一种湖羊多胎性状的鉴定方法

1.本发明涉及生物信息学和遗传学领域，具体涉及一种湖羊多胎性状的鉴定方法。


背景技术：

2.目前绝大多数保种场只能以活体保种的方式进行种质资源保护，精液、卵子、胚胎以及细胞的冷冻保存技术应用场景较少。许多湖羊企业的引种和杂交工作缺乏高通量测序技术的指导，引种和配种工作较为混乱。这种无效化、不科学的工作会大大降低湖羊优势基因频率、严重影响其种质特性与遗传特性。只有结合基因组检测及相应的信息管理规程才能做到更有效、更科学地指导生产。现有的研究对于湖羊优质性状的遗传机制缺乏系统性与深入性的解析，缺乏fecb基因以外其他有效的分子标记。繁殖性状是湖羊育种和生产中的重要的经济性状，然而湖羊优质性状的分子分析还不够深入。例如，对子宫容受性的认识不足、控制湖羊产羔数的遗传机制仍不清楚等。因此，开展优质性状的功能基因挖掘，准确识别湖羊优质性状是很有必要的。bmpr1b基因，即fecb基因，已被鉴定出为绵羊多胎性状的表达基因之一，被多次报道和绵羊、山羊以及其他家畜的生殖有着密切联系；有研究曾报道绵羊血液中bmpr1b蛋白含量与其生殖表现的关联。该研究通过挑选了产单羔的蒙古绵羊、产双羔的蒙古绵羊和产多羔的小尾汉羊，通过mrna反转录-聚合酶链反应测量了不同绵羊品种血液中的bmpr1b蛋白含量，并进行了对比。实验结果表明，产双羔的蒙古羊和产多胎小尾寒羊血中的bmpr1b蛋白浓度均显著高于产单羔的蒙古羊。同时，bmpr1b蛋白含量也与绵羊的年龄有关。在发情期，蒙古羊和小尾寒羊的血液bmpr1b浓度明显高于其他时期。这些数据证实bmpr1b基因及其血液蛋白质浓度与绵羊的生殖性能有关。母系转录因子(glis1)，主要负责编码一个富含脯氨酸的蛋白质，它与kr
ü
ppel-like蛋白的gli和zic基因家族的成员具有高度的同源性。有报道称该基因在胚胎发育特定阶段的发挥着关键作用。同时也有报道指出glis是一种促脂肪沉积因子，它与湖羊以及小尾寒羊尾部脂肪沉积有着很大关联。它主要在绵羊胚胎发育期间，通过影响绵羊中胚层细胞分化，促使绵羊尾部脂肪沉积。glis1基因可以在湖羊体内正常表达并翻译相关蛋白，并作用于湖羊羔羊，影响其胚胎的发育并改变其表型以提高湖羊繁殖力。


