一种玫瑰酶解抗氧化活性物质初提方法

醋酸钠作为缓冲体系的水溶解，得到质量浓度为5％蛋白酶-纤维素酶混合酶液；
14.步骤(b)、称取玫瑰原料并粉碎；选用玫瑰为干花时，混和气保护并低温粉碎至40目以上；其中混和气组分为：n2：50％、co2：30％、h2：20％；粉碎温度：4℃；选用玫瑰为湿花时，则进行组织捣碎；
15.步骤(c)、按每克玫瑰花加入2-14mg蛋白酶-纤维素酶混合物的比例，料液比为1:10-1:50加入步骤(a)配制的蛋白酶-纤维素酶混合酶液；
16.步骤(d)、程序变温酶解1h；变温程序为：温度达到4℃保持15min-加温至酶解温度保持15min-降温至4℃，温度变化5-10℃/min，变温处理周期4-6个；其中酶解温度根据所选蛋白酶-纤维素酶混合物来确定酶解温度；酶解完成后升温至65℃持续30s，使酶失活，得到酶失活溶液；
17.步骤(e)、将上述酶失活溶液置于超声波仪内，在超声波仪的频率350
±
50mhz、恒温25℃下，进行2-8个周期的超声提取，每周期5min；
18.步骤(f)、将超声后的溶液离心，收集其上清液；所述的上清液即为富含抗氧化活性物质的玫瑰肽初提物。
19.步骤1中所述的玫瑰为花瓣、花蕊和叶片中的一种或者几种的组合；玫瑰为新鲜原料，或者玫瑰为脱水原料，所述的脱水原料是烘干型或冻干型脱水原料。
20.玫瑰为脱水原料时，需要在混和气保护下低温粉碎至40目以上；玫瑰为新鲜原料时，需要进行组织捣碎。
21.由于采用了上述方案，以下为本发明有益效果及优点：
22.1、本发明提供的以水为溶剂，采用超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取法，不使用乙醇、石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂，生产工艺简单，生成安全环保，使用时无有机溶剂带来的风险，在工业生产等应用领域范围更宽广。
23.2、本发明提供的提取法所选玫瑰可以是花瓣、花蕊、叶片等。既可以是新鲜原料，也可以是烘干或冻干型原料。
24.3、本发明提供的提取法提取的玫瑰花抗氧化活性物质提取物，基本达到或接近乙醇萃提法的抗氧化活性，并远优于水提法。
25.4、以水为溶剂，采用超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取法获得的提取物无毒，环保，是真正具有功能性的绿色产品。兼具经济、活性高等优点，具有广泛的应用前景。
附图说明
26.图1是本发明的方法流程图。
27.图2(a)是本发明超声周期时间(min)对玫瑰花瓣dpph自由基、羟自由基清除能力的影响图。
28.图2(b)是本发明超声周期数对玫瑰花瓣dpph自由基、羟自由基清除能力的影响图。
29.图2(c)是本发明蛋白酶-纤维素酶混合物用量对玫瑰花瓣dpph自由基、羟自由基清除能力的影响图。
30.图2(d)是本发明料液比(g/ml)对dpph自由基、羟自由基清除能力的影响图。
31.图3(a)是本发明醇提型、水提型与超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提型粗提物
dpph自由基清除活性对比图。
32.图3(b)是本发明醇提型、水提型与超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提型粗提物羟自由基清除活性对比图。
33.图4(a)是本发明不同浓度(稀释倍数)醇提花瓣粗提物图。
34.图4(b)是本发明不同浓度(稀释倍数)超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提花瓣粗提物图。
具体实施方式
35.下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
36.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
37.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
