人重组三叶因子TFF2-Fc在治疗炎症性肠病中的应用

人重组三叶因子tff2-fc在治疗炎症性肠病中的应用
一、技术领域
1.本发明是涉及一种新型的人重组三叶因子tff2-fc在修复损伤的胃肠道黏膜，治疗炎症性肠病方面的应用，属于生物药领域。
二、

背景技术：

2.炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)和克罗恩病(crohn’s disease，cd)。溃疡性肠炎主要发生在结肠处，伴有腹痛、直肠出血和腹泻等症状，是一种肠道弥散的炎症病变。克罗恩病多发生于多发于末端回肠和右半结肠，呈跳跃式或节段式病变，伴有腹痛、腹泻、腹部包块、瘘管形成等症状。炎症性肠病具有发病周期长、易癌变、治疗难度大等特点，发病机制尚不完全清楚，临床上缺乏特效的治疗药物。大量研究表明，肠道黏膜损伤和免疫系统平衡受损有助于炎症性肠病的发生和发展，特别是黏膜免疫系统的失衡将导致促炎细胞因子的持续产生，进而导致慢性炎症、溃疡和结肠黏膜病变。因此，提高炎症性肠病患者自身损伤黏膜的修复能力，减少炎症因子的产生，对控制炎症性肠病具有重要意义。
3.trefoil factor 2(tff2)是三叶因子家族的成员，在正常生理状态下，tff2由黏膜杯状细胞分泌，能够维持胃肠道黏膜的稳定性。在胃肠道黏膜损伤后，溃疡伴随细胞系成为分泌tff2的重要部位。tff2不仅能与粘蛋白和损伤区域的细胞碎片形成“粘液帽”，覆盖损伤区域，避免损伤区域的进一步扩展，还可以作为刺激因子，促进损伤区域邻近细胞的迁移，进而促进损伤黏膜的修复。然而，tff2(静脉注射)在小鼠体内的半衰期约为48min，可快速离开小鼠体循环，这限制了tff2作为药物的应用。tff2-fc融合蛋白是将免疫球蛋白的可结晶段(fc)与tff2融合的产物，可改善tff2在体内的半衰期，还具有易于工业化生产、表达量大且稳定的特点。本发明系统的研究了tff2-fc融合蛋白在治疗葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的小鼠实验性结肠炎，修复损伤的胃肠道黏膜和抑制炎症方面的应用。
4.本发明以前并没有tff2-fc在治疗炎症性肠病，修复胃肠道损伤黏膜和抑制炎症方面的应用，tff2-fc易于工业化生产且稳定，是一种非常有前途的治疗炎症性肠病的药物。
三、

技术实现要素：

5.本发明目的之一是证明tff2-fc在体内能治疗dss诱导的小鼠实验性结肠炎。
6.本发明的目的之二是证明了tff2-fc在体外能促进胃肠道损伤黏膜的修复及其作用机制。
7.本发明的目的之三是证明了tff2-fc的体外抗炎作用。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
9.采用dss诱导小鼠实验性结肠炎，检测tff2-fc对dss诱导的小鼠体重减轻、便血、结肠缩短和疾病活动指数增加的影响。
10.采用srb法和流式细胞术，检测tff2-fc对h2o2和lps-raw264.7/cm诱导的人结肠腺
癌细胞(caco2)损伤和凋亡的逆转作用。
11.采用平板划痕术，检测tff2-fc对h2o2和lps-raw264.7/cm抑制的caco2细胞迁移的影响。
12.采用western blot技术，检测tff2-fc对h2o2和lps-raw264.7/cm诱导的caco2细胞中p-erk和紧密连接蛋白的影响。
13.采用elisa和griess法，检测tff2-fc对脂多糖(lps)诱导的raw264.7细胞中肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素6(il-6)和一氧化氮(no)的影响。
14.采用流式细胞术，检测tff2-fc对lps诱导的raw264.7细胞中活性氧(ros)的影响。
