一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用与流程

1.本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用。


背景技术：

2.近年来针对各种疾病的细胞疗法取得了重大进展，但依旧存在许多挑战，例如作为常规的货架产品，很多细胞产品需要按批进行长期的低温（-80℃）或深低温（-196℃）储存。而且细胞冻存程序大部分依赖程序降温过程以最大程度降低对长期储存前的细胞损伤。而程序降温设备较高，目前很多商业化产品在开发非程序降温细胞冻存液，但冻存效果仍不及程序降温效果理想。因此，迫切需要一种方便快捷的非程序降温的方法及冻存液来实现细胞产品的冻存。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种细胞冻存液及冻存方法。
4.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种细胞冷冻保存的方法，包括如下步骤：步骤1：收获培养的细胞，以富含糖酵解抑制剂的溶液制备细胞悬液孵育，离心收集细胞；步骤2：将步骤1离心收获的细胞，以富含活化肝素的溶液制备细胞悬液孵育，离心收集细胞；步骤3：以dpbs或pbs缓冲液重悬清洗步骤2收集的细胞两次后收集细胞，加入细胞冻存液，混匀后置于-86℃超低温条件下过夜，然后转移至液氮中保存即成。
5.进一步，所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸或6-氨基烟酰胺中的一种；所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-50nm；所述的步骤1中的孵育步骤的温度为37℃，时间为10min；所述的步骤1中的离心步骤的离心力为2000 g，时间为5min。
6.优选地，所述的糖酵解抑制剂为6-氨基烟酰胺。
7.进一步，所述的步骤2中活化肝素由edc和nhs交联活化而成；所述的活化肝素在所述的步骤2中的细胞悬液中的浓度为50-200μg/106个细胞；所述的步骤2中的孵育步骤的温度为室温，时间为15min。
8.所述的活化肝素的制法具体如下：将肝素加入活化edc（浓度为2 mmol/l）、nhs（浓度为5 mmol/l）、2-(n-morpholino)-乙烷磺酸/nacl缓冲液室温孵育15 min（常规化学试剂)，然后向反应体系中加入2-巯基乙醇(终浓度20 mmol/l) 以中止反应，然后通过pbs平衡脱盐柱上脱盐即成。
9.进一步，步骤3中加入细胞冻存液后细胞的浓度为2-20
×
106细胞/ml。
10.进一步，所述的步骤3中的细胞冻存液包括如下组分：dmso 3-10 v/v%，人血白蛋
白8-20w/v%，β-烟酰胺单核苷酸 5-10ug/ml，余量为注射用溶媒。
11.进一步，所述的细胞为干细胞、nk细胞或cik细胞中的至少一种。
12.本发明还提供了一种细胞冻存液，该冻存液包括如下组分：dmso
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3-10v/v%，人血白蛋白
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8-20w/v%，β-烟酰胺单核苷酸
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5-10ug/ml，余量为注射用溶媒。
13.进一步，所述的注射用溶媒为复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、复方右旋糖酐40注射液或注射用生理盐水中的至少一种；所述的注射用溶媒由复方电解质注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液或复方右旋糖酐40注射液按6：4体积比混合而成。
14.本发明还提供了一种冻存细胞，其特征在于：该细胞由权利要求1-6中任一项所述的方法冻存而成。
15.本发明还提供了一种所述的细胞冷冻保存的方法的应用，所述的方法在生物样本库的样本保存、细胞库、细胞药物或类器官保存领域中的应用。
