一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路及制备方法

tcaacatcagtctgataagctatcctcagcgcgtaggtactaatagcttatcagactgaa tcctacgc-3'；所述发夹h1序列为：5'-bhq1-tcaacatcagtctgataagctagtaacccggttagcttatcagactga-fam-3'；所述发夹h2序列为：5'-fam-ctgataagctaaccgggttacactgatgttgagtaacccggttagctt-bhq1-3'；所述发夹h3序列为：5'-accgggttactcaacatcagttagcttatcagactgatgttgagtaac-3'；所述1
×
nebuffer缓冲液配方为：50mm nacl、10mm tris-hcl、10mm mgcl2、1mm二硫苏糖醇，ph 7.9；所述expar电路可以自循环，其以发夹dna为扩增模板，其扩增产物作为tbcha电路的燃料链；所述tbcha电路可以自循环，其以y形dna纳米结构的组装输出荧光信号。
7.上述一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路的制备方法包括以下步骤：1)将1μl目标mirna、1.25μl 10mm dntps、1～2μl 5μm发夹dna混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液a液；将1～3μl 5u/μl klenow片段、1.5～3.5μl 10u/μlnb.bbvci切刻酶混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液b液；(2)将25μl扩增均相反应溶液a液与25μl扩增均相反应溶液b液混匀，得到expar反应混合物，而后将expar反应混合物置于37℃金属浴中反应30～70min；(3)待步骤(2)反应结束后，将反应混合物转移至80℃金属浴中反应20min，再加入发夹h1、发夹h2和发夹h3，用1
×
nebuffer缓冲液补液至100μl，得到样品溶液，而后将样品溶液置于37℃金属浴中反应30～70min；(4)待步骤(3)反应结束后，将样品溶液进行荧光检测；其中，所述扩增均相反应溶液a液和扩增均相反应溶液b液需在冰上制备；所述样品溶液中发夹h1、发夹h2和发夹h3的摩尔比为1：1：1。
8.上述一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路在制备检测mirna-21的产品中的应用。
9.本发明的显著优点在于：(1)本发明的前端expar电路基于发夹dna模板的构型转变实现扩增，降低了非特异扩增的可能并对目标物进行指数型信号放大，极大地提高了检测的灵敏度；(2)本发明经前端expar电路输出的扩增产物可进入expar电路循环，因此由极微量的目标物引发后即可得到大量扩增产物，实现信号放大；(3)本发明利用tbcha电路组装y形dna纳米结构，将两种修饰有荧光基团与猝灭基团的dna发夹探针集中在局部范围内；(4)本发明中随着y形dna纳米结构组装完成，置换出的启动链可进入tbcha电路循环，实现信号放大；(5)本发明与传统的检测方法相比，无需昂贵的仪器设备、复杂耗时的样品预处理
以及熟练的操作人员，更加方便经济。
附图说明
10.图1为本发明的构建流程示意图。
11.图2为实施例1中本发明用于检测目标物的可行性分析荧光响应图。
12.图3为实施例2中加入不同浓度的目标物后的灵敏度荧光响应图。
13.图4为实施例3中加入不同干扰物与目标物的选择性荧光响应图。
具体实施方式
14.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但下述的实例不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
15.本发明以下实施例中所涉及的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路(expar-tbcha)，包括指数扩增电路(expar电路)及三支催化发夹组装电路(tbcha电路)，所述expar电路包括扩增均相反应溶液a液及扩增均相反应溶液b液，所述tbcha电路包括发夹h1、发夹h2及发夹h3；所述扩增均相反应溶液a液包括目标mirna、发夹dna、dntps、1
×
nebuffer缓冲液及超纯水；所述扩增均相反应溶液b液包括nb.bbvci切刻核酸内切酶、klenow片段(3'
→
5'exo-)、1
×
nebuffer缓冲液及超纯水；所述目标mirna序列为5'-uagcuuaucagacugauguuga-3'；所述发夹dna序列为5'-tcaacatcagtctgataagctatcctcagcgcgtaggtactaatagcttatcagactgaa tcctacgc-3'；所述发夹h1序列为5'-bhq1-tcaacatcagtctgataagctagtaacccggttagcttatcagactga-fam-3'；所述发夹h2序列为5'-fam-ctgataagctaaccgggttacactgatgttgagtaacccggttagctt-bhq1-3'；所述发夹h3序列为5'-accgggttactcaacatcagttagcttatcagactgatgttgagtaac-3'；所述1
×
nebuffer缓冲液配方为：50mm nacl、10mm tris-hcl、10mm mgcl2、1mm二硫苏糖醇，ph 7.9。
16.实施例1一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路的制备及其在检测mirna中的可行性分析，具体步骤如下(以mirna-21为目标物进行可行性分析)：(1)将1μl mirna-21(0nm或100nm)、1.25μl 10mm dntps、1.5μl 5μm发夹dna混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液a液；将2μl 5u/μlklenow片段(3'