15.与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：临床上尚没有通过修复损伤的胃肠道黏膜来治疗炎症性肠病的药物，目前使用的传统化学药物和生物制剂多是通过减轻炎症反应来达到治疗结肠炎的目的。传统化学药物包括氨基水杨酸类、糖皮质激素类和固醇类药物，这些药物可以缓解炎症性肠病，但不能改变其病程，也不能彻底治愈炎症性肠病。生物疗法主要包括tnf-α抑制剂英夫利昔单抗和整合素拮抗剂维多利珠单抗等，可以有效改善炎症性肠病的病程，提高患者的生活质量。然而，有三分之二的患者在治疗前和治疗过程中对英夫利昔单抗失去反应，且长期服用英夫利昔单抗还可能增加患恶性肿瘤的风险。因此，开发治疗炎症性肠病的新药迫在眉睫。tff2-fc作为新型的生物制剂，能通过激活趋化因子受体4(cxcr4)，刺激p-erk的表达，进而促进损伤区域临近细胞的迁移和增殖，抑制细胞凋亡，产生修复损伤黏膜和抑制炎症的作用。tff2-fc弥补了传统药物治标不治本和其他生物制剂副作用强且对部分患者无效的缺陷。本发明首次证明了tff2-fc具有缓解dss诱导的小鼠结肠炎，修复损伤肠粘膜和抑制炎症的作用，并阐明了其保护肠上皮细胞免受氧化损伤和炎症损伤的作用机制。
16.tff2-fc能缓解结肠炎小鼠的体重减轻、结肠缩短、便血和疾病活动指数增加等症状，减轻氧化损伤和炎症损伤导致的肠上皮细胞的损伤、凋亡、迁移抑制及紧密连接蛋白表达的下降，进而发挥保护和修复损伤胃肠道黏膜的作用。同时，tff2-fc还能够减轻炎症细胞中tnf-α、il-6、no和ros等炎症因子的产生，抑制炎症反应。本专利说明tff2-fc具有良好治疗小鼠炎症性肠病、修复胃肠道损伤黏膜和抗炎作用，具有广泛的应用前景。
四、附图说明
17.图1表明本发明中tff2-fc能缓解dss诱导的c57bl/6小鼠的结肠炎症。
18.图2表明本发明中tff2-fc能逆转h2o2和lps-raw264.7/cm诱导的caco2细胞损伤。
19.图3表明本发明中tff2-fc能逆转h2o2和lps-raw264.7/cm诱导的caco2细胞凋亡。
20.图4表明本发明中tff2-fc能促进caco2细胞迁移并能促进h2o2和lps-raw264.7/cm抑制的caco2细胞迁移。
21.图5表明本发明中tff2-fc能促进h2o2抑制的caco2细胞中p-erk和紧密连接蛋白的表达。
22.图6表明本发明中tff2-fc能调节lps-raw264.7/cm影响的caco2细胞中p-erk和紧密连接蛋白的表达。
23.图7表明本发明中tff2-fc能抑制lps诱导的raw264.7细胞中tnf-α、il-6、no和ros的产生。
五、具体实施方式
24.下面结合附图和试验例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
25.试验例1
26.探究了tff2-fc对dss诱导的小鼠实验性结肠炎的治疗作用。
27.实验方法：雄性spf级c57bl/6小鼠(19-22g，6周龄，购自北京维通利华实验动物公司)被饲养在25
±
2℃的恒温条件下，保持12h的光暗循环，自由饮用食物和水。动物实验是按照中国海洋大学动物保护与利用专业委员会的伦理指导方针进行的。将28只小鼠随机分为4组：对照组、dss组(apexbio technology公司，美国)、阳性对照柳氮磺胺吡啶组(sasp，medchemexpress公司，美国)、tff2-fc组。除对照组以外，其余组小鼠自由饮用含2.5％dss(w/v)的无菌饮用水，诱导实验性结肠炎。从造模当天开始直肠内给予sasp(50mg/kg)或tff2-fc(5mg/kg)，直到第9天被处死。每天检测小鼠体重和粪便出血等情况。