16.相对于现有技术，本发明具有以下优势：本发明创新性提出细胞预处理方式来实现细胞产品的非程序降温冷冻应用。降低细胞代谢是细胞可以长久冷冻保存的关键环节。而在细胞培养结束后，到细胞置于超低温液氮进入深度休眠过程的操作会造成细胞冻存效果的差异，处理不当会造成细胞的深度损伤，导致细胞活力下降或细胞死亡。
17.本发明针对细胞冻存过程进行创新型预处理，以最大程度的降低在细胞进入深低温冻存之前的损伤。第一步，降低细胞代谢，糖酵解是进行细胞代谢最重要的途径，因此通过糖酵解抑制剂进行短时处理，可以使细胞快速进入休眠环境。而合适的浓度又不至于产生过多ros活性氧等物质，从而保护细胞免受过度损伤。第二步，通过活化的肝素对低代谢的细胞进行包裹，活化肝素有抑制体内补体对细胞的杀伤作用，但尚未有报道用于细胞冻存保护。基于这两步预处理，可以使细胞在简单配方中进行非程序降温冻存而保证细胞的高活力。
18.除此之外，细胞收获后冻存的过程本身也需要细胞的清洗过程，而这两步预处理过程同时也具有细胞洗涤的作用，不会增加过多的复杂操作，具有广泛的可应用性。与常规细胞冻存方法相比，能够更好的满足科研以及临床产品需求。
附图说明
19.图1为本发明实施例4所述的对照组细胞活率图；图2为本发明实施例4所述的验证组细胞活率图；图3为本发明实施例4所述的对照组细胞贴壁再生长图：其中a图为4小时，b图为24小时，c图为48小时；图4为本发明实施例4所述的验证组细胞贴壁再生长图：其中a图为4小时，b图为24小时，c图为48小时。
具体实施方式
20.除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
21.一种细胞冷冻保存的方法，包括如下步骤：步骤1：收获培养的细胞，以富含糖酵解抑制剂的溶液制备细胞悬液37℃下孵育10min，离心收集细胞，离心力为2000g，离心时间5min；步骤2：将步骤1离心收获的细胞，以富含活化肝素的溶液制备细胞悬液室温下孵育15min，离心收集细胞；步骤3：以dpbs或pbs缓冲液重悬清洗步骤2收集的细胞两次后收集细胞，加入细胞冻存液，混匀后置于-86℃超低温条件下过夜，然后转移至液氮中保存即成。
22.所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为2-脱氧葡萄糖、3-溴丙酮酸或6-氨基烟酰胺中的一种；所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-50nm。
23.所述步骤2中活化肝素由edc和nhs交联活化而成；所述的活化肝素在所述的步骤2中的细胞悬液中的浓度为50-200μg/106个细胞。
24.步骤3中加入细胞冻存液后细胞的浓度为2-20
×
106细胞/ml。
25.所述的步骤3中的细胞冻存液包括如下组分：dmso 3-10v/v%，人血白蛋白8-20w/v%，β-烟酰胺单核苷酸 5-10ug/ml，余量为注射用溶媒。
26.所述的注射用溶媒为复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、复方右旋糖酐40注射液或注射用生理盐水中的至少一种；所述的注射用溶媒由复方电解质注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液或复方右旋糖酐40注射液按6：4体积比混合而成。
27.下面结合实施例来详细说明本发明。
28.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
29.实施例1：对糖酵解抑制剂的筛选与优化按照三因素三水平的doe实验设计对糖酵解抑制剂的种类、浓度、作用时间以及反应条件进行优化，置于37℃糖酵解抑制剂预处理后以pbs洗涤细胞两次，然后加入冻存液进行非程序降温冻存，细胞置于冰箱前细胞置于室温存放30min加速细胞损伤，以细胞活力分析仪检测细胞活性。细胞冻存液成分为dmso 5%、白蛋白 15%以及勃脉力a：右旋糖酐40按6：4 的混合液体。
30.表1 实验分组设置
31.表2 实验结果
32.spss软件分析可知：k
