基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法

1.本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法。


背景技术：

2.电化学发光是由电极表面反应所引发的暗场光辐射。通过电极对含发光分子和共反应剂的体系施加一定的电化学信号(电压或电流)，发光分子和共反应剂在电极表面反应产生的中间体通过进一步的化学反应生成激发态的发光分子。激发态的发光分子跃迁回基态，并产生光辐射。因此，电化学发光具有免光激发、背景低、灵敏度高等优点。三级胺分子是最常见的共反应剂之一。分别以三(2,2'-联吡啶)钌(ii)(ru(bpy)
32+
)和三正丙胺(tpra)作为发光分子和共反应剂的体系是应用最广泛的电化学发光体系，且基于该体系的电化学发光免疫分析仪已在临床上实现了一百多种疾病标志物靶标分子的高灵敏检测。
3.在电化学发光免疫分析仪的原理如下：抗原抗体通过免疫反应形成夹心结构，其中一个抗体上标记了ru(bpy)
32+
；通过直径为2.8μm磁微球将免疫夹心结构分离到电极表面，然后加入tpra，施加一个合适的电压，发光探针就能够产生发光信号。因为ru(bpy)
32+
固定于磁微球表面，所以只有tpra在电极表面发生电化学反应，产生的三正丙胺阳离子自由基(tpra
+
·
)扩散到磁微球表面与ru(bpy)
32+
反应生成激发态并产生光信号。因此，在电化学发光免疫分析中，tpra
+
·
的寿命对检测的性能影响有巨大的影响。较长寿命能够使tpra
+
·
扩散较远的距离，与更多的ru(bpy)
32+
反应产生更强的光信号，从而提高检测的灵敏度。
4.然而，胺阳离子自由基寿命的测量非常困难，因为自由基的寿命非常短(微秒级)且由三级胺分子氧化产生阳离子自由基的反应非常复杂。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法。该方法测量装置简单、测量时间短，对研究电化学发光机理、研发新型高效共反应剂及提高电化学发光检测性能具有重要的意义。
6.本发明所采用的具体技术方案如下：
7.本发明提供了一种基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，具体如下：
8.s1：将表面修饰有发光分子的微球固定到电极表面，作为工作电极；
9.s2：将待测的三级胺分子溶于电解质溶液中，得到待测溶液；
10.s3：将所述工作电极、参比电极和对电极浸没到所述待测溶液中，同时施加电位，通过电化学反应和化学反应使微球表面的发光分子发光，随后停止施加电位，在该过程中记录发光信号；当光强衰减到背景信号值所需的时间即为待测的三级胺分子所对应的阳离子自由基的寿命。
11.作为优选，所述发光分子为三(2,2'-联吡啶)钌(ii)及其衍生物中的一种。
12.作为优选，所述微球为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球或者磁微球，直径为1-10μm。
13.作为优选，所述发光分子通过酰胺化反应修饰到微球表面，过程具体如下：
14.表面氨基化的微球与羧基官能团修饰的三(2,2'-联吡啶)钌(ii)或表面羧基化的微球与氨基官能团修饰的三(2,2'-联吡啶)钌(ii)反应，通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基。
15.作为优选，所述步骤s1中，表面修饰有发光分子的微球通过滴涂法固定到电极表面；所述电极为金电极、铂电极、玻碳电极或氧化铟锡电极。
16.作为优选，所述电解质溶液为0.2m、ph 7.4的磷酸缓冲液；所述待测溶液中三级胺分子的浓度为100mm。
17.作为优选，所述步骤s3中，通过计时电流法施加电位1.0v-1.5v；参比电极和对电极分别为银/氯化银电极和铂电极。
18.作为优选，所述发光信号通过光子计数器或光电倍增管记录，光子计数器或者光电倍增管通过ttl外触发信号实现与电信号的同步测量，发光信号测量的时间间隔为50μs。
19.ru(bpy)
32+
固定于微球表面时，电化学发光的反应机理如下，
20.r
→r+
·
+e-ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
21.r
+
·
→r·
+h
+
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0022][0023][0024][0025]
r、r
+
·
、r
·
和p分别三级胺、三级胺阳离子自由基、三级胺自由基和三级胺自由基的反应副产物。r在电极表面被氧化为r
+
·
(方程1)，r
+
·
脱质子生成r
·
(方程2)。接着，r
·
将ru(bpy)
32+
还原为ru(bpy)
3+
(方程3)，r
+
·
将ru(bpy)
3+
氧化为激发态ru(bpy)
32+*
(方程4)。最后，ru(bpy)
32+*
跃迁回基态并辐射光子(方程5)。当对体系施加电位时，通过方程1-5产生激发态发光分子并辐射光子。停止施加电位后，电极表面电化学反应终止，即方程1终止，由方程2-5产生激发态发光分子并辐射光子。又因为ru(bpy)
32+*
的寿命为几百纳秒，远低于r
+
·
的寿命(微秒级)，所以，停止施加电位后，发光持续的时间即为r
+
·
