一种化学发光纳米探针及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种化学发光纳米探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.化学发光是物质在进行氧化还原化学反应过程中产生的一种光辐射现象，由于其灵敏度高，动态范围广，背景干扰小等，已经广泛应用于生物传感、疾病检测与环境化学等领域。作为典型的化学发光探针，基于草酸酯探针体系主要包含三种成分：双氧水、芳香草酸酯以及荧光染料。具体发光过程为：草酸酯在无水介质中被双氧水氧化产生不稳定的高能反应中间体，即1,2-二氧乙二酮。其分解后产生二氧化碳并释放光子，用于激发荧光染料产生相应光学信号。该过程产生的能量可以激发不同发射波长的荧光染料，并具备较高的能量转移效率。
3.然而，基于草酸酯的能量给体通常具有较差的水溶性，水相中强烈的介电屏蔽效应导致草酸酯发生聚集，并降低反应中间体的生成效率，难以实现高效化学发光能量转移。虽然近期研究者通过引入胶束与亲水基团修饰等方案，一定程度上缓解聚集效应，而其较差的发光稳定性与发光寿命仍不能满足分子水平的实时化学发光检测。此外，超氧自由基作为典型的生物体内活性氧，其在生物体内表达水平通常与诸多疾病密(如：急性肾损伤、急性肝损伤)密切相关。而目前基于超氧自由基触发的化学发光探针较低的检测限，进一步限制了其在活体层面的应用。因此，如何和建立具备稳定化学发光特性与能量转移效率的探针，实现超氧自由基触发的高灵敏疾病检测至关重要。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种化学发光纳米探针及其制备方法，使得所述化学发光纳米探针具有较强且稳定的化学发光性能，同时可实现超氧自由基的高灵敏度和高选择性检测；
5.本发明的另外一个目的在于提供上述化学发光纳米探针在制备检测超氧自由基相关疾病的产品中的应用。
6.为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述技术问题，本发明提供了为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述技术问题的方法，作为本发明的第一个方面，提供了一种化学发光纳米探针，包括作为内层的第一水相、作为中间层的油相和作为外层的第二水相，形成水包油包水乳液；
7.所述第一水相包括红色有机染料和聚乙烯醇，所述油相包括两亲性聚合物和基于草酸酯的化学发光能量给体，所述第二水相包括超氧化物歧化酶和聚乙烯醇。
8.可选地，所述第一水相中红色有机染料的浓度为0.01-10mg/ml；所述油相中两亲性聚合物的浓度为1-10mg/ml，基于草酸酯的化学发光能量给体的浓度为1-5mg/ml；所述第二水相超氧化物歧化酶的浓度为0.05-5mg/ml。
9.进一步可选地，所述红色有机染料包括二氢卟吩、罗丹明6g、罗丹明b中的一种或两种以上。
10.进一步可选地，所述两亲性聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯中的一种或两种以上。
11.进一步可选地，所述基于草酸酯的化学发光能量给体包括双草酸酯。
12.作为本发明的第二个方面，提供了所述的化学发光纳米探针在制备检测超氧自由基相关疾病的产品中的应用。
13.可选地，所述超氧自由基相关疾病包括肾损伤、脑损伤和肝损伤。
14.作为本发明的第三个方面，提供了所述化学发光纳米探针的制备方法，包括：
15.两亲性聚合物和基于草酸酯的化学发光能量给体混合后分散于有机溶剂中，获得油相；配制红色有机染料和聚乙烯醇的水溶液，获得第一水相；
16.将所述第一水相转移至油相中超声处理，获得第一乳液；
17.将所述第一乳液转移至聚乙烯醇水溶液中超声处理，获得第二乳液；
18.将所述第二乳液与超氧化物歧化酶溶液共孵育，形成最外层的第二水相，获得水包油包水结构的化学发光纳米探针乳液。
19.可选地，所述有机溶剂包括极性小于4的有机溶剂；进一步可选地，所述有机溶剂包括二氯甲烷和/或甲苯。
20.本发明利用基于草酸酯的化学发光能量给体，以及红色有机染料作为发光能量受体；利用亲水聚合物作为基质原料，通过水包油包水复乳法，制备得到化学发光纳米探针。所获得的化学发光纳米探针化学发光半衰期高达1000秒，对超氧自由基的检测限达到0.27微摩尔，可不受其他离子的干扰，表现出强且稳定的化学发光性能，可用于超氧自由基相关的疾病监测。
