,cdca3
+
,cdca8
+
,cdk1
+
,cdkn3
+
,cdt1
+
,cenpa
+
,cenpe
+
,cenpf
+
,cenpm
+
,cenpw
+
,cep55
+
,cish
+
,cks1b
+
,cks2
+
,clspn
+
,crtam
+
,csf2
+
,dlgap5
+
,dusp5
+
,dusp6
+
,dut
+
,egr1
+
,entpd1
+
,fen1
+
,gins2
+
,gtse1
+
,h2afx
+
,hist1h4c
+
,hla
+
dqa2
+
,hmmr
+
,ifi27
+
,ifng
+
,il2ra
+
,il5
+
,kiaa0101
+
,kif11
+
,kif23
+
,kpna2
+
,krt7
+
,mad2l1
+
,mcm7
+
,mki67
+
,mx1
+
,mybl2
+
,ncapg
+
,ndc80
+
,ndfip2
+
,nudt1
+
,nusap1
+
,orc6
+
,pbk
+
,pcna
+
,plk1
+
,rpl39l
+
,rrm2
+
,sgol2
+
,shcbp1
+
,smc2
+
,spc25
+
,stmn1
+
,tesc
+
,tk1
+
,tnf
+
,tnfrsf18
+
,tnfsf10
+
,top2a
+
,tpm4
+
,tpx2
+
,tuba1b
+
,tuba1c
+
,tubb
+
,tyms
+
,ube2c
+
,ube2s
+
,ube2t
+
,xcl1
+
和zwint
+
，其中(i)中诱导一种或多种所述标志物的表达和/或(ii)中抑制一种或多种所述标志物的表达诱导所述t细胞具有cd3
+
cd39-cd69-表型。10.获得包含富含具有表型的t细胞的细胞群体的药物组合物的方法，所述方法包括：根据权利要求1-9中任一项所述的方法获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体；以及将富含具有所述表型的t细胞的细胞群体与药学上可接受的载体组合以获得包含富含具有所述表型的t细胞的细胞群体的药物组合物。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其还包括在由所述细胞表达外源性tcr的条件下，将编码所述外源性tcr的核酸引入富含具有所述表型的t细胞的群体的细胞中。12.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其还包括在由所述细胞表达car的条件下，将编码嵌合抗原受体(car)的核酸引入富含具有所述表型的t细胞的群体的细胞中。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其还包括扩增通过所述方法获得的富含具有所述表型的t细胞的群体中的细胞数目。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法获得的分离的或纯化的细胞群体。15.药物组合物，其包含权利要求14所述的分离的或纯化的细胞群体和药学上可接受的载体。16.产生用于治疗或预防哺乳动物中癌症的药物的方法，所述方法包括根据权利要求1-13中任一项所述的方法获得富含具有所述表型的t细胞的细胞群体。17.针对癌症患者选择疗法的方法，所述方法包括：(a)从来自患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)测量(i)具有或(ii)缺乏表型的大量群体中t细胞的比例，其中所述表型包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-；以及(c)将(i)具有或(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例与对照进行比较；以及(d)当(i)具有所述表型的t细胞的比例低于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照时，选择所述患者进行不是免疫疗法的疗法；或者(e)当(i)具有所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的
t细胞的比例低于所述对照时，选择所述患者进行免疫疗法。18.针对癌症患者选择疗法的方法，其还包括：接收针对癌症患者选择的疗法的鉴定，其中已经通过权利要求17所述的方法选择所述疗法；以及(i)当(i)具有所述表型的t细胞的比例低于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照时，不是免疫疗法的疗法用于所述患者中癌症的治疗；或者(ii)当(i)具有所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例低于所述对照时，免疫疗法用于所述患者中癌症的治疗。19.预测癌症患者对免疫疗法的临床应答的方法，所述方法包括：(a)从来自所述癌症患者的肿瘤样品中获得大量t细胞群体；(b)测量(i)具有或(ii)缺乏表型的大量群体中t细胞的比例，其中所述表型包含标志物cd3
+
、cd39-和cd69-‑
；以及(c)将(i)具有或(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例与对照进行比较；以及(d)当(i)具有所述表型的t细胞的比例低于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照时，将所述患者鉴定为可能对所述免疫疗法具有阴性临床应答；或者(e)当(i)具有所述表型的t细胞的比例等于或高于所述对照或者(ii)缺乏所述表型的t细胞的比例低于所述对照时，将所述患者鉴定为可能对所述免疫疗法具有阳性临床应答。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法在用于治疗所述患者中的癌症的免疫疗法之前实施。21.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法在用于治疗所述患者中的癌症的免疫疗法之后实施。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法在用于治疗所述患者中的癌症的免疫疗法之前实施，并且在用于治疗所述患者中的癌症的免疫疗法之后再次实施。23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法是过继细胞疗法(act)、免疫检查点阻断疗法、免疫系统调节剂疗法、t细胞疗法和/或嵌合抗原受体(car)疗法。24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述表型还包含以下的一种或多种标志物：ahnak