28.实验结果图1表明，从第2天开始，dss模型组疾病活动指数(dai)较对照组明显升高。然而，与模型组相比，sasp治疗组dai评分显著降低，tff2-fc在第4天时显著降低了dss升高的dai评分(图1b)。与模型组相比，tff2-fc和sasp治疗显著减弱了小鼠实验性结肠炎疾病进展过程中的体重减轻(图1c)。与体重减轻一致，在tff2-fc治疗组中，dss引起的腹泻得到恢复，sasp组腹泻症状也得到缓解(图1d)。结肠长度变化如图1e和f所示，tff2-fc和sasp处理显著抑制了dss导致的结肠缩短。这些结果表明，tff2-fc可以缓解dss诱导的小鼠实验性结肠炎。
29.表1dai评分标准
[0030][0031]
试验例2
[0032]
探究了tff2-fc对h2o2和lps-raw264.7/cm诱导的caco2细胞损伤的逆转作用。
[0033]
1.细胞培养：将人结肠腺癌细胞(caco2)(购自中国科学院上海细胞库)在含有10％胎牛血清(gibco公司，美国)和1％青霉素-链霉素(gibco公司，美国)的rpmi-1640培养基(gibco公司，美国)中培养，将小鼠单核巨噬细胞(raw264.7)(购自中国科学院上海细胞库)在含有10％胎牛血清的dmem培养基(gibco公司，美国)中培养，两种细胞均放置于37℃和5％co2的培养箱中。
[0034]
2.lps-raw264.7/cm的制备：取处于对数生长期的raw264.7细胞，按3
×
105的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，加入lps(1μg/ml)作用24h，培养结束后，收集上层培养基，1200rpm离心5min后，取上清液作为lps-raw264.7/cm。
[0035]
3.细胞活力检测(srb法)：取处在对数生长期的caco2细胞以3000个细胞/孔的密度接种到96孔板中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的tff2-fc作用24h。在h2o2造模组中，细胞贴壁后，tff2-fc组和实验组加入tff2-fc(25-400μg/ml)，对照组和h2o2模型组加入等体积
无菌水，培养24h后，h2o2模型组和实验组加入h2o2(500μm)，对照组和实验组加入等体积无菌水，继续培养3h。在lps-raw264.7/cm造模组中，待细胞贴壁后，tff2-fc组和实验组加入tff2-fc(25-400μg/ml)，对照组和lps-raw264.7/cm模型组加入等体积无菌水，培养箱中预孵育2h后，将lps-raw264.7/cm模型组的培养基换为lps-raw264.7/cm，实验组的培养基换为含不同浓度tff2-fc的lps-raw264.7/cm，继续培养24h。药物作用结束后，弃去上层培养基，每孔加入100μl 10％的tca固定细胞，置于4℃冰箱中固定1h以上。弃去固定液，并用自来水冲洗96孔板5-6次，置于37℃烘箱烘干。随后每孔加入100μl srb染料(上海索莱宝生物科技有限公司)，在室温下避光染色15min，用1％冰醋酸洗去染色液，置于37℃烘箱烘干。随后每孔加入150μl tris-hcl(10mm)溶液，于37℃烘箱中孵育10min至结晶溶解，用酶标仪检测515nm处的吸光值(od)。按照公式：细胞活力％＝实验组od/溶剂对照组od
×
100％，计算caco2细胞的细胞活力。
[0036]
实验结果图2a表明，tff2-fc能轻微促进caco2细胞增殖。在h2o2造模组中(图2b)，与对照组相比，h2o2明显抑制了caco2细胞增殖，细胞活力下降至70.66％，而tff2-fc在浓度为25-400μg/ml时，明显促进了caco2细胞增殖，细胞活力分别上升至77.47、89.16、97.19、91.60和82.06％。与h2o2模型组一致，图2c表明lps-raw264.7/cm处理后caco2细胞活力下降至75.64％，tff2-fc能有效缓解lps-raw264.7/cm造成的caco2细胞损伤，提升了caco2细胞活力。图2结果说明tff2-fc预处理能有效逆转氧化损伤和炎症损伤导致的caco2细胞损伤，证明了tff2-fc在体外具有促进结肠上皮细胞损伤修复的作用。
