一种产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物、检测方法及应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，尤其是一种产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物、检测方法及应用。


背景技术：

2.益生菌被定义为“活的微生物，当给予足够的量时，会给宿主带来健康益处”，目前已广泛应用于医药、畜牧业和食品领域中。由于益生菌所带来的健康益处具有菌株特异性，因此必须对菌种的定性和定量进行检测，具有重要意义。
3.产马乳酒乳杆菌是发酵乳制品中重要的乳杆菌，包含两个亚种：产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种和产马乳酒乳杆菌高加索亚种。随着其作为新食品原料的应用，其特异性快速检测方法尤为重要。目前国内外乳酸菌的检测方法主要分为传统检测方法和现代分子生物学方法。传统检测方法为平板计数法，该方法是益生菌测定的标准方法，也是在实验室中常用的方法。但是该方法对体系中多种乳杆菌的检测不能区分相关种或亚种，且培养时间长，操作工作量大，对于一些未知或者已知但不能培养的微生物不能计数。随着生物学技术的发展，一些现代分子生物学的方法已经广泛应用于乳酸菌的定量检测。
4.pcr技术又可称为聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)技术，是在引物的引导下通过dna聚合酶对某一特定基因或dna序列进行体外扩增，而实时荧光定量pcr方法是一种在pcr反应体系中加入荧光基团，通过反应过程中对荧光信号积累的实时监测，最终绘制标准曲线对未知模板进行鉴定和定量检测。通过设计特异性引物可实现对目的基因的特异性扩增，该方法具有区分细菌菌株的鉴别能力。实时荧光定量技术解决了传统技术不能解决的困惑，具有特异性强、定位精准和重现性好等优点，但是应用在产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的引物、鉴定等还未见报道，而随着该亚种在食品及药品中的广泛应用，对其特异性检测鉴定的工作迫在眉睫。
5.现有技术中有如下两篇与本发明申请相关的专利公开文献，具体为：
6.1、实时荧光定量pcr检测乳酸菌luxs基因的引物组及其应用(cn 113151525b)，本发明涉及一种实时荧光定量pcr检测乳酸菌luxs基因(s-核糖基同型半胱氨酸裂解酶基因产物，luxs基因是ai-2信号分子合成的标志性基因)的引物组，包括用于检测乳酸菌内参基因的引物对和用于检测乳酸菌luxs基因的引物对，乳酸菌包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌，内参基因为dp3d(dna polymeraseⅲ,delta subunit)。本发明的引物组在制备实时荧光定量pcr检测乳酸菌luxs基因试剂盒中的应用，可以较为准确地反应三种菌共培养时ai-2信号分子合成情况。
7.2、一种发酵乳制品中嗜热链球菌实时荧光定量引物对及其应用(cn 108893549a)，本发明涉及一种发酵乳制品中嗜热链球菌()实时荧光定量引物对及其应用。所述发酵乳制品中嗜热链，球菌实时荧光定量引物对是根据嗜热链球菌的16s rna的保守序列片段进行设计和筛选，检测结果显示只有嗜热链球菌扩增出了目的条带，表明该引
物对具有嗜热链球菌特异性。
8.鉴于此，本发明拟建立一种快速检测产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的方法，为产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的特异性定性和定量提供一种新的快速特异性检测方法。


技术实现要素：

9.本发明的目的是通过提出一种产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物、检测方法及应用，以解决上述背景技术中提出的缺陷。
10.本发明采用的技术方案如下：
11.提供一种产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，
12.所述上游引物的基因序列为：5
’‑
tctaataacgtgcccatagc-3’；
13.所述下游引物的基因序列为：5
’‑
actggtgattggatatggtt-3’。
14.作为本发明的一种优选技术方案：所述特异性引物是根据产马乳酒乳杆菌的产马乳酒亚种zw3的全基因组序列进行设计筛选的，所述特异性引物的扩增目的片段为224bp。
15.一种以产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物建立产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的实时荧光定量pcr检测方法，包含如下步骤：
16.步骤一：使用dna提取试剂盒提取菌株的dna；
17.步骤二：以步骤一中提取的dna为模板，利用上游引物和下游引物进行实时荧光定量pcr；
18.步骤三：以反应过程中出现荧光信号即相对荧光强度的初始循环数cq值为判断标准，当cq值≤30时，判断为阳性，认为样品中含有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种，反之，则认为不含有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种作为本发明的一种优选技术方案：具体步骤如下：利用筛选的产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的特异性引物对，应用实时荧光定量pcr方法建立以cq值为纵坐标，菌株活菌数的对数为横坐标的标准曲线，通过检测未知模板的cq值以对产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种进行鉴定和定量检测。