38.一些重要生化实验方法说明如下：
39.1.1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)自由基清除能力测定
40.实验组：将样品稀释至合理浓度，dpph溶液用95％乙醇稀释至0.1mm，加入40μl样品至0.5ml离心管中；对照组：阴性组加入40μl对应样品缓冲液，阳性组加入40μl0.1mg/ml维生素c(vc)水溶液至0.5ml离心管中，向每管中加入200μl浓度0.1mm dpph溶液，混合均匀，避光反应30min于50℃恒温水浴锅中，每组设置三个平行孔，反应完毕后，每管取150μl至96孔酶标板中，测定各组样品在517nm的吸光度值。按下面公式计算dpph自由基清除率：
41.dpph自由基清除率(％)＝(1-a
实验组
/a
对照组
)
×
100％
42.其中，a
实验组
为实验组吸光度值，a
对照组
为阴性对照组吸光度值。
43.2.羟自由基(
·
oh)清除能力测定
44.提前制备2mm新鲜feso4溶液，0.1％h2o2溶液，把用95％乙醇配制好的100mm1,10-邻菲啰啉(op)用超纯水稀释至2mm。实验组：向0.5ml离心管中加入40μlfeso4溶液，40μl2mmop溶液，80μl样品溶液，最后加入40μl0.1％的h2o2溶液；损伤组：80μl超纯水替换样品；空白组：40μl超纯水代替0.1％的h2o2溶液。颠倒混匀，于37℃避光反应60min，各组均需设置3个平行管。反应完毕后，取150μl混合样品至酶标板中，测定各组在536nm处的吸光度值。按下面公式羟自由基清除率：
45.羟自由基清除率(％)＝[(a
实验组-a
损伤组
)/(a
空白组-a
损伤组
)]
×
100％
[0046]
其中，a
实验组
为实验组吸光度值，a
损伤组
为损伤组吸光度值，a
空白组
为空白组吸光度值。
[0047]
3.醇提法(烘干型花瓣、冻干型花瓣)
[0048]
粉碎处理，花瓣与50％乙醇的料液比为1:40g/ml。50℃浸提花瓣，60℃浸提花蕊各三次，2h/次，离心，收集上清；5℃，9500rpm离心10min，收集上清；水浴温度：48℃；旋转蒸发冷凝温度:-5℃，负压:-0.092mpa，转速：50
→
100
→
200rpm，逐渐增加，防止爆沸；15min左右/组，蒸至无乙醇味即可。
[0049]
4.水提法(烘干型花瓣、冻干型花瓣)
[0050]
粉碎处理，花瓣与水料液比为1:40g/ml。50℃浸提花瓣，60℃浸提花蕊各三次，2h/次，离心，收集上清；
[0051]
5.人真皮成纤维细胞(hdf)的培养
[0052]
人真皮成纤维细胞完全培养基(v/v)：90％dmem基础培养基+10％bi胎牛血清+1％双抗溶液。
[0053]
接种细胞悬液至96孔板中(200μl/孔)，每孔约5000个细胞，在96孔板最外周加一圈磷酸缓冲液(pbs)，培养12h。实验组：向200μl完全培养基中给予特定浓度(稀释倍数)玫瑰样品，分别处理细胞24h和48h，加入含有10％细胞计数试剂盒-8(cck-8)中的无血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(dmem)基础培养基。空白组：加入200μl细胞培养液、药物、cck-8溶液但无细胞；对照组：加入相应量细胞、细胞培养液、cck-8溶液但无药物；在培养箱中继续培养1-4h，使用多功能酶标仪测定450nm处吸光度值，计算细胞存活率。
[0054]
存活率＝[a实验组-a空白组]/[a对照组-a空白组]
×
100％
[0055]
a实验组为实验组吸光度值，a空白组为空白组吸光度值，a对照组为对照组吸光度值。
[0056]
实施例1：本发明方法是：以水为溶剂，采用超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取法进行粗提的方法；步骤包括：
[0057]
步骤1、玫瑰-蛋白酶-纤维素酶混合物制备；
[0058]
步骤2、酶解；
[0059]
步骤3、超声提取；
[0060]