[0037]
试验例3
[0038]
探究了tff2-fc对h2o2和lps-raw264.7/cm诱导的caco2细胞凋亡的影响。
[0039]
实验方法流式细胞术：取对数生长期的caco2细胞进行计数，按2
×
105个细胞/孔的密度接种至6孔板中。对于h2o2造模组，待细胞贴壁后，实验组中加入tff2-fc(50-200μg/ml)，对照组和h2o2组加入等体积无菌水，置于co2培养箱中培养24h，培养结束后，h2o2组和实验组中加入h2o2(500μm)，对照组加入等体积的无菌水，继续培养3h。对于lps-raw264.7/cm组，细胞贴壁后，实验组加入tff2-fc(50-200μg/ml)，对照组加入等体积的无菌水预处理2h后，lps-raw264.7/cm模型组将原有培养基换为lps-raw264.7/cm，实验组将原有培养基换为含有不同浓度tff2-fc的lps-raw264.7/cm，继续培养24h。培养结束后，去除原有培养基，用pbs洗涤后加入胰酶消化细胞，收集单细胞悬液，在4℃冷冻离心机中1200rpm离心5min，弃掉培养基，加入预冷的pbs洗2遍。最后在室温下加入凋亡试剂盒染液(microwell，美国)避光染色20min，随后在流式细胞仪上进行检测。
[0040]
根据图3实验结果发现，与对照组相比，h2o2(图3a)和lps-raw264.7/cm(图3b)的处理导致caco2细胞凋亡的比例明显增加，凋亡细胞占比为36.82％和25.82％，而tff2-fc的预处理能逆转由h2o2和lps-raw264.7/cm诱导的细胞凋亡。与h2o2模型组相比，随着tff2-fc浓度的升高，处于晚期凋亡的caco2细胞比例由24.38％下降为15.70％，而处于早期凋亡的caco2细胞比例由12.44％下降为4.23％，坏死的caco2细胞比例在5.97％-7.36％之间，没有明显变化。与lps-raw264.7/cm模型组相比，随着tff2-fc浓度的升高，处于晚期凋亡的caco2细胞比例由14.28％下降为4.36％，而处于早期凋亡的caco2细胞比例由11.54％下降为6.05％。以上结果表明，tff2-fc能够逆转h2o2和lps-raw264.7/cm诱导caco2细胞凋亡，抑制肠上皮细胞的损伤。
[0041]
试验例4
[0042]
探究了不同浓度的tff2-fc对caco2细胞迁移的影响。
[0043]
实验方法平板划痕法：取对数生长期caco2细胞，每孔1
×
104个细胞接种于96孔板中，置于37℃，co2浓度为5％的培养箱中培养。待细胞达到90％融合后，用10μl枪头垂直板底在每孔中央划线，然后去除原有培养基后，用pbs清洗细胞，再加入含1％fbs的培养基，并用倒置生物显微镜进行0h拍照(4
×
)。之后实验组加入不同浓度tff2-fc，对照组加入等体积无菌水，置于培养箱中培养48h后拍照。接下来用image j软件处理图片并计算划痕愈合率。对于h2o2造模组，细胞划痕并进行0h拍照后，实验组加入不同浓度tff2-fc预处理2h，h2o2模型组和实验组加入h2o2(10μm)，对照组加入等体积无菌水，置于培养箱中继续培养24h。对于lps-raw264.7/cm造模组，细胞划痕并进行0h拍照后，实验组加入不同浓度tff2-fc预处理2h，lps-raw264.7/cm模型组的培养基换为lps-raw264.7/cm，实验组的培养基换为含有不同浓度tff2-fc的lps-raw264.7/cm，对照组加入等体积无菌水，置于培养箱中继续培养24h。培养结束后，用倒置显微镜进行拍照，并用image j软件处理图片，计算划痕愈合率。
[0044]
