一种胶原水凝胶及其合成方法和应用

1.本发明属于生物材料和组织工程技术领域，具体涉及一种胶原水凝胶及其合成方法和应用。


背景技术：

2.在临床工作中，因外伤、肿瘤、先天发育不全、感染性疾病等导致的骨缺损是骨外科、口腔颌面外科及口腔种植科所面临的挑战，其严重影响着患者的治疗效果及生活质量，因此，如何高效地修复骨缺损是医学、材料学、组织工程学等多学科共同关注的难题。目前，自体骨移植仍是骨缺损修复的最有效的方法之一，但其存在骨供量不足和第二术区等客观缺陷。相较而言，骨替代材料具有来源广、成本低、无第二术区等优势，因而在临床中广泛应用。
3.胶原水凝胶(collagen hydrogel)能够模拟天然细胞外基质，具有良好的生物相容性，是骨替代材料的理想支架。目前，临床应用广泛的仿生胶原-羟基磷灰石复合材料(盖斯特里希医药公司)，其制备方法可参加专利文献cn105358189a，具体包括如下步骤：步骤一、将包含成熟的原生胶原纤维的至少部分纤维化胶原支架浸入饱和ca
2+
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的饱和水溶液中以开始复合植入材料的形成过程，由此在成熟的原生胶原纤维上形成外延生长的纳米晶体，所述外延生长的纳米晶体具有与人骨矿物质相同的形貌和相同的尺寸；步骤二、通过将固体材料与所述水溶液分离、用水清洗和干燥而停止所述复合植入材料的形成过程；步骤三、可选地对来自步骤二的分离的材料进行消毒。
4.然而，基于体内外实验观察，上述的仿生胶原-羟基磷灰石复合材料胶原水凝胶材料的骨再生效果并不理想。其存在以下缺陷：首先，胶原水凝胶自身成骨效能弱。天然的胶原纤维具有独特的蛋白质四级结构，但人工制备的胶原水凝胶因缺乏体内的共价交联以及自组装条件，往往难以维持胶原纤维的四级结构，易被胶原酶降解，导致机械强度显著降低，体内成骨空间维持不足。其次，骨再生过程是由生物材料、骨生成相关细胞以及免疫细胞三者共同作用的复杂过程，其中材料诱导间充质干细胞向骨生成相关细胞分化的能力称为骨诱导性，而材料影响免疫细胞极化进而调节局部微环境的炎症反应的能力称为骨免疫调控性。胶原水凝胶缺乏骨诱导性，无法有效诱导新骨生成，因而体内成骨效率低。
5.因此，目前仍需要寻找一种具有有效诱导新骨生成，且成骨效率高的水凝胶材料。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术涉及的水凝胶材料无法有效诱导新骨生成且体内成骨效率低等问题，本发明将提供一种胶原水凝胶及其合成方法和应用。
7.为实现上述目的，具体包括以下技术方案：
8.一种胶原水凝胶的合成方法，包括如下步骤：
9.(1)鼠尾胶原提取：将鼠尾肌腱分散在缓冲溶液中，再加入醋酸溶液和蛋白酶进行溶解，固液分离后收集上清液；在所述上清液中加入氯化钠溶液进行盐析，固液分离后收集
沉淀物；使用水对沉淀物进行透析后，得到鼠尾胶原；
10.(2)生物源性羟基磷灰石制备：将猪股骨松质骨和水的混合物进行水热反应，固液分离收集骨固体；所述骨固体经过水洗、干燥后进行焙烧，得到生物源性羟基磷灰石；
11.(3)金属有机框架材料合成：将醋酸镁和2,5-二羟基对苯二甲酸溶解于二甲基甲酰胺、无水乙醇和水的混合液中，在真空加热下进行反应，得到金属有机框架材料；
12.(4)将鼠尾胶原的醋酸溶液、生物源性羟基磷灰石、金属有机框架材料混合，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺进行交联反应，得到所述胶原水凝胶。
13.本发明上述的胶原水凝胶由金属有机框架材料、生物源性羟基磷灰石和鼠尾胶原复合形成，本发明的方法不仅可以优化胶原水凝胶的机械强度与力学性能，延缓降解、维持成骨空间；而且赋予胶原水凝胶骨诱导性、骨免疫调控性和促进骨再生的性能。
14.其中，本发明利用鼠尾肌腱提取鼠尾胶原，可以提取到高纯度的ⅰ型胶原，杂质少，且提取方法成熟、简便。
15.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述分散为在1-10℃下摇床震荡10-48h。
16.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(1)中，所述分散为在4℃下摇床震荡24h。
17.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述缓冲溶液为0.05-0.5m的pbs缓冲液。