19.作为本发明的一种优选技术方案：所述步骤二中实时荧光定量pcr的反应体系为20～50μl，其中sybr green qpcr mix 10～25μl，上、下游引物各0.5～1μl，模板dna 1～2μl，ddh2o补齐至体积20～50μl；反应条件为，95℃预变性3min后进入循环，95℃变性5s、60℃退火和延伸30～34s，40～45个循环，在每个循环末收集荧光信号即相对荧光强度。
20.一种以产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物建立产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的实时荧光定量pcr检测方法在产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的快速特异性检测中的应用。
21.本发明提供的产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物、检测方法及应用，与现有技术相比，有益效果是：
22.1、本发明通过对产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种模式菌株产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种zw3的全基因组序列进行特异性引物的筛选，该引物具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点，结合实时荧光定量pcr法可以实现产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的快速、定性、定量检测，与传统的检测方法相比，本发明建立的方法省时省力，具有良好的应用前景。
23.2、本发明方法应用该引物对，结合实时荧光定量pcr方法可以对产马乳酒乳杆菌
产马乳酒亚种进行快速地特异性定性、定量检测。该方法，特异性强，灵敏度高，重复性好，建立的标准曲线方程为r2≥0.95，具有良好的线性关系，且在产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种和混合体系中可以特异性检出。
24.3.本发明建立的方法为产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的特异性定性和定量提供一种新的快速特异性检测方法。
25.通过对比，本发明专利与现有技术中的同类引物，本发明专利通过产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的全基因组学分析设计筛选特异性引物，分析方法更全面，得到的引物特异性更强。
附图说明
26.图1为本发明中zw3-count特异性验证琼脂糖凝胶电泳图；其中，m为marker，条带从上到下依次5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、800bp、500bp和300bp，1～5号泳道为植物乳植杆菌；6～8号泳道为产马乳酒乳杆菌高加索亚种；9号泳道为唾液链球菌嗜热亚种；10～11号泳道为产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种；12～14号泳道为德氏乳杆菌保加利亚亚种；15号泳道为负对照；
27.图2为本发明中马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种实时荧光定量pcr检测的标准曲线图；其中，且绘制的标准曲线的斜率为-2.671，标准曲线方程为y＝-2.671x+30.719，相关系数r2为0.965；
28.图3为本发明中产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的pcr扩增结果图；其中，m为marker，条带从上到下依次为8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，1号泳道为产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种；
29.图4为本发明中产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的荧光扩增曲线图；其中，该图为产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种zw3；
30.图5为本发明中含有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的乳酸菌混合菌粉及纯产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种菌粉的荧光扩增曲线图；其中，1-2为纯产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种菌粉的扩增曲线图，3-4为产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种混合菌粉的扩增曲线图。
具体实施方式
31.需要说明的是，在不冲突的情况下，本实施例中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
33.一种产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物为：zw-count-f，其基因序列为：5
’‑
tctaataacgtgcccatagc-3’；所述下游引物为：zw-count-r，其基因序列为：5
’‑
actggtgattggatatggtt-3’。
34.较优地，所述引物是根据产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种模式菌株产马乳酒乳杆菌
24d型电泳槽可以为北京六一仪器厂；超微量分光光度计可以为biodrop；全自动凝胶成像仪、c1000tm荧光定量pcr仪可以为美国bio-rad公司。
51.实施例1
52.产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种特异性引物设计，具体步骤如下：