附图说明：
21.图1所示为本发明化学发光纳米探针的结构示意图；
22.图2所示为本发明化学发光纳米探针的电镜图片；
23.图3所示为本发明化学发光纳米探针的光谱表征；a为化学发光图谱；b为发光半衰期图谱；c为化学发光信号强度与梯度浓度超氧自由基的关联图谱；d为多种干扰离子共存下的化学发光信号强度图谱；
24.图4所示为本发明化学发光纳米探针在急性肾损伤小鼠模型中的化学发光活体成像(a)及其数据统计(b)结果。
具体实施方式：
25.本发明公开了一种化学发光纳米探针及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的化学发光纳米探针及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的化学发光纳米探针及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
26.在本发明的第一个方面中，提供了一种化学发光纳米探针，包括作为内层的第一水相、作为中间层的油相和作为外层的第二水相，形成水包油包水乳液；
27.所述第一水相包括红色有机染料和聚乙烯醇，所述油相包括两亲性聚合物和基于草酸酯的化学发光能量给体，所述第二水相包括超氧化物歧化酶和聚乙烯醇，结构示意图见图1。
28.本发明通过设计亲水聚合物空腔，分别将基于草酸酯的能量给体与发光能量受体(红色有机染料)置于油相与第一水相中，实现稳定的100-150纳米的水包油包水体系，同时在第二水相中引入超氧化物歧化酶作为催化剂，将超氧自由基还原为双氧水，而双氧水可进一步氧化草酸酯，所释放的光子通过能量转移激发红色有机染料释放光学信号。
29.在本发明某些实施方式中，所述第一水相中红色有机染料的浓度为0.01-10mg/ml，聚乙烯醇起乳化剂作用，其用量可根据实际需求进行调整，例如聚乙烯醇的浓度为1-45mg/ml；在本发明另外一些实施方式中所述第一水相中红色有机染料的浓度为0.04-8.33mg/ml，例如0.83mg/ml、1.30mg/ml、0.05mg/ml、0.32mg/ml、0.16mg/ml、0.45mg/ml等，聚乙烯醇的浓度为1.82-41.67mg/ml，例如8.33mg/ml、8.70mg/ml、9.77mg/ml、9.68mg/ml、9.09mg/ml等；
30.在本发明某些实施方式中，所述油相中两亲性聚合物的浓度为1-10mg/ml，例如2.5mg/ml、5mg/ml、3.33mg/ml、6.67mg/ml等，基于草酸酯的化学发光能量给体的浓度为1-5mg/ml，例如2.5mg/ml、3.33mg/ml、1.67mg/ml等；
31.在本发明某些实施方式中，所述第二水相超氧化物歧化酶的浓度为0.05-5mg/ml，聚乙烯醇起乳化剂作用，其用量可根据实际需求进行调整，聚乙烯醇的浓度为1-150mg/ml；在本发明另外一些实施方式中，所述第二水相总超氧化物歧化酶的浓度为0.1-2.5mg/ml，例如0.2mg/ml、0.33mg/ml、0.4mg/ml、0.83mg/ml、1.0mg/ml等，聚乙烯醇的浓度为50-100mg/ml，例如50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml等。
32.本发明曾针对包括聚乙烯醇在内的多种乳化剂进行测试，在所测试的各种乳化剂中目前只有聚乙烯醇可以成功实现水包油包水的乳液，并实现稳定光学发光特性。
33.在本发明某些实施方式中，所述红色有机染料包括二氢卟吩、罗丹明6g、罗丹明b中的一种或两种以上；所述两亲性聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯中的一种或两种以上；所述基于草酸酯的化学发光能量给体包括双草酸酯等。
34.在本发明另外一些实施方式中，化学发光纳米探针中所述油相包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物+双草酸酯，或包含聚氧乙烯聚氧丙烯+双草酸酯；所述第一水相包含二氢卟吩+聚乙烯醇，或包含罗丹明6g+聚乙烯醇。