18.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述鼠尾肌腱分散在缓冲溶液中后，鼠尾肌腱被分解为胶原，以胶原浓度计，鼠尾肌腱浓度为40-50mg/ml。
19.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，鼠尾肌腱、缓冲溶液和醋酸溶液的总质量和蛋白酶的质量之比为(300-600)：1。
20.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(1)中，鼠尾肌腱、缓冲溶液和醋酸溶液的总质量和蛋白酶的质量之比为500：1。
21.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述溶解的温度为1-10℃，所述溶解的时间为2-5天。
22.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(1)中，所述溶解的温度为4℃，所述溶解的时间为3天。
23.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述氯化钠溶液的浓度为2-8m。
24.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(1)中，所述氯化钠溶液的浓度为5m。
25.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，还包括对沉淀物进行3次以上的重复醋酸溶液溶解和氯化钠溶液盐析过程。
26.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述透析的时间为2-10天。
27.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(1)中，所述透析的时间为5天。
28.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，得到的鼠尾胶原利用冷冻进行保存。
29.作为本发明优选的实施方式，步骤(1)中，所述固液分离的方式包括离心，所述离心的速率为8000-10000rpm，所述离心的时间为10-30min。
30.作为本发明优选的实施方式，步骤(2)中，所述水热反应的温度为200-300℃，所述
水热反应的时间为12-48h。
31.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(2)中，所述水热反应的温度为250℃，所述水热反应的时间为24h。
32.作为本发明优选的实施方式，步骤(2)中，所述猪股骨松质骨和水的质量比为1：(40-60)。
33.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(2)中，所述猪股骨松质骨和水的质量比为1：50。
34.作为本发明优选的实施方式，步骤(2)中，所述焙烧的温度为500-1000℃，所述焙烧的时间为1-12h。
35.作为本发明优选的实施方式，步骤(2)中，所述生物源性羟基磷灰石还经过研磨、过筛处理。
36.作为本发明进一步优选的实施方式，所述过筛的目数为0.4-0.7mm。
37.作为本发明优选的实施方式，步骤(3)中，所述醋酸镁和2,5-二羟基对苯二甲酸的摩尔比为1：(0.5-2)。
38.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(3)中，所述醋酸镁和2,5-二羟基对苯二甲酸的摩尔比为1：1。
39.作为本发明优选的实施方式，步骤(3)中，所述二甲基甲酰胺、无水乙醇和水的混合液的体积比为二甲基甲酰胺：无水乙醇：水＝(10-20):(0.5-2):1。
40.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(3)中，所述二甲基甲酰胺、无水乙醇和水的混合液的体积比为二甲基甲酰胺：无水乙醇：水＝15:1:1。
41.作为本发明优选的实施方式，步骤(3)中，所述醋酸镁在二甲基甲酰胺、无水乙醇和水的混合液中的浓度为0.5-1.5mm。
42.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(3)中，所述醋酸镁在二甲基甲酰胺、无水乙醇和水的混合液中的浓度为1mm。
43.作为本发明优选的实施方式，步骤(3)中，所述反应的温度为100-150℃，所述反应的时间为18-48h。
44.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(3)中，所述反应的温度为125℃，所述反应的时间为24h。