53.通过产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种与德氏乳杆菌保加利亚亚种、唾液链球菌嗜热亚种、嗜酸乳杆菌、植物乳植杆菌、发酵粘液乳杆菌、罗伊氏粘液乳杆菌和干酪乳杆菌的16s rdna序列及其他基因序列对比，找出序列相差较大的片段，通过primer 5.0数据分析后得到以下引物见下表1。
54.表1zw3的引物序列
[0055][0056]
实施例2
[0057]
引物验证实验，具体步骤如下：
[0058]
提取的植物乳植杆菌，产马乳酒乳杆菌高加索亚种，德氏乳杆菌保加利亚亚种，德氏乳杆菌保加利亚亚种等的全基因组dna，利用筛选的特异性引物进行pcr扩增，然后进行电泳实验，对特异性引物进行验证，验证结果如图1所示，除了产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种外，其余菌株均在224bp处无明显条带，可得该引物的特异性较好，可进行荧光定量pcr。
[0059]
实施例3
[0060]
实时荧光定量pcr的灵敏性检测和重复性检测，具体步骤如下：
[0061]
(1)灵敏度验证：将zw3的dna浓度稀释至10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml，0.001μg/ml，0.0005μg/ml和0.0001μg/ml共7个浓度进行荧光定量pcr检测反应体系的灵敏度，结果如表2所示，nct组的cq平均值为31.74，为了保证实验数据的可信度，因此选择cq≤30时为阳性检出。在浓度为0.001μg/ml，cq值为29.87，因此本实验方法最低可以检测浓度为0.001μg/ml。
[0062]
表2灵敏度测试结果
[0063][0064]
(2)重复性验证：以20μg/ml，2μg/ml，0.2μg/ml，0.02μg/ml，0.002μg/ml五个不同dna浓度产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的进行重复性实验，实验结果见表3，对所得的cq值进行统计学分析。产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的5个质量浓度样品的cq值的标准偏差(sd)在0.05～0.23之间，相对标准偏差(rsd)在0.26％～0.95％之间，均小于1％，在可接受范围内，因此，建立的实时荧光pcr检测体系具有较好的重复性。
[0065]
表3重复性实验结果
[0066][0067][0068]
实施例4
[0069]
标准曲线的建立，具体步骤如下：
[0070]
以产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的10-7
，10-6
，10-5
，10-4
，10-3
，10-2
，10-1
，100cfu/ml的十倍连续稀释液作为反应模板，建立标准曲线。标准曲线如图2所示。以产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种已知量的不同菌数对数值[lg(cfu/g)]为横坐标,采用产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种特异性基因引物扩增,以反应过程中出现荧光信号的初始循环数(cq)为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程，y＝-2.671x+30.719,r2为0.965，该曲线具有良好的线性关系。
[0071]
实施例5
[0072]
其他产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的验证，具体步骤如下：
[0073]
(1)提取产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种zw3的细菌dna，经超微量分光光度计检测dna浓度较高，a260/a280的值均在1.8-2.0之间，说明dna提取浓度较高，其他杂质污染较少，纯度较高，满足后续实验要求。
[0074]
(2)将产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种特异性引物与步骤(1)中提取的dna结合进行pcr实验，将pcr反应结果进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳实验，结果如图3所示，该菌株在224bp处有明显的条带。
[0075]
(3)将产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的特异性引物与该菌株的dna进行荧光定量pcr反应，由扩增曲线图4可得，该菌株有明显的“s”型扩增曲线，表明该特异性引物具有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种特异性，且建立的实时荧光定量pcr方法可以特异性的检测该亚种。
[0076]
实施例6
[0077]
对含有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种复合益生菌菌粉样品的验证，具体步骤如下所示：
[0078]
(1)对含有保加利亚菌粉、唾液链球菌嗜热亚种菌粉和产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种zw3菌粉的混合体系进行检测，其中三种菌的混合质量比例为1：1：1，提取混合菌粉dna。
[0079]
(2)将产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的特异性引物与步骤(1)中提取的dna进行荧光定量pcr反应，由扩增曲线图5可得，结果均有明显的扩增曲线，表明添加其他菌粉不影响目标菌株的检出，所建立的实时荧光定量pcr方法可以特异性的检测该亚种。
[0080]
其中，上述各实施例中关于利用特异性引物建立产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的