6-an20
=84.03；k
6-an 50
=91.50；k
6-an 100
= 82.30；极差r
6-an
=9.20；k
细胞2
=84.57；k
细胞10
=86.20；k
细胞20
=87.07；极差r
细胞
=2.50；k
时间5
=84.70；k
时间10
=89.90；k
时间15
= 83.23；极差r
时间
=6.67；其中：r
6-an
＞r
时间
＞r
细胞
，糖酵解抑制物浓度对细胞活力保护影响最大，高浓度反而会破会细胞冻存活力，且超过15min会导致细胞活力降低，而细胞浓度在此过程不影响。
33.最优实验组合为6-氨基烟酰50 nm，作用时间10min，细胞浓度为10
×
106。
34.实施例2：冻存液按照预处理条件的筛选与优化按照三因素三水平的doe实验设计对活化肝素的浓度、作用时间以及细胞浓度三个条件进行优化，活化肝素预处理后以pbs洗涤两次细胞，加入冻存液进行非程序降温冻存，细胞置于冰箱前细胞置于室温存放30min加速细胞损伤，然后细胞置于-80℃冰箱过夜，置于-196℃液氮，冻存一周后以细胞活力分析仪检测细胞活性。对干细胞进行非程序降温冻存，细胞冻存液成分为dmso 5%、白蛋白 15%以及勃脉力a：右旋糖酐40按6：4 的混合液体。
35.表3 doe实验条件设计
36.表4 实验分组情况
37.spss软件分析可知：k
肝素50
=91.23；k
肝素100
=92.70；k
肝素200
=90.43；极差r
肝素
=2.27；k
细胞2
=92.30；k
细胞10
=90.57；k
细胞20
=91.50；极差r
细胞
=1.73；k
时间5
=92.50；k
时间15
=94.77；k
时间30
= 87.10；极差r
时间
=7.67；其中：r
时间
＞r
肝素
＞r
细胞
，长时间作用对细胞保护作用降低，而细胞浓度对细胞最终活力影响最低，活化肝素浓度升高对细胞保护作用降低。
38.最优组合为活化肝素浓度为50ng/ml，作用时间15min，细胞浓度为10
×
106。
39.实施例3：对冻存液组分进行筛选剂的筛选与优化按四因素三水平的doe实验设计对dmso的浓度、白蛋白浓度以及β-烟酰胺单核苷酸以及溶媒四个组分条件进行优化，正常培养收获细胞后，加入冻存液进行非程序降温冻存，细胞浓度为5
×
106ml细胞置于冰箱前细胞置于室温存放30min加速细胞损伤，然后细胞置于-80℃冰箱过夜，置于-196℃液氮，冻存1周后以细胞活力分析仪检测细胞活性。对干细胞进行非程序降温冻存，冻存液为组分按照以下实验分组。
40.表5 doe实验条件设计
41.表6 实验分组情况
42.spss软件分析可知：k
dmso5
=94.90；k
dmso5
=94.37；k
dmso10
=95.10；极差r
dmso
=0.73；k
白蛋白5
=92.30；k
白蛋白10
=90.57；k
白蛋白20
=91.50；极差r
白蛋白
=1.93；k
nmn5
=96.50；k
nmn10
=95.77；k
nmn20
= 92.10；极差r
nmn
=4.4；k
溶媒1
=96.50；k
溶媒2
=95.77；k
溶媒3
= 92.10；极差
溶媒
=0.4；其中：r
nmn
＞r
白蛋白
＞r
dmso
＞r
溶媒
， nmn浓度对细胞冻存活力影响最大，低浓度有保护作用，高浓度会导致细胞损伤。白蛋白含量对细胞活力影响次之；其中溶媒对细胞活力影响基本没有，因此可以考虑实验所用溶媒配比或独立使用。
43.最优组合为dmso体积分数5%；白蛋白体积分数5%；nmn 5ug/ml，以复方电解质溶液做溶媒。
44.实施例4：发明方法的组合验证以实施例1-实施例3筛选最优条件进行发明内容冻存。以商品a（南京三生，亘诺，yb090050）冻存液以及非预处理为对照。收获新鲜培养的间充质干细胞，离心收集细胞后，以6-氨基烟酰含量为 50 nm pbs缓冲液重悬细胞，37℃下孵育10min， 2000g离5min收集细胞；以50ng/ml活化肝素的缓冲液悬液室温下孵育15min，离心收集细胞，以pbs清洗细胞一次；加入细胞冻存液，混匀后置于-86℃超低温条件下过夜，转移至液氮中保存即成，7天后，常规复苏，检测细胞活率。对照组按照产品使用说明书收获细胞后以pbs清洗三次，程序降温冻存。7天后常规复苏，检测细胞活率和细胞贴壁再生长情况（4，24，48h）。重复三组实验，实验结果如下表所示。