根据图4a和d实验结果发现，与对照组划痕愈合率(39.99％)相比，在加入tff2-fc(100-400μg/ml)后，能明显促进caco2细胞伤口愈合，伤口愈合率分别为51.03、64.26和51.96％。图4b和e结果发现，与对照组伤口愈合率(22.48％)相比，h2o2组caco2细胞迁移明显受到抑制，伤口愈合率为8.7％，而tff2-fc(100-400μg/ml)预处理能显著缓解h2o2抑制的caco2细胞伤口愈合，伤口愈合率分别增加至12.41、14.34和16.79％。图4c和f结果发现，与对照组划痕愈合率相比，lps-raw264.7/cm组caco2细胞迁移明显受到抑制，而tff2-fc预处理能显著缓解lps-raw264.7/cm抑制的caco2细胞迁移。以上实验结果说明，tff2-fc能促进肠上皮细胞的伤口愈合，进而促进肠道损伤黏膜的修复。
[0045]
试验例5
[0046]
探究了tff2-fc对h2o2和lps-raw264.7/cm诱导的caco2细胞中p-erk和紧密连接蛋白的影响。
[0047]
实验方法western blot法：将处在对数生长期的caco2细胞接种在6孔板中(1
×
105个细胞/孔)。对于h2o2造模组，待细胞贴壁后，tff2-fc组和实验组加入不同浓度的tff2-fc，对照组和h2o2模型组加入等体积的无菌水，置于37℃，含5％co2的细胞培养箱中培养24h，培养结束后，实验组和模型组加入h2o2(500μm或60μm)继续作用3h。对于lps-raw264.7/cm造模组，tff2-fc组和实验组加入不同浓度的tff2-fc预处理2h后，lps-raw264.7/cm模型组将原有培养基换为lps-raw264.7/cm，实验组将原有培养基换为含不同浓度tff2-fc的lps-raw264.7/cm，置于37℃，含5％co2的细胞培养箱中培养24h。培养结束后，去除上层培养基，用pbs洗涤2次后，加入100μl loading buffer在4℃裂解30min。裂解完成后，收集样品，并在100℃金属浴下煮沸10min，然后将样品保存在-20℃的冰箱中。在6-12％sds-page胶上通过电泳分离蛋白质样品，并转移到nc膜上。切割目标条带后，将nc膜用5％脱脂牛奶封闭1h以上，并在4℃下与所需的一抗孵育过夜。将nc膜与二抗在室温下孵育1h，用tbst洗去未结合的二抗，并通过显影仪进行化学发光检测。
[0048]
根据图5a，b和c发现，与对照组相比，h2o2单独作用后，caco2细胞中p-erk和紧密连接蛋白水平明显降低，而tff2-fc的存在能明显上调被抑制的p-erk和紧密连接蛋白的表
达。图6a发现，lps-raw264.7/cm处理后，p-erk的表达水平升高，这可能是由于lps-raw264.7/cm中炎症因子刺激了mapk信号通路，促进p-erk的表达，tff2-fc进一步促进了erk的磷酸化。与h2o2组相似，lps-raw264.7/cm处理降低了紧密连接蛋白的表达，tff2-fc能逆转lps-raw264.7/cm抑制的紧密连接蛋白的表达(图6b和c)。以上结果表明，tff2-fc能抑制氧化损伤和炎症损伤抑制的紧密连接蛋白的表达，这些作用可能是通过促进erk磷酸化发挥的。
[0049]
试验例6
[0050]
探究了tff2-fc对lps诱导的raw264.7细胞中tnf-α、il-6、no和ros产生的影响。
[0051]
实验方法elisa法和griess法：将处于对数生长期的raw264.7细胞接种于6孔板(3
×
105个细胞/孔)，待细胞贴壁后，加入不同浓度的tff2-fc(50-200μg/ml)预处理2h，然后加入lps(100ng/ml)培养raw264.7细胞24h，培养结束后，收集上清液，1200rpm离心5min。按照说明书(达科为，北京，中国)检测上清液中tnf-α、il-6和no的水平。
[0052]
实验方法流式细胞术：将处于对数生长期的raw264.7细胞接种于6孔板(3
×
105个细胞/孔)，待细胞贴壁后，加入tff2-fc(50-200μg/ml)预处理2h，然后加入lps(100ng/ml)处理24h。收集细胞，用dcfh-da(10μm，碧云天，上海，中国)在37℃下染色20min。用无血清培养基洗涤3次后，通过cytoflex(beckman coulter，苏州，中国)分析荧光信号。