技术实现要素：

3.要解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种湖羊多胎性状的鉴定方法，包括通过群体遗传分化法、纯合片段法以及全基因组关联分析，筛选湖羊显著值前5％的snp位点，并取其交集构成湖羊多胎性状特有分子标记数据集；提供一种湖羊多胎性状特异性遗传标签组合包括：湖羊6号染色体第33991142位位点，湖羊6号染色体第33991259位位点，湖羊6号染色体第33991500位位点，湖羊6号染色体第33992536位位点，湖羊6号染色体第34042588位位点，湖羊6号染色体第34122908位位点，湖羊1号染色体第29633384位位点，湖
羊1号染色体第29877711位位点，湖羊1号染色体第29877819位位点；提供一种上述湖羊多胎性状分子标记数据集在鉴定高繁殖力湖羊中的应用，提供一种用于高繁殖力湖羊鉴定的引物，包括：bmpr1b-1引物对、bmpr1b-2引物对、bmpr1b-3引物对、bmpr1b-4引物对、bmpr1b-5引物对、glis1-1引物对和glis1-2引物对。
4.技术方案：一种湖羊多胎性状的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：s1：提取湖羊外周血样本进行简化测序；s2：通过电脑软件进行群体遗传分化法、纯合片段法以及全基因组关联分析，筛选各个方法中显著值前5％的snp位点，snp位点构成特异性snp遗传标签组合，形成鉴定湖羊多胎性状数据集；s4：设计鉴定数据集引物；s4：提取待测湖羊的基因组dna；s5：利用引物对待测湖羊进行pcr扩增并对其产物测序；s6：筛选具有多胎性状遗传标记的湖羊。优选的，所述s1中，简化测序的个体共108只湖羊。优选的，所述s2中，纯合片段法计算了每一个snp位点的f
st
，将f
st
值视为显著值，具体的计算公式为：f
st
为群体分化指数，为群体间等位基因频率的方差，为平均的群体等位基因频率。优选的，所述s2中，纯合片段法计算了每一个在roh片段内snp位点在所有个体中出现的频率作为显著值，并将出现频率在前0.5％的snp位点视为显著性位点。优选的，所述s2中，全基因组关联分析的线性混合模型表达式为：y＝xβ+sα+zu+e，其中，y是得分表型向量；β是包括性别等的固定效应；α是snp的效应；i是微效多基因效应，服从的多元正态分布，g是基于snp标记构建的关系矩阵，是微效多基因方差；e是残差向量，其分布为ⅰ是单位矩阵；x、s和z分别是β、α和i的关联矩阵或向量。优选的，所述s2中，特异性snp遗传标签组合包括：湖羊6号染色体第33991142位位点，湖羊6号染色体第33991259位位点，湖羊6号染色体第33991500位位点，湖羊6号染色体第33992536位位点，湖羊6号染色体第34042588位位点，湖羊6号染色体第34122908位位点，湖羊1号染色体第29633384位位点，湖羊1号染色体第29877711位位点，湖羊1号染色体第29877819位位点。优选的，所述s5中，pcr扩增出包含bmpr1b基因和glis1基因区段特异性snp位点的产物，所述的引物序列包括：bmpr1b-1-f:gcaacacaacacagagata、bmpr1b-1-r:tcaagaagagcagacaaat、bmpr1b-2-f:caccatttgtctgctcttc、bmpr1b-2-r:tgacttccaaccactctat、bmpr1b-3-f:aaagtaaagactgatggct、bmpr1b-3-r:tttttctgcttctgtagaa、bmpr1b-4-f:ctgtatttttgaggctttt、bmpr1b-4-r:tggcactttgtagggattt、bmpr1b-5-f:tttacttagctcctctgat、bmpr1b-5-r:tgtcttctctcttttgttt、glis1-1-f:tttacttagctcctctgat、glis1-1-r:tgtcttctctcttttgttt、glis1-2-f:gatgctaaacatcccacaa、glis1-2-r:agccttaccacttcccaga。
优选的，所述鉴定方法在鉴定湖羊多胎性状中的应用。有益效果：本发明具有以下优点：1、本发明提供了寻找控制产羔数的基因以及相关的snp标记的统计学方法，以及湖羊多胎性特异性snp位点鉴定数据集，为湖羊多胎性状挖掘以及遗传机制解析提供了理论基础；2、本发明中snp位点鉴定数据集可以用于湖羊的人工选择及育种工作，鉴别高繁殖力湖羊。该发明对湖羊繁殖性能的改良具有十分重要的实际应用价值，能够有效提高湖羊经济价值、推动湖羊产业发展。
附图说明
图1为特异性遗传标签组合筛选流程图