45.表7 实验结果
46.结果表明：如表7所示，采用本简化方案的细胞冻存保护方案，细胞复苏后活率高（如图1-图2所示）；细胞再接种后，贴别率高，且24-48h仍保持一定的增殖速度，呈典型的间充质干细胞生长特性（如图3-图4所示）。
47.综上结果表明，本发明所述的方案具有显著的细胞冻存效果。

技术特征：
1.一种细胞冷冻保存的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：收获培养的细胞，以富含糖酵解抑制剂的溶液制备细胞悬液孵育，离心收集细胞；步骤2：将步骤1离心收获的细胞，以富含活化肝素的溶液制备细胞悬液孵育，离心收集细胞；步骤3：以dpbs或pbs缓冲液重悬清洗步骤2收集的细胞两次后收集细胞，加入细胞冻存液，混匀后置于-86℃超低温条件下过夜，然后转移至液氮中保存即成。2.根据权利要求1所述的冷冻保存的方法，其特征在于：所述的步骤1中的糖酵解抑制剂为6-氨基烟酰胺；所述的糖酵解抑制剂在所述的步骤1中的细胞悬液中的浓度为20-50nm；所述的步骤1中的孵育步骤的温度为37℃，时间为5-10min；所述的步骤1中的离心步骤的离心力为2000g，时间为5min。3.根据权利要求1所述的冷冻保存的方法，其特征在于：所述的步骤2中活化肝素由edc和nhs交联活化而成；所述的活化肝素在所述的步骤2中的细胞悬液中的浓度为50-200μg/106个细胞；所述的步骤2中的孵育步骤的温度为室温，时间为10-15min。4.根据权利要求1所述的冷冻保存的方法，其特征在于：步骤3中加入细胞冻存液后细胞的浓度为2-20
×
106细胞/ml。5. 根据权利要求1所述的冷冻保存的方法，其特征在于：所述的步骤3中的细胞冻存液包括如下组分：dmso 3-10 v/v%，人血白蛋白8-20w/v%，β-烟酰胺单核苷酸 5-10ug/ml，余量为注射用溶媒。6.根据权利要求1所述的冷冻保存的方法，其特征在于：所述的细胞为干细胞、nk细胞或cik细胞中的至少一种。7.一种细胞冻存液，其特征在于：该冻存液包括如下组分：dmso
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3-10v/v%，人血白蛋白
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8-20w/v%，β-烟酰胺单核苷酸
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5-10ug/ml，余量为注射用溶媒。8.根据权利要求7所述的细胞冻存液，其特征在于：所述的注射用溶媒为复方电解质注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、复方右旋糖酐40注射液或注射用生理盐水中的至少一种；所述的注射用溶媒由复方电解质注射液与右旋糖酐40葡萄糖注射液或复方右旋糖酐40注射液按6：4体积比混合而成。9.一种权利要求1-6中任一项所述的细胞冷冻保存的方法的应用，其特征在于：所述的方法在生物样本库的样本保存、细胞库、细胞药物或类器官保存领域中的应用。10.一种冻存细胞，其特征在于：该细胞由权利要求1-6中任一项所述的方法冻存而成。

技术总结
本发明提供了一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用。该冷冻方式包括冻存前的糖酵解抑制剂预处理以及活化肝素预处理过程，该冻存液包括如下组分：DMSO、人血白蛋白、β-烟酰胺单核苷酸、以及注射用溶媒。本发明所述细胞冷冻保存方式及保存液可以避免程序降温仪的使用，细胞存活率高。预处理过程具有细胞冷冻保护的功能，提高保存效率。整个过程中全部使用注射剂和药用辅料，具有很高的安全性。具有很高的安全性。具有很高的安全性。


技术研发人员：曹宁 吴康 冀美超 靳明军 张楠
受保护的技术使用者：九天览月生物科技（天津）有限公司
技术研发日：2023.07.13
技术公布日：2023/8/14