[0053]
根据图7a结果显示，浓度为50-800μg/ml的tff2-fc不影响raw264.7细胞活力。与对照组相比，lps单独作用于raw264.7细胞后，tnf-α(图7b)、il-6(图7c)和no(图7d)的分泌明显增加，而tff2-fc预处理能显著降低lps诱导的炎症因子和no的表达。同时，lps处理后，raw264.7细胞中ros(图7e和f)的产生明显增加，tff2-fc预处理降低了ros的生成。以上结果表明，tff2-fc能通过减少炎症因子、no和ros的产生，减轻lps诱导的raw264.7细胞炎症。

技术特征：
1.根据权利要求1所述的修复损伤胃肠道黏膜，治疗炎症性肠病的作用，其特征在于：所述的人重组三叶因子tff2-fc可以缓解葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的小鼠炎症性肠病。2.根据权利要求1所述的修复损伤胃肠道黏膜，治疗炎症性肠病的作用，其特征在于：所述的人重组三叶因子tff2-fc可以逆转氧化损伤和炎症损伤诱导的结肠腺癌细胞(caco2)的损伤和凋亡。3.根据权利要求1所述的修复损伤胃肠道黏膜，治疗炎症性肠病的作用，其特征在于：所述的人重组三叶因子tff2-fc可以促进氧化损伤和炎症损伤抑制的caco2细胞的迁移。4.根据权利要求1所述的修复损伤胃肠道黏膜，治疗炎症性肠病的作用，其特征在于：所述的人重组三叶因子tff2-fc可以促进氧化损伤抑制的caco2细胞中p-erk和紧密连接蛋白的表达。5.根据权利要求1所述的修复损伤胃肠道黏膜，治疗炎症性肠病的作用，其特征在于：所述的人重组三叶因子tff2-fc可以影响炎症损伤调节的caco2细胞中p-erk和紧密连接蛋白的表达。6.根据权利要求1所述的修复损伤胃肠道黏膜，治疗炎症性肠病的作用，其特征在于：所述的人重组三叶因子tff2-fc可以抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞(raw264.7)中炎症因子、一氧化氮和活性氧的产生。7.根据权利要求2所述的tff2-fc能治疗炎症性肠病的作用，其特征在于：所述的人重组三叶因子tff2-fc与包括氨基水杨酸类、糖皮质激素类和固醇类药物在内的传统化学药物联合使用，能有效缓解炎症性肠病的病理特征。8.根据权利要求3所述的tff2-fc能治疗炎症性肠病的作用，其特征在于：所述的人重组三叶因子tff2-fc与生物制剂，包括tnf-α抑制剂英夫利昔单抗和整合素拮抗剂维多利珠单抗联合使用，能有效缓解炎症性肠病的病理特征，改变炎症性肠病病程。

技术总结
本发明公开了一种人重组三叶因子TFF2-Fc在治疗炎症性肠病，修复损伤的胃肠道黏膜和抗炎方面的应用，属于生物药领域。本发明经试验证实，TFF2-Fc能增加结肠炎小鼠体重，改善结肠炎小鼠腹泻、便血情况，维持小鼠结肠长度。TFF2-Fc通过调节P-ERK的表达，缓解氧化损伤和炎症损伤诱导的Caco2细胞损伤、凋亡、迁移抑制及紧密连接蛋白表达的下降。此外，TFF2-Fc能有效减少脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞中炎症因子、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的产生，具有一定的抗炎作用。以上结果说明TFF2-Fc具有治疗小鼠炎症性肠病，修复胃肠道损伤黏膜和抑制巨噬细胞炎症的作用，是一种非常有前途的治疗炎症性肠病的药物。炎症性肠病的药物。炎症性肠病的药物。


技术研发人员：刘明 郭梦 李振 耿佳佳
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2023.02.21
技术公布日：2023/8/24