存在的时间，即其寿命。
[0026]
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
[0027]
1、本发明提供的方法检测迅速、便捷；2、该方法所需的仪器装置简单、价格较低；3、该方法是一种全新的测量三级胺阳离子自由基寿命的方法；4、该方法对研究电化学发光机理、研发新型高效共反应剂、提高电化学发光检测性能具有重要意义。
附图说明
[0028]
图1为氨基聚苯乙烯微球表面修饰ru(bpy)
32+
的示意图；
[0029]
图2为电化学信号和光学信号同步测量装置示意图；
[0030]
图3为实施例1中电化学发光信号随时间变化的曲线；
[0031]
图4为实施例2中电化学发光信号随时间变化的曲线；
[0032]
图5为实施例3中电化学发光信号随时间变化的曲线。
具体实施方式
[0033]
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
[0034]
本发明提供了一种基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，该方法具体如下：
[0035]
(1)将发光分子修饰到微球表面，并将微球固定到电极表面，该电极作为工作电极。
[0036]
在实际应用时，发光分子可以采用三(2,2'-联吡啶)钌(ii)及其衍生物中的一种；微球直径为1-10μm，微球为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球或者磁微球。发光分子通过酰胺化反应修饰到微球表面，即表面氨基化的微球与羧基官能团修饰的三(2,2'-联吡啶)钌(ii)或表面羧基化的微球与氨基官能团修饰的三(2,2'-联吡啶)钌(ii)反应，通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)活化羧基。
[0037]
在实际应用时，修饰有发光分子的微球通过滴涂法固定到电极表面，该电极可以采用金电极、铂电极、玻碳电极或氧化铟锡电极中的一种。
[0038]
(2)将待测的三级胺分子溶于电解质溶液中，该三级胺分子为电化学发光的共反应剂。
[0039]
在实际应用时，电解质溶液优选采用0.2m、ph 7.4的磷酸缓冲液；且待测溶液中三级胺分子的浓度为100mm。
[0040]
(3)将工作电极、参比电极和对电极浸没到该电解质溶液中，对电极体系(由工作电极、参比电极和对电极共同组成)施加电位，通过电化学反应和化学反应使微球表面的发光分子发光。
[0041]
在实际应用时，通过计时电流法施加电位，根据所使用的电极，施加的电位范围为1.0v-1.5v；参比电极和对电极分别为银/氯化银(饱和kcl)电极和铂电极。
[0042]
(4)停止施加电位；同时在施加电位和停止施加电位后的整个过程中，通过光子计数器或光电倍增管记录发光信号。
[0043]
在实际应用时，光子计数器或者光电倍增管通过ttl外触发信号实现与电信号的同步测量，且发光信号测量的时间间隔为50μs。
[0044]
(5)当光强衰减到背景信号值所需的时间即为待测的三级胺分子所对应的阳离子自由基的寿命。
[0045]
下面将通过实施例对本发明方法进行具体说明和效果验证。
[0046]
实施例1
[0047]
如图1所示，将直径为3.8μm的氨基聚苯乙烯微球(psb)和羧基化的ru(bpy)
32+
混合，通过酰胺化反应得到表面修饰了ru(bpy)
32+
的聚苯乙烯微球(ru-psb)。将含ru-psb的溶液滴加到氧化铟锡电极表面，待溶剂蒸发后，ru-psb即可吸附固定在电极表面。采用三电极体系，氧化铟锡电极、铂丝、银/氯化银(饱和kcl)电极作为工作电极、对电极和参比电极；使用计时电流法施加+1.5v的电压；电解质溶液为含有100mm三正丙胺的0.2m的pb溶液。
[0048]
如图2所示，工作电极水平放置，将中间有圆孔的方形聚合物薄膜粘贴于工作电极
表面，作为电解池。电解液滴加于聚合物圆孔中，将参比电极和铂丝插入电解液中。通过电化学工作站施加电位，以光子计数探测器(位于工作电极上方)和光子计数器记录光信号，并通过ttl信号同步电化学和光学测量。记录停止施加电位后，光强衰减至背景所需的时间即为三级胺阳离子自由基的寿命。如图3所示，通过发光强度随时间的变化曲线可得三正丙胺阳离子自由基的寿命为241μs，该数值与文献(j.am.chem.soc.2002,124,14478
–
14485)中报道的三正丙胺阳离子自由基的寿命相符，证明了本发明的可靠性与准确性。
[0049]
实施例2
[0050]
将直径为3.8μm的氨基聚苯乙烯微球(psb)和羧基化的ru(bpy)
32+
混合，通过酰胺化反应得到表面修饰了ru(bpy)
32+
的聚苯乙烯微球(ru-psb)。将含ru-psb的溶液滴加到玻碳电极表面，待溶剂蒸发后，ru-psb即可吸附固定在电极表面。采用三电极体系，玻碳电极、铂丝、银/氯化银(饱和kcl)电极作为工作电极、对电极和参比电极；使用计时电流法施加+1.2v的电压；电解质溶液为含有100mm 2-(二丁氨基)乙醇的0.2m的pb溶液。
[0051]
如图2所示，工作电极水平放置，将中间有圆孔的方形聚合物薄膜粘贴于工作电极表面，作为电解池。电解液滴加于聚合物圆孔中，将参比电极和铂丝插入电解液中。通过电化学工作站施加电位，以光子计数探测器和光子计数器记录光信号，并通过ttl信号同步电化学和光学测量。记录停止施加电位后，光强衰减至背景所需的时间即为三级胺阳离子自由基的寿命。如图4所示，通过发光强度随时间的变化曲线可得2-(二丁氨基)乙醇阳离子自由基的寿命为134μs。