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，以下实施例是对本发明的解释而本发明不局限于以下实施例：实施例1.提取湖羊外周血样本进行简化测序简化测序数据包括108只湖羊(公羊27只，母羊81只)，采集上海市嘉定区永辉湖羊保种场核心育种群随机个体，抽提动物外周血以获取外周血，测序文库基于tn5文库原理构建，借助illumina3000测序平台完成。重测序数据由ncbi数据库(登记号prjna624020)下载，共248只绵羊的dna测序数据，包括小尾寒羊、泗水裘皮羊、大尾寒羊、湖羊、滩羊、洼地绵羊、阿勒泰羊、多浪羊、中国美利奴羊(细羊毛)、巴什拜羊、杜泊羊、东弗里斯奶羊、瓦格尔绵羊、萨福克羊、策勒黑羊、芬兰绵羊、乌埃尚绵羊、中国美利奴羊(超细羊毛)、索罗根诺特羊、哥特兰岛绵羊各10只，7只兰群岛绵羊、5只德伦特野羊、20只中东及非洲绵羊，16只亚洲摩弗伦。2.tn5文库构建tn5文库生成的反应体系包含4μl5
×
fastking-rtsupermix预混液、50ngdna、5μltte mix预混液，并用ddh2o将体系补足至50μl。将混合液在55℃下孵育10min，实现dna片段化以及末端剪接。进而对片段化dna纯化处理，进行pcr扩增，该体系包括24μl纯化产物、10μl5
×
tab、5μlppm、5μln5xx、5μln7xx、1μltae，总体积为50μl。pcr程序设定为：72℃单循环9分钟预热，再进行98℃九次循环，每次30秒，最后63℃单循环反应30秒。使用vahtstm dna清洁珠对扩增产物进行长度分选和纯化。3.群体遗传分化法分析从重测序数据中挑选出140只绵羊，通过查阅isheep网站(https://ngdc.cncb.ac.cn/isheep/)，将绵羊按照产单胎和多胎分为两组。产多胎绵羊品种包括：小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、大尾寒羊、多浪羊和杜泊羊，共计70只；产单胎的绵羊品种为滩羊、阿勒泰羊、中国美利奴羊(细毛)、泗水裘皮羊、巴什拜羊、萨福克羊，共计70只。利用vcftools软件中
“‑‑
weir-fst-pop”指令对两个群体进行计算，并通过群体遗传分化指数(f
st
)来代表显著值，具体的计算公式为：)来代表显著值，具体的计算公式为：为群体间等位基因频率的方差，为
平均的群体等位基因频率。在显著值前5％的区段，通过软件注释共得到283个基因。4.纯合片段法分析对湖羊的简化测序数据以及其他六个品种的深度重测序数据进行了纯合片段检测。利用plinkv1.9软件的
“‑‑
homozyg”指令来识别绵羊基因组中的纯合片段，该软件会使用固定snp数量的滑动窗口在基因组中进行扫描与筛选包含连续纯合子的区域。通过计算每一个在roh片段内snp位点在所有个体中出现的频率，并将出现频率在前5％的snp位点视为显著性位点，其中纯合片段法显著值前5％的区段中共富集到142个基因。表1基于纯合片段法观察到湖羊群体中候选基因5.全基因组关联分析使用gramma软件的混合线性模型计算显著值，公式如下所示:y＝xβ+sα+zu+e。y是得分表型向量，β是包括性别等的固定效应；α是snp的效应；u是微效多基因效应，服从的多元正态分布，g是基于snp标记构建的关系矩阵，是微效多基因方差；e是残差向量，其分布为ⅰ是单位矩阵；x、s和z分别是β、α和u的关联矩阵或向量。进而实施两种全基因组关联分：(1)对于重测序数据，以isheep网站(https://ngdc.cncb.ac.cn/isheep/)以及《中国畜禽遗传资源志(羊志)》所记录各品种每胎平均产羔数作为其表型数据，进行全基因组关联分析；(2)对于简化测序数据，以羊场记录各个经产母羊的单胎产羔数作为表型数据进行全基因关联分析。通过该方法共在显著的区段富集到161个基因。6.整合分析对群体遗传分化法、纯合片段法以及全基因组关联分析显著值前5％的位点进行富集，三种方法所得到重叠基因仅包括bmpr1b和glis1。进而汇总在两个基因区段的snp位点，共得到9个特征性snp位点数据集，详见表2。表2湖羊多胎性状分子标记数据集
7.品种验证根据所得snp遗传标记设计对应引物，引物信息见表3，提取待测湖羊血液中的dna样本，利用引物进行pcr扩增，并对pcr产物进行测序验证，即可判断待测湖羊是否具有高产特性。表3引物信息8.繁殖力检测在获得待鉴定湖羊pcr产物后，通过任意测序手段可知其相应位点信息，输入机器学习模型进行判断，即可鉴定是否为高产湖羊。构建机器学习模型通过r语言中的svm()函数进行构建，具体为：model.svm《-svm(x＝trx,y＝factor(as.character(try)),kernel＝"linear",scale＝t)。其中，model.svm为构建的机器学习模型，svm为r语言内置的支持向量机函数，x＝trx代表显著值前9的snp位点作为训练集，trx为输入的模型，y＝factor(as.character(try))代表包含训练集的表型值，即具体品种输入模型，kernel＝"linear"