45.作为本发明优选的实施方式，步骤(4)中，鼠尾胶原的醋酸溶液中，鼠尾胶原的质量浓度为10-50wt％，醋酸的浓度为0.05-0.5m。
46.作为本发明优选的实施方式，步骤(4)中，鼠尾胶原、生物源性羟基磷灰石、金属有机框架材料、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为鼠尾胶原:生物源性羟基磷灰石:金属有机框架材料:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺:n-羟基琥珀酰亚胺＝(10-50):(5-15):(0.5-1.5):(0.5-1.5):(0.5-1.5)。
47.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(4)中，鼠尾胶原、生物源性羟基磷灰石、金属有机框架材料、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为鼠尾胶原:生物源性羟基磷灰石:金属有机框架材料:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺:n-羟基琥珀酰亚胺＝30:10:(0.5-1):1:1。
48.作为本发明优选的实施方式，步骤(4)中，所述交联反应的温度为1-10℃，所述交
联的时间为3-10h。
49.作为本发明进一步优选的实施方式，步骤(4)中，所述交联反应的温度为4℃，所述交联的时间为6h。
50.本发明采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(nhs)和n-羟基琥珀酰亚胺(edc)交联法(即nhs-edc)，与其它化学交联法相比，其具有无毒、高效的优势。
51.本发明上述的胶原水凝胶不仅具有良好的机械强度与力学性能，延缓降解、维持成骨空间效果较好，而且具有骨诱导性、骨免疫调控性和促进骨再生的性能。
52.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明的胶原水凝胶由金属有机框架、生物源性羟基磷灰石和鼠尾胶原复合形成，本发明的方法不仅可以优化胶原水凝胶的机械强度与力学性能，延缓降解、维持成骨空间；而且赋予胶原水凝胶骨诱导性、骨免疫调控性和促进骨再生的性能，应用在制备骨替材料中具有较大的潜力。
附图说明
53.图1为实施例1中步骤三制得的金属有机框架材料的扫描电镜图。
54.图2为对比例2制得的原水凝胶的扫描电镜图。
55.图3为对比例1制得的负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶的扫描电镜图。
56.图4为对比例2制得的原水凝胶的热失重图。
57.图5为对比例1制得的负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶的热失重图。
58.图6为对比例1制得的负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶及实施例1-2和对比例3制得的胶原水凝胶的实物图。
59.图7为对比例1制得的负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶及实施例1-2和对比例3制得的胶原水凝胶的扫描电镜图。
60.图8为对比例1制得的负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶及实施例1-2和对比例3制得的胶原水凝胶的细胞测试中细胞生存率图。
61.图9为实施例1-2和对比例3制得的胶原水凝胶的热失重图。
具体实施方式
62.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将通过具体实施例对本发明作进一步说明。
63.实施例1
64.步骤一、鼠尾胶原提取：分离鼠尾肌腱于0.1m pbs缓冲液(鼠尾肌腱被分解为胶原，胶原浓度：40-50mg/ml)，4℃摇床震荡24h；加入醋酸溶液溶解(醋酸浓度为0.1m)，辅以索莱宝solarbio(产地：中国，货号：p8160)的胃蛋白酶(胶原-醋酸溶解体系与胃蛋白酶质量比＝500：1)，4℃摇床溶解3天，离心，取上清。加入5m nacl溶液盐析，离心，取沉淀；0.05m醋酸溶液复溶，重复盐析三次；去离子水透析5天；冻干保存。
65.步骤二、生物源性羟基磷灰石制备：取猪股骨松质骨以慢速手机在冷却水的冲洗下切割成约5mm