+
、al592183.1
+
、anxa1
+
、anxa4
+
、aqp3
+
、atm
+
、bin1
+
、c10orf54
+
、c11orf21
+
、c16orf54
+
、ccdc109b
+
、cd27
+
、cd52
+
、cd55
+
、cd8b
+
、cdc25b
+
、cdc42se1
+
、clec2b
+
、clic3
+
、cluap1
+
、crbn
+
、ctd-3184a7.4
+
、ddi2
+
、dnd1
+
、emp3
+
、epb41
+
、ern1
+
、faim3
+
、fam65b
+
、fbxl8
+
、fgfbp2
+
、gadd45b
+
、gimap4
+
、gimap7
+
、gpr155
+
、gzmm
+
、hsd17b11
+
、il10ra
+
、il7r
+
、isg20
+
、kansl1-as1
+
、klf2
+
、klhl24
+
、ldlrap1
+
、lef1
+
、lgals3
+
、linc00861
+
、litaf
+
、lyar
+
、mapkapk5-as1
+
、med15
+
、miat
+
、mir142
+
、mxi1
+
、myc
+
、neat1
+
、nosip
+
、odf2l
+
、p2ry8
+
、pde6g
+
、pik3ip1
+
、plec
+
、plp2
+
、ppp2r5c
+
、pxn
+
、r3hdm4
+
、ramp1
+
、rasa3
+
、rasgrp2
+
、rcbtb2
+
、rnaset2
+
、rp11-395b7.4
+
、rp11-539l10.2
+
、rp11-640m9.1
+
、s100a10
+
、s100a4
+
、s100a6
+
、s1pr1
+
、s1pr4
+
、samd3
+
、sell
+
、sh3bp5
+
、sigirr
+
、slamf6
+
、slco3a1
+
、sorl1
+
、stk38
+
、synj2
+
、tcf7
+
、timp1
+
、tradd
+
、tsc22d3
+
、tspan32
+
、txnip
+
、ubxn11
+
、vcl
+
、vnn2
+
、ypel3
+
、zfp36l2
+
、znf276
+
和znf683
+
。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述表型还包含以下的一种或多种标志物：acot7-、adam19-、agpat9-、agtrap-、aif1-、aspm-、atad2-、aurka-、aurkb-、birc3-、birc5-、brca1-、c15orf48-、casc5-、ccl3-、ccna2-、ccnb1-、ccnb2-、ccnd2-、cd38-、cd40lg-、cd69-、cd8b-、cdc20-、cdca3-、cdca8-、cdk1-、cdkn3-、cdt1-、cenpa-、cenpe-、cenpf-、cenpm-、cenpw-、cep55-、cish-、cks1b-、cks2-、clspn-、crtam-、csf2-、dlgap5-、dusp5-、dusp6-、dut-、egr1-、entpd1-、fen1-、gins2-、gtse1-、h2afx-、hist1h4c-、hla-dqa2-、hmmr-、ifi27-、ifng-、il2ra-、il5-、kiaa0101-、kif11-、kif23-、kpna2-、krt7-、mad2l1-、mcm7-、mki67-、mx1-、mybl2-、ncapg-、ndc80-、ndfip2-、nudt1-、nusap1-、orc6-、pbk-、pcna-、plk1-、rpl39l-、rrm2-、sgol2-、shcbp1-、smc2-、spc25-、stmn1-、tesc-、tk1-、tnf-、tnfrsf18-、tnfsf10-、top2a-、tpm4-、tpx2-、tuba1b-、tuba1c-、tubb-、tyms-、ube2c-、ube2s-、ube2t-、xcl1-和zwint-。26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述表型还包含以下的一种或多种标志物：ahi1
+
、alox5ap
+
、anxa5
+
、cd68
+
、cd74
+
、cd99
+
、cdc27
+
、cdca7
+
、cish
+
、cotl1
+
、ctsh
+
、ctsw
+
、ddx60
+
、gtsf1
+
、hist1h2ag
+
、hla-dpa1
+
、hla-drb1
+
、hla-drb5
+
、hmgn3
+
、igfbp3
+
、il32
+
、ints4
+
、itgae
+
、itgb1
+
、klrc3
+
、lgals1
+
、lime1
+
、pdcd1
+
、ppm1m
+
、prss57
+
、rab34
+
、rbpms
+
、s100a11
+
、s100a4
+
、snap47
+
、tnfrsf10a
+
、vsir
+
、zbp1
+
和znf683
+
。27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述表型还包含以下的一种或多种标志物：aqp3-、asxl2-、cd6-、cldnd1-、eef1a1-、epb41-、ern1-、fcmr-、gimap4-、gimap7-、gnly-、gzmk-、il27ra-、linc01943-、mrpl57-、mt-co1-、mt-co2-、rgs10-、rpl13a-、rpl18-、rpl18a-、rpl37-、rpl41-、rplp0-、sfmbt2-、tpt1-和trgv10-。28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述表型还包含标志物cd8
+
和cd4
+
中的一种或两种。29.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述表型还包含标志物cd8-和cd4-中的一种或两种。

技术总结
本文公开了获得富含具有表型的T细胞的细胞群体的方法，所述方法包括：(a)从患者的肿瘤样品中获得大量T细胞群体；(b)从所述大量群体中特异性地选择具有包含标志物CD3


技术研发人员：弗兰克
受保护的技术使用者：美国卫生和人力服务部
技术研发日：2021.09.08
技术公布日：2023/8/13