步骤4、离心，收集上清粗提物。
[0061]
具体操作步骤为：
[0062]
步骤(a)、称取蛋白酶-纤维素酶混合物，其质量比为1:2.5；用ph值为4-5的醋酸-醋酸钠作为缓冲体系的水溶解，得到质量浓度为5％蛋白酶-纤维素酶混合酶液；
[0063]
步骤(b)、称取玫瑰原料并粉碎；选用玫瑰为干花时，混和气保护并低温粉碎至40目以上；其中混和气组分为：n2：50％、co2：30％、h2：20％；粉碎温度：4℃；选用玫瑰为湿花时，则进行组织捣碎；
[0064]
步骤(c)、按每克玫瑰花加入2-14mg蛋白酶-纤维素酶混合物的比例，料液比为1:10-1:50加入步骤(a)配制的蛋白酶-纤维素酶混合酶液；
[0065]
步骤(d)、程序变温酶解1h；变温程序为：温度达到4℃保持15min-加温至酶解温度保持15min-降温至4℃，温度变化5-10℃/min，变温处理周期4-6个；其中酶解温度根据所选蛋白酶-纤维素酶混合物来确定最佳酶解温度；酶解完成后升温至65℃持续30s，使酶失活，得到酶失活溶液；
[0066]
步骤(e)、将上述酶失活溶液置于超声波仪内，在超声波仪的频率350
±
50mhz、恒温25℃下，进行2-8个周期的超声提取，每周期5min；
[0067]
步骤(f)、将超声后的溶液离心，收集其上清液；所述的上清液即为富含抗氧化活性物质的玫瑰肽初提物。
[0068]
步骤1中所述的玫瑰为花瓣、花蕊和叶片中的一种或者几种的组合；玫瑰为新鲜原料，或者玫瑰为脱水原料，所述的脱水原料是烘干型或冻干型脱水原料；并且玫瑰优选脱水原料，更优选为脱水花瓣。
[0069]
玫瑰为脱水原料时，需要在混和气保护下低温粉碎至40目以上；玫瑰为新鲜原料时，需要进行组织捣碎。
[0070]
实施例2：超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物酶解干燥玫瑰花瓣抗氧化活性物的提
取工艺，超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取烘干型、冻干型玫瑰花瓣有效成分(n＝3)。
[0071]
将干燥玫瑰花进行粉碎处理至60目。称取适量蛋白酶-纤维素酶混合物(质量比1:2.5)，用ph值约为4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，得到蛋白酶-纤维素酶混合物液。酶与玫瑰花用量比为：2-14mg/g，配成料液比为1:10-1:50g/ml的玫瑰-蛋白酶-纤维素酶混合物混合物。程序变温酶解1h。变温程序为：温度达到4℃保持15min-加温至45℃保持15min-降温至4℃，温度变化5-10℃/min，变温处理周期4个。酶解完成后升温至65℃持续30s，使酶失活。在频率400mhz、恒温25℃下，将上述溶液进行不同时长和次数的超声提取。离心，收集各上清液即得本发明所述的粗提物。
[0072]
如图2(a)是本发明超声周期时间(min)对玫瑰花瓣dpph自由基、羟自由基清除能力的影响图。在一定范围内dpph和羟自由基清除活性随超声时间延长而升高。时间越长，物质溶出越多，抗氧化活性越高。但时间继续延长，可能受到热、光等因素影响导致活性物质分解，抗氧化活性降低。10min即可达自由基清除最峰值(dpph自由基清除活性：烘干花瓣：74
±
2％；冻干花瓣：77
±
3％；
·
oh自由基清除活性：烘干花瓣：53
±
7％；冻干花瓣：57
±
3％)。
[0073]
如图2(b)是本发明超声周期数对玫瑰花瓣dpph自由基、羟自由基清除能力的影响图。随超声周期的增加，产物的dpph和羟自由基清除活性逐渐上升，但当继续提高超声周期，自由基清除活性升高不显著。浸提四次(每次超声时长5min)所得产物抗氧化活性已达较优水平(dpph自由基清除活性：烘干花瓣：71
±
5％；冻干花瓣：72
±
7％；
·
oh自由基清除活性：烘干花瓣：57
±
9.％；冻干花瓣：58
±
3％)。
[0074]