35.在本发明的第二个方面中，在双氧水或超氧化钾(可用于产生超氧自由基)的作用下，本发明化学发光纳米探针在680纳米处获得化学发光信号，发光半衰期约为1000秒；化学发光信号强度与体系中超氧自由基的浓度(32.5-500微摩尔)正相关，可实现超氧自由基的灵敏检测(检测限：0.27微摩尔)。同时，该探针在不同干扰离子的存在下，仍能保持很好的选择性。此外，本发明建立顺铂诱导的急性肾损伤模型(超氧自由基为其标志物)，将所述探针通过尾静脉注射至活体内，通过连续成像，可实现急性肾损伤疾病的早期检测(12小时)。基于上述多种优异技术效果，本发明提出了所述的化学发光纳米探针在制备检测超氧自由基相关疾病的产品中的应用。
36.在本发明某些实施方式中，所述超氧自由基相关疾病包括急性肾损伤和急性肝损伤。
37.在本发明的第三个方面中，还提供了所述化学发光纳米探针的制备方法，包括：
38.两亲性聚合物和基于草酸酯的化学发光能量给体混合后分散于有机溶剂中，获得油相；配制红色有机染料和聚乙烯醇的水溶液，获得第一水相；
39.将所述第一水相转移至油相中超声处理，获得第一乳液；
40.将所述第一乳液转移至聚乙烯醇水溶液中超声处理，获得第二乳液；
41.将所述第二乳液与超氧化物歧化酶溶液共孵育，形成最外层的第二水相，获得水包油包水结构的化学发光纳米探针乳液。
42.在本发明某些实施方式中，所述有机溶剂包括二氯甲烷和甲苯；所述超声处理的时间为10-20分钟；所述共孵育为室温共孵育2-12小时。
43.在本发明的另外一些实施方式中，所述制备方法包括：
44.s1、将5-20毫克的两亲性聚合物(如：聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯等)和5-10毫克双草酸酯混合，分散在2-5毫升的有机溶剂(如：二氯甲烷、甲苯)中，震荡混合10-30分钟得到油相溶液；
45.将20-50微升的1-20毫克每毫升的红色有机染料(如：二氢卟吩、罗丹明6g、罗丹明b等)水溶液加入到100-500微升的质量浓度为1％的聚乙烯醇水溶液中，得到第一水相溶液；
46.s2、将s1中配好的第一水相溶液缓慢转移至油相溶液中，并在冰水浴条件下超声处理10-20分钟，获得第一乳液溶液；
47.s3、将s2中获得的第一乳液溶液，加入到2-5毫升质量浓度5-10％的聚乙烯醇溶液中，在冰水浴条件下超声处理10-20分钟后，得到第二乳液；
48.s4、将s3中反应完成的溶液搅拌过夜，与1-5毫克每毫升的超氧化物歧化酶共孵育1-2小时，形成外层的第二水相，得到水包油包水结构的化学发光纳米探针乳液。
49.如未特别说明，除了明确指出的区别外，具体实施例测试中各组的实验环境和参数条件保持一致。
50.下面就本发明提供的一种化学发光纳米探针及其制备方法和应用做进一步说明。
51.实施例1：制备本发明化学发光纳米探针
52.(1)将5毫克的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和5毫克的双草酸酯混合，分散在2毫升的二氯甲烷中，震荡混合均匀得到油相溶液；
53.(2)将20微升的5毫克每毫升的二氢卟吩水溶液加入到100微升的质量浓度为1％的聚乙烯醇水溶液中，得到水相溶液；
54.(3)将步骤(2)配好的水相溶液缓慢转移至步骤(1)配好的油相溶液中，并在冰水浴条件下超声处理15分钟，获得第一乳液溶液；
55.(4)将步骤(3)中获得第一乳液溶液，加入到3毫升质量浓度5％的聚乙烯醇溶液中，在冰水浴条件下超声处理15分钟后，得到第二乳液；
56.(5)将步骤(4)中反应完成的溶液搅拌过夜，与1ml、1毫克每毫升的超氧化物歧化酶共孵育后，得到目标产物。
57.实施例2：制备本发明化学发光纳米探针
58.(1)将10毫克的聚氧乙烯聚氧丙烯和5毫克的双草酸酯混合，分散在2毫升的二氯甲烷中，震荡混合均匀得到油相溶液；
59.(2)将30微升的10毫克每毫升的罗丹明b水溶液加入到200微升的质量浓度为1％的聚乙烯醇水溶液中，得到水相溶液；
60.(3)将步骤(2)配好的水相溶液缓慢转移至步骤(1)配好的油相溶液中，并在冰水浴条件下超声处理15分钟，获得第一乳液溶液；
61.(4)将步骤(3)中获得第一乳液溶液，加入到5毫升质量浓度5％的聚乙烯醇溶液中，在冰水浴条件下超声处理15分钟后，得到第二乳液；