代表选取"linear"模式的支持向量机，scale＝t表示对变量进行缩放。选取15只高繁殖力品种(平均单胎产羔数在2只以上)湖羊，15只低产湖羊品种(平均单胎产羔数小于2只)进行验证，检验筛选效果效果，通过二代全基因组测序测出待测品种基因序列，抽取其对应本发明中显著值前9的snp位点的数据，输入模型，输出鉴定结果，参见表4。表4筛选结果综上所述，本发明发现了bmpr1b和glis1基因，在湖羊中独有的9个独有的突变位点。该snp数据集有利于提高湖羊繁殖力、改善湖羊品种品质、促进湖羊产业经济发展。结合上述引物设计和pcr技术，可以有效进行湖羊选中选育，为科学指导湖羊育种工作提供理论
依据。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种湖羊多胎性状的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：s1：提取湖羊外周血样本进行简化测序；s2：通过电脑软件进行群体遗传分化法、纯合片段法以及全基因组关联分析，筛选各个方法中显著值前5％的snp位点，snp位点构成特异性snp遗传标签组合，形成鉴定湖羊多胎性状数据集；s4：设计鉴定数据集引物；s4：提取待测湖羊的基因组dna；s5：利用引物对待测湖羊进行pcr扩增并对其产物测序；s6：筛选具有多胎性状遗传标记的湖羊。2.根据权利要求1所述的一种湖羊多胎性状的鉴定方法，其特征在于，所述s1中，简化测序的个体共108只湖羊。3.根据权利要求1所述的一种湖羊多胎性状的鉴定方法，其特征在于，所述s2中，纯合片段法计算了每一个snp位点的f
st
，将f
st
值视为显著值，具体的计算公式为：f
st
为群体分化指数，为群体间等位基因频率的方差，为平均的群体等位基因频率。4.根据权利要求1所述的一种湖羊多胎性状的鉴定方法，其特征在于，所述s2中，纯合片段法计算了每一个在roh片段内snp位点在所有个体中出现的频率作为显著值，并将出现频率在前0.5％的snp位点视为显著性位点。5.根据权利要求1所述的一种湖羊多胎性状的鉴定方法，其特征在于，所述s2中，全基因组关联分析的线性混合模型表达式为：y＝xβ+sα+zu+e，其中，y是得分表型向量；β是包括性别等的固定效应；α是snp的效应；u是微效多基因效应，服从的多元正态分布，g是基于snp标记构建的关系矩阵，是微效多基因方差；e是残差向量，其分布为ⅰ是单位矩阵；x、s和z分别是β、α和u的关联矩阵或向量。6.根据权利要求1所述的一种湖羊多胎性状的鉴定方法，其特征在于，所述s2中，特异性snp遗传标签组合包括：湖羊6号染色体第33991142位位点，湖羊6号染色体第33991259位位点，湖羊6号染色体第33991500位位点，湖羊6号染色体第33992536位位点，湖羊6号染色体第34042588位位点，湖羊6号染色体第34122908位位点，湖羊1号染色体第29633384位位点，湖羊1号染色体第29877711位位点，湖羊1号染色体第29877819位位点。7.根据权利要求1所述的一种湖羊多胎性状的鉴定方法，其特征在于，所述s5中，pcr扩增出包含bmpr1b基因和glis1基因区段特异性snp位点的产物，所述的引物序列包括：bmpr1b-1-f:gcaacacaacacagagata、bmpr1b-1-r:tcaagaagagcagacaaat、bmpr1b-2-f:caccatttgtctgctcttc、bmpr1b-2-r:tgacttccaaccactctat、bmpr1b-3-f:aaagtaaagactgatggct、bmpr1b-3-r:tttttctgcttctgtagaa、bmpr1b-4-f:ctgtatttttgaggctttt、bmpr1b-4-r:tggcactttgtagggattt、bmpr1b-5-f:tttacttagctcctctgat、bmpr1b-5-r:tgtcttctctcttttgttt、glis1-1-f:tttacttagctcctctgat、glis1-1-r:tgtcttctctcttttgttt、glis1-2-f:gatgctaaacatcccacaa、glis1-2-r:agccttaccacttcccaga。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种湖羊多胎性状的鉴定方法，在鉴定湖羊多胎性状中的应用。

技术总结
本发明提供了一种湖羊多胎性状的鉴定方法，具体包括以下步骤：提取湖羊外周血样本进行简化测序；特异性SNP遗传标签组合构成鉴定湖羊多胎性状数据集；设计鉴定数据集引物；提取待测湖羊的基因组DNA；利用引物对待测湖羊进行PCR扩增并对其产物测序；筛选具有多胎性状遗传标记的湖羊。本发明提供了寻找控制产羔数的基因以及相关的SNP标记的统计学方法，以及湖羊多胎性特异性SNP位点鉴定数据集，为湖羊多胎性状挖掘以及遗传机制解析提供了理论基础，同时，本发明中SNP位点鉴定数据集可以用于湖羊的人工选择及育种工作，鉴别高繁殖力湖羊，对湖羊繁殖性能的改良具有十分重要的实际应用价值。应用价值。


技术研发人员：李禹哲 王起山 潘玉春 张哲 王振 曹彩云
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/14