如图2(c)是本发明蛋白酶-纤维素酶混合物用量对玫瑰花瓣dpph自由基、羟自由基清除能力的影响图，在一定程度上随蛋白酶-纤维素酶混合物用量的增加，产物的dpph和羟自由基清除活性而上升。因为当底物充足时，在一定范围内酶促反应效率与酶浓度成正比。但当继续增大蛋白酶-纤维素酶混合物的用量，底物不足，因此酶促反应效率不再增加。蛋白酶-纤维素酶混合物用量达10mg/g玫瑰花瓣时，超声辅助下所得产物有较优抗氧化活性(dpph自由基清除活性：烘干花瓣：65
±
3％；冻干花瓣：67
±
5％；
·
oh自由基清除活性：烘干花瓣：51
±
9％；冻干花瓣：56
±
3％)。
[0075]
如图2(d)是本发明料液比(g/ml)对dpph自由基、羟自由基清除能力的影响图，在一定范围内dpph和羟自由基清除活性随所加溶剂体积升高而升高。体积越大，原料与水接触面积增大，传质推动力升高，物质的抗氧化活性越高。但若体积过大，溶出的物质过少，引起产物抗氧化活性降低且溶剂浪费；体积若过小，物质溶出不彻底，产物的抗氧化活性也不高。花瓣与水料液比为1:30时即可达最优溶出量(dpph自由基清除活性：烘干花瓣：76
±
5％；冻干花瓣：76
±
3％；
·
oh自由基清除活性：烘干花瓣：53
±
9％；冻干花瓣：60
±
3％)。
[0076]
实施例3：醇提法、水提法与超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物法提取的粗提物抗氧化活性比较，醇提法、水提法与超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物法提取不同干燥类型玫瑰花瓣所得粗提物的抗氧化活性分析(n＝3)。
[0077]
操作步骤同实施例2，玫瑰花瓣按料液比1:30g/ml，经10mg/g蛋白酶-纤维素酶和玫瑰花混合物程序酶解1h后，在25℃，超声频率400mhz条件下超声4个周期，每周期5min，9500rpm离心10min，收集上清。
[0078]
对比醇提法、水提法与超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物法三种提取方法提取出
的不同干燥类型的玫瑰花瓣粗提物。在有效成分均为最大得率的条件下对比各清除dpph、羟自由基的活性。图3(a)为醇提型、水提型与超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提型粗提物dpph自由基清除活性对比；图3(b)为醇提型、水提型与超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提型粗提物羟自由基清除活性对比，从上述图中的结果显示，虽然醇提法比水提法所得粗提物抗氧化活性高，但与经超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取的粗提物抗氧化活性(dpph：烘干花瓣：58.65
±
2.65％；冻干花瓣：64.49
±
3.57％；
·
oh：烘干花瓣：55.62
±
2.78％；冻干花瓣：60.49
±
3.56％)升高，且与醇提(dpph：烘干花瓣：63.58
±
0.85％；冻干花瓣：67.06
±
1.95％；
·
oh：烘干花瓣：64.59
±
3.75％；冻干花瓣：67.65
±
2.50％)差异较小，可见提升水提物的抗氧化活性可以通过超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物的方法改进。
[0079]
实施例4：醇提法与超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物法提取的冻干花瓣粗提物对人真皮成纤维细胞(hdf)增殖的影响，醇提花瓣与超声辅助蛋白酶-纤维素酶法提花瓣对hdf细胞增殖的影响(n＝3)。
[0080]