62.(5)将步骤(4)中反应完成的溶液搅拌过夜，与0.5ml、2毫克每毫升的超氧化物歧化酶共孵育后，得到目标产物。
63.实施例3：制备本发明化学发光纳米探针
64.(1)将10毫克的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和10毫克的双草酸酯混合，分散在3毫升的二氯甲烷中，震荡混合均匀得到油相溶液；
65.(2)将5微升的2毫克每毫升的罗丹明6g水溶液加入到200微升的质量浓度的聚乙烯醇水溶液中，得到水相溶液；
66.(3)将步骤(2)配好的水相溶液缓慢转移至步骤(1)配好的油相溶液中，并在冰水浴条件下超声处理15分钟，获得第一乳液溶液；
67.(4)将步骤(3)中获得第一乳液溶液，加入到3毫升质量浓度5％的聚乙烯醇溶液中，在冰水浴条件下超声处理15分钟后，得到第二乳液；
68.(5)将步骤(4)中反应完成的溶液搅拌过夜，与0.5ml、5毫克每毫升的超氧化物歧化酶共孵育后，得到目标产物。
69.实施例4：制备本发明化学发光纳米探针
70.(1)将10毫克的聚氧乙烯聚氧丙烯和10毫克的双草酸酯混合，分散在3毫升的甲苯中，震荡混合均匀得到油相溶液；
71.(2)将10微升的10毫克每毫升的罗丹明6g水溶液加入到300微升的质量浓度的聚乙烯醇水溶液中，得到水相溶液；
72.(3)将步骤(2)配好的水相溶液缓慢转移至步骤(1)配好的油相溶液中，并在冰水浴条件下超声处理15分钟，获得第一乳液溶液；
73.(4)将步骤(3)中获得第一乳液溶液，加入到5毫升质量浓度5％的聚乙烯醇溶液中，在冰水浴条件下超声处理15分钟后，得到第二乳液；
74.(5)将步骤(4)中反应完成的溶液搅拌过夜，与1ml、5毫克每毫升的超氧化物歧化酶共孵育后，得到目标产物。
75.实施例5：制备本发明化学发光纳米探针
76.(1)将20毫克的聚乳酸-羟基乙酸共聚物和10毫克的双草酸酯混合，分散在3毫升的甲苯中，震荡混合均匀得到油相溶液；
77.(2)将10微升的5毫克每毫升的二氢卟吩水溶液加入到300微升的质量浓度的聚乙烯醇水溶液中，得到水相溶液；
78.(3)将步骤(2)配好的水相溶液缓慢转移至步骤(1)配好的油相溶液中，并在冰水浴条件下超声处理15分钟，获得第一乳液溶液；
79.(4)将步骤(3)中获得第一乳液溶液，加入到5毫升质量浓度5％的聚乙烯醇溶液中，在冰水浴条件下超声处理15分钟后，得到第二乳液；
80.(5)将步骤(4)中反应完成的溶液搅拌过夜，与0.5ml、4毫克每毫升的超氧化物歧化酶共孵育后，得到目标产物。
81.实施例6：制备本发明化学发光纳米探针
82.(1)将10毫克的聚氧乙烯聚氧丙烯和5毫克的双草酸酯混合，分散在3毫升的二氯甲烷中，震荡混合均匀得到油相溶液；
83.(2)将30微升的5毫克每毫升的二氢卟吩水溶液加入到300微升的质量浓度的聚乙烯醇水溶液中，得到水相溶液；
84.(3)将步骤(2)配好的水相溶液缓慢转移至步骤(1)配好的油相溶液中，并在冰水浴条件下超声处理15分钟，获得第一乳液溶液；
85.(4)将步骤(3)中获得第一乳液溶液，加入到10毫升质量浓度5％的聚乙烯醇溶液中，在冰水浴条件下超声处理15分钟后，得到第二乳液；
86.(5)将步骤(4)中反应完成的溶液搅拌过夜，与0.8ml、5毫克每毫升的超氧化物歧化酶共孵育后，得到目标产物。
87.实验例：化学发光纳米探针的表征实验
88.以实施例1制备的化学发光纳米探针进行分析，其他实施例结果与实施例1类似；
89.1、形貌表征：将化学发光纳米探针制备于碳膜铜网，利用200kv场发射透射电镜进行表征。
90.由透射电镜图得知制备得到的化学发光纳米探针具有较好的分散性，直径约为100-150纳米(图2)；
91.2、光学表征：
92.将一定浓度双氧水或超氧化钾与化学发光纳米探针充分混合，并测试混合体系的荧光光谱与荧光强度与时间相关曲线。通过控制双氧水或超氧化钾的浓度，考察其对化学发光纳米探针发光强度的影响。
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42-,(8)clo-作为干扰离子，评价化学发光纳米探针的检测选择性。