→
5'exo-)、3μl 10u/μlnb.bbvci切刻酶混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液b液。
17.(2)将25μl扩增均相反应溶液a液与25μl扩增均相反应溶液b液混匀，得到体积为
50μl的expar反应混合物，将expar反应混合物置于37℃金属浴中反应50min。
18.(3)待步骤(2)反应结束后，将反应混合物转移至80℃金属浴中反应20min以灭活klenow片段(3'
→
5'exo-)及nb.bbvci切刻酶，再向混合物中加入发夹(所述发夹选自h1、h2、h3中的一种或多种)，用1
×
nebuffer缓冲液补液至100μl，得到样品溶液，所述样品溶液中各发夹的含量均为100nm；将样品溶液于37℃金属浴中反应60min。
19.(4)待步骤(3)反应结束后，将样品溶液转移至荧光比色皿中，用cary eclipse荧光分光光度计记录样品经488nm激发波长激发后，500～650nm范围内的荧光强度。
20.如图2所示的5条荧光曲线分别为a：由目标物启动后expar-tbcha电路的荧光信号、b：未经目标物启动的expar-tbcha电路的荧光信号、c：发夹h1、h2与h3所产生的背景荧光信号d：发夹h1、h2所产生的背景荧光信号；e：发夹h1所产生的背景荧光信号。从图2中可以看出，当目标物不存在时，无法检测到明显增强的荧光信号(图2，曲线b、c、d和e)，只有当目标物存在时才会产生明显增强的荧光信号(图2，曲线a)，说明expar-tbcha电路具有较低的背景信号，只有在目标物存在并启动expar-tbcha电路后，才能出现显著增强的荧光信号，达到检测目的，该结果证明实验可行。
21.实施例2一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路用于检测不同浓度mirna的灵敏度分析，具体步骤如下(以mirna-21为目标物进行灵敏度分析)：(1)将1μl不同浓度mirna-21(0，1fm，100fm，10pm，1nm，100nm，500nm)、1.25μl 10mm dntps、1.5μl 5μm发夹dna混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液a液；将2μl 5u/μl klenow片段(3'
→
5'exo-)、3μl 10u/μlnb.bbvci切刻酶混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液b液。
22.(2)将25μl扩增均相反应溶液a液与25μl扩增均相反应溶液b液混匀，得到体积为50μl的expar反应混合物，将expar反应混合物置于37℃金属浴中反应50min。
23.(3)待步骤(2)反应结束后，将反应混合物转移至80℃金属浴中反应20min以灭活klenow片段(3'
→
5'exo-)及nb.bbvci切刻酶，再向混合物中加入发夹h1、发夹h2和发夹h3，用1
×
nebuffer缓冲液补液至100μl，得到样品溶液，所述样品溶液中各发夹的含量均为100nm；将样品溶液于37℃金属浴中反应60min。
24.(4)待步骤(3)反应结束后，将样品溶液转移至荧光比色皿中，用cary eclipse荧光分光光度计记录样品经488nm激发波长激发后，500～650nm范围内的荧光强度。
25.如图3所示的荧光光谱图显示了expar-tbcha电路体系中目标物浓度与荧光强度变化之间的关系。图3表明，expar-tbcha电路体系中的荧光强度随着目标物浓度的升高而逐渐增加。
26.实施例3一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路用于检测不同mirna的特异性能力分析，具体步骤如下(以mirna-21为目标物进行特异性能力分析)：(1)将1μl100nm不同mirna(选自mirna-21、mirna-429、mirna-141、mis-1、mis-2、mis-3中的任意一种)、1.25μl 10mm dntps、1.5μl 5μm发夹dna混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液a液；将2μl 5u/μl klenow片段(3'
→
5'exo-)、3μl 10u/μlnb.bbvci切刻酶混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液b
液。
27.其中，所述mirna-429序列：5'-uaauacugucugguaaaaccgu-3'；所述mirna-141序列：5'-uaacacugucugguaaagaugg-3'；所述mis-1序列：5'-uagcuuaucagacugaucuuga-3'；所述mis-2序列：5'-uagcuuaucagacagaucuuga-3'；所述mis-3序列：5'-uagcuuuucagacagaucuuga-3'。
28.(2)将25μl扩增均相反应溶液a液与25μl扩增均相反应溶液b液混匀，得到体积为50μl的expar反应混合物，将expar反应混合物置于37℃金属浴中反应50min。
29.(3)待步骤(2)反应结束后，将反应混合物转移至80℃金属浴中反应20min以灭活klenow片段(3'
→
5'exo-)及nb.bbvci切刻酶，再向混合物中加入发夹h1、发夹h2和发夹h3，用1
×
nebuffer缓冲液补液至100μl，得到样品溶液，所述样品溶液中各发夹的含量均为100nm；将样品溶液于37℃金属浴中反应30～70min。