醇提法与超声辅助蛋白酶-纤维素酶法操作步骤同实施例2和3。利用醇提法与超声辅助蛋白酶-纤维素酶法提取的冻干花瓣粗提物分别培养人真皮成纤维细胞，通过cck-8法进行检验细胞存活率检测。结果如图4(a)和图4(b)所示，与对照组(达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基dmem)相比，在一定范围内添加了不同浓度(稀释倍数)醇提法与超声辅助纤维素酶法的组对hdf细胞的增殖无明显抑制作用。cck-8结果显示，醇提法在浓度低于稀释200倍的范围内对hdf细胞增殖影响没有显著性，图4(a)为不同浓度(稀释倍数)醇提花瓣；说明此稀释倍数范围内对hdf为安全实验浓度；超声辅助蛋白酶-纤维素酶法在浓度低于稀释50倍的范围内对hdf细胞增殖影响没有显著性，图4(b)为不同浓度(稀释倍数)超声辅助蛋白酶-纤维素酶法提花瓣，说明此稀释倍数范围内对hdf为安全实验浓度。可见，醇提样品对细胞的增殖抑制性比超声辅助蛋白酶-纤维素酶法样品强。

技术特征：
1.一种玫瑰酶解抗氧化活性物质初提方法，其特征是，以水为溶剂，采用超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取法进行粗提的方法；步骤包括：步骤1、玫瑰-蛋白酶-纤维素酶混合物制备；步骤2、酶解；步骤、超声提取；步骤4、离心，收集上清粗提物。2.根据权利要求1所述的一种玫瑰酶解抗氧化活性物质初提方法，其特征是：具体步骤为：步骤(a)、称取蛋白酶-纤维素酶混合物，其质量比为1:2.5；用ph值为4-5的醋酸-醋酸钠作为缓冲体系的水溶解，得到质量浓度为5％蛋白酶-纤维素酶混合酶液；步骤(b)、称取玫瑰原料并粉碎；选用玫瑰为干花时，混和气保护并低温粉碎至40目以上；其中混和气组分为：n2：50％、co2：30％、h2：20％；粉碎温度：4℃；选用玫瑰为湿花时，则进行组织捣碎；步骤(c)、按每克玫瑰花加入2-14mg蛋白酶-纤维素酶混合物的比例，料液比为1:10-1:50加入步骤(a)配制的蛋白酶-纤维素酶混合酶液；步骤(d)、程序变温酶解1h；变温程序为：温度达到4℃保持15min-加温至酶解温度保持15min-降温至4℃，温度变化5-10℃/min，变温处理周期4-6个；其中酶解温度根据所选蛋白酶-纤维素酶混合物来确定酶解温度；酶解完成后升温至65℃持续30s，使酶失活，得到酶失活溶液；步骤(e)、将上述酶失活溶液置于超声波仪内，在超声波仪的频率350
±
50mhz、恒温25℃下，进行2-8个周期的超声提取，每周期5min；步骤(f)、将超声后的溶液离心，收集其上清液；所述的上清液即为富含抗氧化活性物质的玫瑰肽初提物。3.根据权利要求1或2所述的一种玫瑰酶解抗氧化活性物质初提方法，其特征是：步骤1中所述的玫瑰为花瓣、花蕊和叶片中的一种或者几种的组合；玫瑰为新鲜原料，或者玫瑰为脱水原料，所述的脱水原料是烘干型或冻干型脱水原料。4.根据权利要求3所述的一种玫瑰酶解抗氧化活性物质初提方法，其特征是：玫瑰为脱水原料时，需要在混和气保护下低温粉碎至40目以上；玫瑰为新鲜原料时，需要进行组织捣碎。

技术总结
一种玫瑰酶解抗氧化活性物质初提方法，属于一种玫瑰活性物质初提方法。以水为溶剂，采用超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取法进行粗提的方法；步骤包括：步骤1、玫瑰-蛋白酶-纤维素酶混合物制备；步骤2、酶解；步骤、超声提取；步骤4、离心，收集上清粗提物。优点：以水为溶剂，采用超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取法，不使用乙醇、石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂，生产工艺简单，生成安全环保，使用时无有机溶剂带来的风险，在工业生产等应用领域范围更宽广。以水为溶剂，采用超声辅助蛋白酶-纤维素酶混合物提取法获得的提取物无毒，环保，是真正具有功能性的绿色产品。兼具经济、活性高等优点，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。


技术研发人员：何海伦 肖栋 彭雨旸 唐珂 刘丹 陈奕丹 李文钊
受保护的技术使用者：中国矿业大学
技术研发日：2023.06.14
技术公布日：2023/8/16