94.由化学发光图谱(图3-a)可以看出制备得到的化学发光纳米探针在双氧水或超氧化钾(可用于产生超氧自由基)的作用下，在680纳米处获得化学发光信号。该化学发光纳米探针的发光半衰期约为1000秒(图3-b)。化学发光信号强度与体系中超氧自由基的浓度(32.5-500微摩尔)正相关，可实现超氧自由基的灵敏检测(检测限：～0.27微摩尔)(图3-c)。此外，该探针在不同干扰离子的存在下(相同浓度)，仍能保持很好的选择性(仅双氧水与超氧自由基可触发显著化学发光)(图3-d)。
95.此外，本发明还尝试采用其他一些原料替换本发明所选择的物料按照实施例1方法进行探针的制备，比如两亲性聚合物采用甲氧基-聚乙二醇-聚己内酯、聚丙烯酰胺、聚乳酸-聚乙二醇等，荧光染料采用荧光素钠、香豆素、1,8萘二甲酰亚胺等，但这些探针的化学发光图谱均无法实现稳定光学发光特性。3、动物模型实验
96.建立基于小鼠活体层面的药物诱导急性肾损伤模型。在药物(顺铂)处理不同时间(8-72小时)后，通过尾静脉将所得探针注射至小鼠体内，并利用小动物成像设备进行连续
(0-90分钟)地化学发光活体成像。结果显示，在药物处理小鼠12小时后，肾脏部位展现出显著光学特性(图4)。说明该探针具备实现超氧自由基相关的疾病早期检测的能力。
97.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种化学发光纳米探针，其特征在于，包括作为内层的第一水相、作为中间层的油相和作为外层的第二水相，形成水包油包水乳液；所述第一水相包括红色有机染料和聚乙烯醇，所述油相包括两亲性聚合物和基于草酸酯的化学发光能量给体，所述第二水相包括超氧化物歧化酶和聚乙烯醇。2.根据权利要求1所述的化学发光纳米探针，其特征在于，所述第一水相中红色有机染料的浓度为0.01-10mg/ml；所述油相中两亲性聚合物的浓度为1-10mg/ml，基于草酸酯的化学发光能量给体的浓度为1-5mg/ml；所述第二水相超氧化物歧化酶的浓度为0.05-5mg/ml。3.根据权利要求1或2所述的化学发光纳米探针，其特征在于，所述红色有机染料包括二氢卟吩、罗丹明6g、罗丹明b中的一种或两种以上。4.根据权利要求1或2所述的化学发光纳米探针，其特征在于，所述两亲性聚合物包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯中的一种或两种以上。5.根据权利要求1或2所述的化学发光纳米探针，其特征在于，所述基于草酸酯的化学发光能量给体包括双草酸酯。6.权利要求1-5任意一项所述的化学发光纳米探针在制备检测超氧自由基相关疾病的产品中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述超氧自由基相关疾病包括肾损伤、脑损伤和肝损伤。8.权利要求1所述化学发光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括：两亲性聚合物和基于草酸酯的化学发光能量给体混合后分散于有机溶剂中，获得油相；配制红色有机染料和聚乙烯醇的水溶液，获得第一水相；将所述第一水相转移至油相中超声处理，获得第一乳液；将所述第一乳液转移至聚乙烯醇水溶液中超声处理，获得第二乳液；将所述第二乳液与超氧化物歧化酶溶液共孵育，形成最外层的第二水相，获得水包油包水结构的化学发光纳米探针乳液。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括极性小于4的有机溶剂。10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括二氯甲烷和/或甲苯。

技术总结
本发明涉及生物检测领域，公开一种化学发光纳米探针及其制备方法和应用。本发明利用基于草酸酯的化学发光能量给体，以及红色有机染料作为发光能量受体；利用亲水聚合物作为基质原料，通过水包油包水复乳法，制备得到化学发光纳米探针。所获得的化学发光纳米探针化学发光半衰期高达1000秒，对超氧自由基的检测限达到0.27微摩尔，可不受其他离子的干扰，表现出强且稳定的化学发光性能，可用于超氧自由基相关的疾病监测。关的疾病监测。


技术研发人员：何耀 宋斌 吴梦林
受保护的技术使用者：苏州大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/21