30.(4)待步骤(3)反应结束后，将样品溶液转移至荧光比色皿中，用cary eclipse荧光分光光度计记录样品经488nm激发波长激发后，500～650nm范围内的荧光强度。
31.结果如图4所示，与mirna-21完全不同序列的非同源干扰物mirna-429、mirna-141存在时，无法检测到明显增强的荧光信号，说明非同源的mirna基本无法激活expar-tbcha电路；mis-1的存在会引起体系荧光强度的较大变化；mis-2会引起程度明显低于mis-1的荧光强度的变化；mis-3仅能引起体系荧光强度的轻微变化。表明非同源干扰物基本不会引发体系荧光强度的变化，且即使在仅有1个错配碱基的mis-1充当目标物时，体系荧光强度也明显低于mirna-21为目标物时所产生的荧光强度，当错配碱基数增加到3个时，对体系荧光强度的影响几乎可忽略。以上结果证明，expar-tbcha电路具有良好的选择性。
32.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，其特征在于：所述核酸电路包括指数扩增电路和三支催化发夹组装电路；所述指数扩增电路包括扩增均相反应溶液a液和扩增均相反应溶液b液；所述三支催化发夹组装电路包括发夹h1、发夹h2和发夹h3；所述扩增均相反应溶液a液包括目标mirna、发夹dna、dntps、1
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nebuffer缓冲液和超纯水；所述扩增均相反应溶液b液包括nb.bbvci切刻核酸内切酶、klenow片段、1
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nebuffer缓冲液和超纯水；所述目标mirna序列为5'-uagcuuaucagacugauguuga-3'；所述发夹dna序列为：5'-tcaacatcagtctgataagctatcctcagcgcgtaggtactaatagcttatcagactgaatcctacgc-3'；所述发夹h1序列为：5'-bhq1-tcaacatcagtctgataagctagtaacccggttagcttatcagactga-fam-3'；所述发夹h2序列为：5'-fam-ctgataagctaaccgggttacactgatgttgagtaacccggttagctt-bhq1-3'；所述发夹h3序列为：5'-accgggttactcaacatcagttagcttatcagactgatgttgagtaac-3'。2.根据权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，其特征在于：所述1
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nebuffer缓冲液配方为：50mm nacl、10mm tris-hcl、10mm mgcl2、1mm二硫苏糖醇，ph 7.9。3.根据权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，其特征在于：所述指数扩增电路可以自循环，其以发夹dna为扩增模板，其扩增产物作为三支催化发夹组装电路的燃料链。4.根据权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路，其特征在于：所述三支催化发夹组装电路可以自循环，其以y形dna纳米结构的组装输出荧光信号。5.如权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将1μl目标mirna、1.25μl 10mm dntps、1~2μl 5μm发夹dna混匀，用1
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nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液a液；将1~3μl 5u/μl klenow片段、1.5~3.5μl 10u/μl nb.bbvci切刻酶混匀，用1
×
nebuffer缓冲液补液至25μl，得到扩增均相反应溶液b液；（2）将25μl扩增均相反应溶液a液与25μl扩增均相反应溶液b液混匀，得到expar反应混合物，而后将expar反应混合物置于37℃金属浴中反应30~70min；（3）待步骤（2）反应结束后，将反应混合物转移至80℃金属浴中反应20min，再加入发夹h1、发夹h2和发夹h3，用1
×
nebuffer缓冲液补液至100μl，得到样品溶液，而后将样品溶液置于37℃金属浴中反应30~70min；（4）待步骤（3）反应结束后，将样品溶液进行荧光检测。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述扩增均相反应溶液a液和扩增均相反应溶液b液需在冰上制备。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述样品溶液中发夹h1、发夹h2和发夹h3的摩尔比为1：1：1。8.如权利要求1所述的一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路在制备检测mirna-21的产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种指数扩增反应-三支催化发夹组装级联的核酸电路及制备方法。所述核酸电路包括指数扩增电路（EXPAR电路）及三支催化发夹组装电路（TBCHA电路），所述EXPAR电路包括扩增均相反应溶液A液、扩增均相反应溶液B液，所述TBCHA电路包括发夹H1、发夹H2及发夹H3。所述扩增均相反应溶液A液包括目标miRNA、发夹DNA、dNTPs、1


技术研发人员：陈宪 赵益萍 刘佳鑫
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/16