×
5mm
×
5mm块状，洗净，置于水热反应釜中，加去离子水(固液比1:50)。锁紧反应釜，置于马弗炉中烧至250℃(升温速率10℃/min)，持续24h。取出反应釜，以大量冰水猝冷，待压力释放后开启，取出骨块，以去离子水冲洗，60℃干燥；在800℃(升温速率10℃/
min)下焙烧2h以去除所有有机质，自然冷却，研磨，过筛，备用。
66.步骤三、金属有机框架材料合成：将底物醋酸镁(0.017g，0.08mmol)、2,5-二羟基对苯二甲酸(0.012g，0.08mmol)，溶解于二甲基甲酰胺(67.5ml)与无水乙醇(4.5ml)和去离子水(4.5ml)的混合液(总体积76.5ml，组分配比15：1：1)中。真空加热，125℃反应24h；离心，取沉淀，无水乙醇洗涤3次，37℃干燥。
67.步骤四、0.1m醋酸溶液溶解胶原至30wt％，加入10wt％生物源性羟基磷灰石，加入1wt％金属有机框架材料，以1wt％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和1wt％n-羟基琥珀酰亚胺交联，4℃反应6h，合成负载金属有机框架包覆药物的胶原水凝胶。
68.实施例2
69.与实施例1相比，本实施例的区别在于步骤四中的金属有机框架材料的质量浓度为0.5wt％。
70.对比例1
71.与实施例1相比，本实施例的区别在于步骤四中不加入金属有机框架材料即其质量浓度为0，得到负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶。
72.对比例2
73.与实施例1相比，本实施例的区别在于步骤四中不加入金属有机框架材料和生物源性羟基磷灰石，得到鼠尾胶原水凝胶。
74.对比例3
75.与实施例1相比，本对比例的区别在于步骤四中的金属有机框架材料的质量浓度为2wt％。
76.将材料真空冻干，采用扫描电镜检测金属有机框架材料、实施例1-2和对比例1、3制得的胶原水凝胶样品的形貌结构。由附图1-3和7可知，金属有机框架材料为簇状针样纳米晶体；鼠尾胶原水凝胶样品为三维网状交联结构；负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶为包裹羟基磷灰石颗粒的三维网状交联结构。与对照组相比，金属有机框架材料掺杂后胶原水凝胶出现明显的三维空间结构，随着金属有机框架的掺杂比例提升，孔隙直径降低，数量增多。
77.采用热重分析仪检测实施例1-2样品和对比例1-3制得的材料，如附图4、5和9。热失重测试加热至800℃为止，鼠尾胶原水凝胶样品总质量变化为86.53％，峰起始点为370.4℃；负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶总质量变化为21.21％，峰起始点为437.7℃。本发明的方法制得的胶原水凝胶材料，材料热失重总质量显著降低，峰起始点温度显著升高，且随着金属有机框架材料掺杂浓度提升，材料高温失重减少，材料降解减少。可见，热降解性能优于鼠尾胶原水凝胶和负载生物源性羟基磷灰石的鼠尾胶原水凝胶。
78.使用10ml细胞培养基分别浸泡2ml对比例1、3和实施例1-2材料，5天后获取材料浸提液；使用96孔板培养raw 264.7细胞，分别加入上述实施例和对比例的材料浸提液刺激1天后收样；按照cck-8试剂盒说明书操作(产品名：cell counting kit-8，品牌：dojindo，产地：日本，货号：ck04)，使用酶标仪检测实施例和对比例样品450nm波段紫外光吸收强度，以表征细胞数量和增殖活性。检测对比例1、3和实施例1-2制得的材料刺激后，小鼠单核巨噬细胞系raw 264.7细胞生存率结果如附图8。与未掺杂有机金属框架材料的水凝胶相比，掺杂0.5-1％浓度金属有机框架的胶原水凝胶可以显著促进细胞增殖，但是过量掺杂如掺杂
2％浓度金属有机框架材料制得的胶原水凝胶抑制细胞增殖。