实时荧光定量pcr检测方法，包含如下步骤：
[0081]
(1)使用dna提取试剂盒提取菌株的dna；
[0082]
(2)以步骤(1)中提取的dna为模板，利用特异性引物zw-count-f、zw-count-r进行实时荧光定量pcr；
[0083]
所述实时荧光定量pcr的反应体系为20～50μl，其中sybr green qpcr mix 10～25μl，上、下游引物各0.5～1μl，模板dna 1～2μl，ddh2o补齐至体积20～50μl；反应条件为，95℃预变性3min后进入循环，95℃变性5s、60℃退火和延伸30～34s，40～45个循环，在每个循环末收集荧光信号即相对荧光强度；
[0084]
(3)以反应过程中出现荧光信号即相对荧光强度的初始循环数cq值为判断标准，当cq值≤30时，判断为阳性，认为样品中含有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种，反之，则认为不含有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种。
[0085]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一种产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物，其特征在于：所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列为：5
’‑
tctaataacgtgcccatagc-3’；所述下游引物的基因序列为：5
’‑
actggtgattggatatggtt-3’。2.根据权利要求1所述的产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物，其特征在于：所述特异性引物是根据产马乳酒乳杆菌的产马乳酒亚种zw3的全基因组序列进行设计筛选的，所述特异性引物的扩增目的片段为224bp。3.一种以权利要求1或2所述的产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物建立产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的实时荧光定量pcr检测方法，包含如下步骤：步骤一：使用dna提取试剂盒提取菌株的dna；步骤二：以步骤一中提取的dna为模板，利用上游引物和下游引物进行实时荧光定量pcr；步骤三：以反应过程中出现荧光信号即相对荧光强度的初始循环数cq值为判断标准，当cq值≤30时，判断为阳性，认为样品中含有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种，反之，则认为不含有产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种。4.根据权利要求3所述的以产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物建立产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于：具体步骤如下：利用筛选的产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的特异性引物对，应用实时荧光定量pcr方法建立以cq值为纵坐标，菌株活菌数的对数为横坐标的标准曲线，通过检测未知模板的cq值以对产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种进行鉴定和定量检测。5.根据权利要求3所述的以产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物建立产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于：所述步骤二中实时荧光定量pcr的反应体系为20～50μl，其中sybrgreen qpcrmix10～25μl，上、下游引物各0.5～1μl，模板dna1～2μl，ddh2o补齐至体积20～50μl；反应条件为，95℃预变性3min后进入循环，95℃变性5s、60℃退火和延伸30～34s，40～45个循环，在每个循环末收集荧光信号即相对荧光强度。6.如权利要求3-5任一项所述的以产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物建立产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的实时荧光定量pcr检测方法在产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的快速特异性检测中的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种用特异性引物、检测方法及应用，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物ZW-count-F；所述下游引物ZW-count-R。本发明通过对产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种模式菌株产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种ZW3的全基因组序列进行特异性引物的筛选，该引物具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点，结合实时荧光定量PCR法可以实现产马乳酒乳杆菌产马乳酒亚种的快速、定性、定量检测，与传统的检测方法相比，本发明建立的方法省时省力，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：王艳萍 吕厚姣 耿伟涛
受保护的技术使用者：海泰合加（天津）信息科技有限公司
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/16