[0052]
实施例3
[0053]
将直径为2.8μm的二氧化硅微球和ru(bpy)
32+
混合，二氧化硅微球表面带负电荷，ru(bpy)
32+
通过静电吸附作用修饰到二氧化硅微球表面。将ru(bpy)
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修饰的二氧化硅微球滴加到玻碳电极表面，待溶剂蒸发后，微球即可吸附固定在电极表面。采用三电极体系，玻碳电极、铂丝、银/氯化银(饱和kcl)电极作为工作电极、对电极和参比电极；使用计时电流法施加+1.2v的电压；电解质溶液为含有100mm n-丁基二乙醇胺的0.2m的pb溶液。
[0054]
如图2所示，工作电极水平放置，将中间有圆孔的方形聚合物薄膜粘贴于工作电极表面，作为电解池。电解液滴加于聚合物圆孔中，将参比电极和铂丝插入电解液中。通过电化学工作站施加电位，以光子计数探测器和光子计数器记录光信号，并通过ttl信号同步电化学和光学测量。记录停止施加电位后，光强衰减至背景所需的时间即为三级胺阳离子自由基的寿命。如图5所示，通过发光强度随时间的变化曲线可得2-(二丁氨基)乙醇阳离子自由基的寿命为100μs。
[0055]
本发明方法新颖、装置简单、测量耗时短，对研究电化学发光机理、研发新型高效共反应剂、提高电化学发光检测性能具有重要意义。
[0056]
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，其特征在于，具体如下：s1：将表面修饰有发光分子的微球固定到电极表面，作为工作电极；s2：将待测的三级胺分子溶于电解质溶液中，得到待测溶液；s3：将所述工作电极、参比电极和对电极浸没到所述待测溶液中，同时施加电位，通过电化学反应和化学反应使微球表面的发光分子发光，随后停止施加电位，在该过程中记录发光信号；当光强衰减到背景信号值所需的时间即为待测的三级胺分子所对应的阳离子自由基的寿命。2.根据权利要求1所述的基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，其特征在于，所述发光分子为三(2,2'-联吡啶)钌(ii)及其衍生物中的一种。3.根据权利要求1所述的基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，其特征在于，所述微球为聚苯乙烯微球、二氧化硅微球或者磁微球，直径为1-10μm。4.根据权利要求1所述的基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，其特征在于，所述发光分子通过酰胺化反应修饰到微球表面，过程具体如下：表面氨基化的微球与羧基官能团修饰的三(2,2'-联吡啶)钌(ii)或表面羧基化的微球与氨基官能团修饰的三(2,2'-联吡啶)钌(ii)反应，通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐活化羧基。5.根据权利要求1所述的基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，其特征在于，所述步骤s1中，表面修饰有发光分子的微球通过滴涂法固定到电极表面；所述电极为金电极、铂电极、玻碳电极或氧化铟锡电极。6.根据权利要求1所述的基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，其特征在于，所述电解质溶液为0.2m、ph 7.4的磷酸缓冲液；所述待测溶液中三级胺分子的浓度为100mm。7.根据权利要求1所述的基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，其特征在于，所述步骤s3中，通过计时电流法施加电位1.0v-1.5v；参比电极和对电极分别为银/氯化银电极和铂电极。8.根据权利要求1所述的基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，其特征在于，所述发光信号通过光子计数器或光电倍增管记录，光子计数器或者光电倍增管通过ttl外触发信号实现与电信号的同步测量，发光信号测量的时间间隔为50μs。

技术总结
本发明公开了一种基于时间分辨电化学发光测量三级胺阳离子自由基寿命的方法，属于分析化学领域。该方法包括：S1：将表面修饰有发光分子的微球固定到电极表面，作为工作电极；S2：将待测的三级胺分子溶于电解质溶液中，得到待测溶液；S3：将工作电极、参比电极和对电极浸没到待测溶液中，同时施加电位，通过电化学反应和化学反应使微球表面的发光分子发光，随后停止施加电位，在该过程中记录发光信号；当光强衰减到背景信号值所需的时间即为待测的三级胺分子所对应的阳离子自由基的寿命。本发明方法新颖、装置简单、测量耗时短，对研究电化学发光机理、研发新型高效共反应剂、提高电化学发光检测性能具有重要意义。光检测性能具有重要意义。光检测性能具有重要意义。


技术研发人员：苏彬 王亚锋 杨倩
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.06.12
技术公布日：2023/8/16