79.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种胶原水凝胶的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)鼠尾胶原提取：将鼠尾肌腱分散在缓冲溶液中，再加入醋酸溶液和蛋白酶进行溶解，固液分离后收集上清液；在所述上清液中加入氯化钠溶液进行盐析，固液分离后收集沉淀物；使用水对沉淀物进行透析后，得到鼠尾胶原；(2)生物源性羟基磷灰石制备：将猪股骨松质骨和水的混合物进行水热反应，固液分离收集骨固体；所述骨固体经过水洗、干燥后进行焙烧，得到生物源性羟基磷灰石；(3)金属有机框架材料合成：将醋酸镁和2,5-二羟基对苯二甲酸溶解于二甲基甲酰胺、无水乙醇和水的混合液中，在真空加热下进行反应，得到金属有机框架材料；(4)将鼠尾胶原的醋酸溶液、生物源性羟基磷灰石、金属有机框架材料混合，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺进行交联反应，得到所述胶原水凝胶。2.如权利要求1所述的胶原水凝胶的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，鼠尾胶原、生物源性羟基磷灰石、金属有机框架材料、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为鼠尾胶原:生物源性羟基磷灰石:金属有机框架材料:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺:n-羟基琥珀酰亚胺＝(10-50):(5-15):(0.5-1.5):(0.5-1.5):(0.5-1.5)。3.如权利要求2所述的胶原水凝胶的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，鼠尾胶原、生物源性羟基磷灰石、金属有机框架材料、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为鼠尾胶原:生物源性羟基磷灰石:金属有机框架材料:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺:n-羟基琥珀酰亚胺＝30:10:(0.5-1):1:1。4.如权利要求1所述的胶原水凝胶的合成方法，其特征在于，包括如下a-d中的至少一项：a、步骤(2)中，所述水热反应的温度为200-300℃，所述水热反应的时间为12-48h；b、步骤(2)中，所述焙烧的温度为500-1000℃，所述焙烧的时间为1-12h；c、步骤(2)中，所述猪股骨松质骨和水的质量比为1：(40-60)；d、步骤(2)中，所述生物源性羟基磷灰石还经过研磨、过筛处理。5.如权利要求1所述的胶原水凝胶的合成方法，其特征在于，包括如下a-c中的至少一项：a、步骤(3)中，所述醋酸镁和2,5-二羟基对苯二甲酸的摩尔比为1：(0.5-2)；b、步骤(3)中，所述二甲基甲酰胺、无水乙醇和水的混合液的体积比为二甲基甲酰胺：无水乙醇：水＝(10-20):(0.5-2):1；所述醋酸镁在二甲基甲酰胺、无水乙醇和水的混合液中的浓度为0.5-1.5mm；c、步骤(3)中，所述反应的温度为100-150℃，所述反应的时间为18-48h。6.如权利要求1所述的胶原水凝胶的合成方法，其特征在于，包括如下a-g中的至少一项：a、步骤(1)中，所述分散为在1-10℃下摇床震荡10-48h；b、步骤(1)中，所述缓冲溶液为0.05-0.5m的pbs缓冲溶液；c、步骤(1)中，鼠尾肌腱、缓冲溶液和醋酸溶液的总质量和蛋白酶的质量之比为(300-600)：1；
d、步骤(1)中，所述溶解的温度为1-10℃，所述溶解的时间为2-5天；e、步骤(1)中，所述氯化钠溶液的浓度为2-8m；f、步骤(1)中，所述透析的时间为2-10天；g、步骤(1)中，所述固液分离的方式包括离心，所述离心的速率为8000-10000rpm，所述离心的时间为10-30min。7.如权利要求1所述的胶原水凝胶的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，鼠尾胶原的醋酸溶液中，鼠尾胶原的质量浓度为10-50wt％，醋酸的浓度为0.05-0.5m。8.如权利要求1所述的胶原水凝胶的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，所述交联反应的温度为1-10℃，所述交联的时间为3-10h。9.权利要求1～8任一项所述的胶原水凝胶的合成方法制得的胶原水凝胶。10.权利要求9所述的胶原水凝胶在制备骨替代材料中的应用。

技术总结
本发明属于生物材料和组织工程技术领域，具体公开一种胶原水凝胶及其合成方法和应用。本发明的胶原水凝胶由金属有机框架材料、生物源性羟基磷灰石和鼠尾胶原复合形成，不仅具有良好的机械强度与力学性能，延缓降解、维持成骨空间效果较好，而且具有骨诱导性、骨免疫调控性和促进骨再生的性能，应用在制备骨替材料中具有较大的潜力。中具有较大的潜力。


技术研发人员：刘泉 邢益菡 钟欣怡 陈卓凡
受保护的技术使用者：中山大学附属口腔医院
技术研发日：2023.06.16
技术公布日：2023/8/13